Use of recombinant P1 protein of Mycoplasma pneumoniae for the serodiagnosis of mycoplasmosis

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: 229-237 Zastosowanie metody inżynierii genetycznej do uzyskania białka P1 Mycoplasma pneumoniae oraz ocena jego przydatności w serodiagnostyce mykoplazmozy u ludzi Use of recombinant P1 protein of Mycoplasma pneumoniae for the serodiagnosis of mycoplasmosis W. Rastawicki, N. Rokosz, R. Gierczyński, M. Jagielski Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Metodami inżynierii genetycznej uzyskano preparat białka P1 M. pneumoniae oraz oceniono jego przydatność w serodiagnostyce mykoplazmozy u ludzi. Wyniki oznaczeń metodą ELISA poziomu mykoplazmowych przeciwciał przy użyciu tego białka porównano z wynikami oznaczeń uzyskanymi w odczynie wiązania dopełniacza oraz w komercyjnym teście western-immunoblotting firmy Virotech. Przeprowadzone badania wykazały, że zastosowana metoda pozwoliła uzyskać wysoce oczyszczone białko, które może być z powodzeniem wykorzystane jako swoisty antygen w odczynach serologicznych prowadzonych w kierunku zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae. Słowa kluczowe: Mycoplasma pneumoniae, białko P1, serodiagnostyka mykoplazmozy ABSTRACT Introduction. Mycoplasma pneumoniae is a common etiologic agent of community-acquired respiratory infection. In serological diagnosis of M. pneumoniae infections tests have been described based on the purified P1 protein, which is the most important virulence factor of this pathogen, as antigen. The aim of his study was to express and purify a recombinant protein P1 M. pneumoniae and next evaluate this protein as high specific antigen in serodiagnosis of mycoplasmosis. Methods. Protein P1 M. pneumoniae was expressing in E. coli BL21 (DE3) using the pet-30 Ek/LIC expression vector. Based on published literature, we decided to express C-terminal region [P1-C1] encompassing amino acid residues 1160 to 1521. Purification was accomplished by immobilized metal (Ni2+) affinity column chromatography (His-trap). Serum samples collected from 221 patients with mycoplasmosis, positive in complement

230 W. Rastawicki i inni Nr 3 fixation test (CFT), 87 patients with other then mycoplasmosis bacterial infections and 80 blood donors were screened for anti-p1 recombinant protein IgA, IgG and IgM antibodies by using the home-made ELISA. Results. SDS-PAGE and Coomassie brilliant blue staining confirmed a high purity of the recombinant P1 protein preparation with an expected molecular mass of 39,7 kda. The specificity of the recombinant protein was confirmed by western blot analysis using serum samples from rabbits immunized by M. pneumoniae. The results of ELISA revealed that more then 70.0% of patients with mycoplasmosis confirmed by CFT, had antibodies to recombinant P1 protein in diagnostically significant level (x+2sd). The antibodies were found only sporadically in sera obtained from patients with other then mycoplasmosis bacterial infections and clinically healthy persons. A comparison of results obtained in home-made ELISA with results of commercial western blot (Virotech) showed similar, ranged from 84.2% to 97.4%, compatible of results. The IgM antibodies to recombinant P1 protein were found in 87.2% sera obtained in acute phase of disease, in 80.0% sera obtained 2-4 weeks after onset of clinical symptoms and only in 43.8% sera obtained in chronic mycoplasmosis. Conclusions. The present study confirmed the earlier observations of the high usefulness of recombinant P1 protein for reliable serologic diagnosis of M. pneumoniae infection. Key words: Mycoplasma pneumoniae, protein P1, serodiagnosis of mycoplasmosis WSTĘP Aktualnie w serologicznej diagnostyce wielu chorób zakaźnych coraz częściej wykorzystuje się antygeny uzyskane metodami inżynierii genetycznej. Takie antygeny można precyzyjnie zaprojektować a otrzymany produkt charakteryzuje się wyższą swoistością i stopniem oczyszczenia w porównaniu do antygenów uzyskiwanych w sposób konwencjonalny. Posługiwanie się wysoce swoistym antygenem w badaniach serologicznych jest szczególnie istotne w przypadku diagnostyki zakażeń wywoływanych przez drobnoustroje wykazujące podobieństwo budowy antygenowej do innych patogenów bakteryjnych czy różnych struktur organizmu człowieka. Taka sytuacja występuje między innymi w przypadku zakażeń wywoływanych przez M. pneumoniae. Glikolipidy tego drobnoustroju wykazują pokrewieństwo z lipidami wyekstrahowanymi z różnych tkanek człowieka, z komórek paciorkowca MG, z błony komórkowej M. genitalium, a nawet liści szpinaku (2, 3, 4, 6, 10). Bardziej swoisty jest komponent białkowy komórki M. pneumoniae, który składa się z szeregu białek o zróżnicowanej masie cząsteczkowej, odpowiedzialnych nie tylko za antygenową aktywność tego drobnoustroju ale także za przyleganie drobnoustrojów do komórek nabłonka układu oddechowego człowieka. Niewątpliwie najlepiej poznaną adhezyną M. pneumoniae jest białko o masie 160-180 kda, oznaczone symbolem P1. Jak wykazały uprzednio przeprowadzone badania odczynem western-immunoblotting, białko P1 jest silnie immunogennym oraz wysoce swoistym antygenem, który można wykorzystać w rutynowej diagnostyce mykoplazmozy (5, 8, 9, 11). Celem zaplanowanych badań było uzyskanie we własnym zakresie rekombinowanego białka P1 M. pneumoniae, użycie go jako antygenu w odczynie ELISA oraz dokonanie oceny jego przydatności w serodiagnostyce mykoplazmozy u ludzi.

Nr 3 Rekombinowane białko P1 M. pneumoniae 231 MATERIAŁ I METODY Surowice ludzkie. Do badań użyto 221 próbek surowicy uzyskanych od osób z objawami infekcji układu oddechowego, podejrzanych w badaniu klinicznym o zakażenie M. pneumoniae. W próbkach tych, w uprzednio wykonanych rutynowych badaniach odczynem wiązania dopełniacza, wykryto obecność mykoplazmowych przeciwciał w mianie diagnostycznie znamiennym ( 60). Dodatkowo do badań wykorzystano 87 próbek surowicy uzyskanych od osób chorych, z innymi niż mykoplazmoza zakażeniami bakteryjnymi, takimi jak: borelioza, chlamydioza, bartoneloza, legioneloza, krztusiec, jersinioza, tularemia oraz 80 próbek surowicy, uzyskanych od klinicznie zdrowych osób krwiodawców. Odpornościowe surowice królicze. Surowice królicze dla szczepu FH M. pneumoniae zostały uzyskane zgodnie z procedurą opisaną uprzednio (10). Uzyskanie białka P1 M. pneumoniae metodą rekombinacji genetycznej. Do uzyskania matrycowego DNA użyto referencyjnego szczepu M. pneumoniae z kolekcji ATCC nr 29342 natomiast do ekspresji rekombinowanego białka P1 szczepu E. coli BL21(DE3) plys pochodzacych z zestawu pet-30 Ek/LIC Vector Kit (Novagen, Wielka Brytania). Hodowla pałeczek E. coli BL21(DE3) plys prowadzona była zarówno w pożywce LB jaki podłożu LB z dodatkiem kanamycyny (w stężeniu 30 μg/ml). Każdą hodowlę inkubowano w temperaturze 37 o C przez 12-24 godzin na wytrząsarce przy częstotliwości drgań 300 rpm. DNA izolowano przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji bakteryjnego DNA tj. DNeasy Blond & Tissue Kit firmy Qiagen z 1,5 3 ml zawiesiny M. pneumoniae ATCC nr 29342 o gęstości 7,0 McFarlanda. Fragment genu kodującego fragment C- końcowy białka P1 Mycoplasma pneumoniae został amplifikowany techniką PCR. Startery dla rekombinowanego fragmentu C-końcowego białka P1 zaprojektowano na bazie sekwencji szczepu M. pneumoniae M129 w oparciu o publikację Chaudhry i wsp. (1) z własnymi modyfikacjami. W badaniach użyto następującej pary starterów: P1iCF 5 -GACGACGACAAGATAAAAAACCTGTTGGACCCCAACCAGG-3, P1iCR- 5 -GAGGAGAAGCCCGGTTGGTTAAACGGACTAAACAAGGTTTGGGG-3 Reakcje PCR przeprowadzono przy użyciu termocyklera PTC-0150 MiniCycler firmy MJ Research. Dla poszczególnych produktów wybrano następujące parametry reakcji PCR: etap wstępnej denaturacji prowadzono przez 1 minutę w temp. 94 o C, a następnie 35 cykli reakcyjnych obejmujących: denaturację DNA w temp. 94 o C przez 1 minutę, przyłączenie starterów w temp. 60 o C przez 1 minutę oraz elongację DNA prowadzoną w 72 o C przez 1 minutę. Końcowy etap obejmował syntezę w 72 o C trwającą 10 minut. W wyniku reakcji PCR uzyskano produkt o wielkość 813 pz kodujący 259 oryginalnych aminokwasów. W celu sprawdzenia wielkości amplifikowanego DNA produkt reakcji PCR poddano elektroforetycznemu rozdziałowi w 1,5 % agarozie (MP Biomedicals) z dodatkiem barwnika SYBR Safe DNA gel stain (Invitrogen). Następnie produkt ten o masie 813 pz oczyszczono z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu zestawu Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen), określono jego stężenie metodą spektrofotometryczną (spektrofotometr firmy Beckman) i przechowywano w temperaturze 20 o C.

232 W. Rastawicki i inni Nr 3 W celu uzyskania rekombinowanego białka P1 przeprowadzono klonowanie produktów PCR do wektora pet30ek/lic i transformację kompetentnych komórek Escherichia coli BL21 (DE3) plys (Novagen). Początkowym etapem była optymalizacja poziomu ekspresji genu kodującego białko rekombinowane P1 M. pneumoniae w układzie Tabora Studiera. W tym celu komórki wybranych szczepów E. coli zawierających rekombinowany plazmid o wielkości 6252 pz namnażano w temperaturze 37 o C, w 25 ml pożywki płynnej LB według Millera (Novagen) z dodatkiem kanamycyny (w stężeniu 30 μg/ml) aż do uzyskania gęstości optycznej zawiesiny OD 600 = 0,5. Następnie 25 ml pierwotnej hodowli przeniesiono do 800 ml świeżej pożywki LB zawierającej kanamycynę w stężeniu 30 μg/ml. Po osiągnięciu przez hodowlę gęstości optycznej OD 600 = 1,0 dodano do zawiesiny bakteryjnej IPTG (izopropylotiogalaktozyd) (Novagen) do końcowego stężenia 1 mm i dalej inkubowano przez kolejne 24 godziny. Zarówno przed jaki po indukcji IPTG pobierano próbki hodowli o objętości 1 ml. Po zakończeniu 24 godzinnej indukcji wszystkie próbki zostały poddane rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) w celu stwierdzenia stopnia ekspresji genu kodującego białko rekombinowane P1. Rekombinowane białko P1 wyizolowano i oczyszczono w warunkach natywnych. Po etapie indukcji zawiesinę bakteryjną wirowano przez 20 minut przy 12000 x g. Uzyskany osad zawieszono w lodowatym buforze 1 x Binding Buffer (5 mm imidazol, 0,2M NaCl, 20 mm Tris- HCl ph 7,9), rozbijano ultradźwiękami w dezyntegratorze firmy MDE przy amplitudzie 16 Hz 6 razy po 10 sekundach w temp. 4 o C a następnie wirowano przy 10 000 x g przez 20 minut. Uzyskany supernatant naniesiono na kolumnę wypełnioną złożem Ni 2+ - IDA zgodnie z metodyką opisaną przez producenta zestawu His-Bind Resin firmę Novagen. Złoże to służy do izolacji i oczyszczania białek z domeną polihistydynową przy wykorzystaniu metod chromatografii metalopowinowactwa. Następnie kolumnę przepłukano kolejno: 10 objętościami roztworu 1 x Binding Buffer (40 mm imidazol, 4M NaCl, 160 mm Tris-HCl, ph=7,9), 6 obj. 1 x Wash Buffer (480 mm imidazol, 4M NaCl, 160 mm Tris-HCl, ph=7,9) i ostatecznie rekombinowane białko wyeluowano poprzez przepłukanie złoża 6 obj. 1 x Elute Buffer (4 M imidazol, 2M NaCl, 80 mm Tris-HCl, ph=7,9. Roztwory zostały przygotowane zgodnie z metodyką podaną przez producenta zestawu His Bind Protein Purification firmę Novagen. Uzyskany preparat białkowy poddano 12 godzinnej dializie wobec sterylnej dejonizowanej wody. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. Bezpośrednio przed elektroforezą do preparatu rekombinowanego białka P1 dodawano równą objętość dwukrotnie stężonego roztworu Laemmli zawierającego 0,5 M Tris HCL o ph 6,8, 10% SDS, 3% 2-merkaptoetanolu, 20% glicerolu oraz 0,05 % błękitu bromofenolowego i ogrzewano we wrzącej łaźni wodnej przez 15 minut. Elektroforezę w 12,5% żelu poliakrylamidowym (płytki o wymiarach 160 x 190 x 1,5 mm ) prowadzono w aparacie firmy Kucharczyk przy natężeniu prądu 60 ma na żel przez 3,5 godziny. Po zakończeniu elektroforezy żele barwiono barwnikiem Coomasie Brilliant Blue R-250. W celu określenia masy cząsteczkowej elektroforetycznie rozdzielonych białek, w każdej serii doświadczenia rozdziałowi poddawano standard masowy firmy Bio Rad. Odczyn western immunoblotting. Przeniesienie elektroforetycznie rekombinowanego białka P1 na membranę nitrocelulozową Immobilon- P (Millipore) wykonywano w aparacie firmy Bio-Rad przy natężeniu prądu 300 ma przez 3 godziny w temperaturze 4 o C.

Nr 3 Rekombinowane białko P1 M. pneumoniae 233 Po zablokowaniu receptorowej powierzchni nitrocelulozy 5% roztworem odtłuszczonego krowiego mleka, arkusze pocięto na paski o szerokości 3-4 mm i następnie inkubowano jedną godzinę w temperaturze pokojowej z ludzkimi surowicami rozcieńczonymi w PBS w stosunku 1:100. Po trzykrotnym przemyciu PBS + 0,5% Tween 20 (PBST) paski nitrocelulozy inkubowano w roztworze odpowiedniego koniugatu. W badaniach posłużono się kozimi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową dla ludzkich immunoglobulin klasy IgA, IgG oraz IgM. Użytkowe rozcieńczenie koniugatów dla IgA i IgM wynosiło 1/750 natomiast dla IgG 1/1500. Po jednej godzinie inkubacji w temperaturze pokojowej paski nitrocelulozy płukano roztworem PBST a następnie inkubowano w roztworze benzydyny (Sigma) w buforze cytrynianowym o ph 5,0 z dodatkiem perhydrolu. Po upływie 10 minut reakcję barwną przerywano poprzez przeniesienie pasków nitrocelulozy do wody destylowanej. Odczyn immunoenzymatyczny ELISA z rekombinowanym białkiem P1. Badania przeprowadzono na płytkach metapleksowych firmy Nunc (Maxisorp) zgodnie z procedurą podaną uprzednio, z uwzględnieniem niezbędnych modyfikacji, oznaczając poziom przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM (7). Do opłaszczania płytek polistyrenowych użyto preparatu rekombinowanego białka P1 rozcieńczonego buforem węglanowym o ph 9,6 do zawartości białka około 10 mg/ml. W badaniach posłużono się kozimi immunoglobulinami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Cappel MP Biomedicals, Inc) rozcieńczonymi odpowiednio w stosunku 1/1000 (IgA), 1/2000 (IgG) i 1/500 (IgM). Pomiaru absorbancji dokonywano w czytniku firmy AsysTech przy długości fali światła 450 nm. Odczyn western-immunoblotting firmy Virotech. Użyto komercyjnego zestawu firmy Virotech Mycoplasma pneumoniae WB (IgG/IgA/IgM western Blot) nr kat. WE114X30, WE114K80. Odczyn przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta. Statystyczne opracowanie wyników. Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono przy użyciu programu komputerowego Instat tm (Instant Biostatistic). Obliczano średnią arytmetyczną wartość miana przeciwciał i odchylenie standardowe. Istotność różnic w częstości wykrywania przeciwciał w próbkach surowicy osób chorych i osób z grupy kontrolnej oceniano testem niezależności chi-kwadrat z zastosowaniem poprawki Yatesa. Za znamienne statystycznie przyjęto różnice, gdzie poziomy istotności p były mniejsze od 0,05 (p<0,05). WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Na rycinie 1 przedstawiono elektroforetyczny rozdział białek pałeczek E. coli BL21 (DE3) oraz rekombinowanego białka P1 M. pneumoniae uzyskany w trakcie jego oczyszczania. Na elektroforegramie sonikatu pałeczek E. coli (ścieżka nr 1) zaznaczono strzałką umiejscowienie rekombinowanego białka P1. Z kolei, na elektroforegramie sonikatu białek przepuszczonego przez kolumienki brak jest białka P1, które osiadło na złożu kolumienki (ścieżka nr 2). Ścieżka nr 3 przedstawia oczyszczone, rekombinowane białko P1 o masie cząsteczkowej 39,7 kda, wypłukane ze złoża roztworem elucyjnym. Przeprowadzone badanie w odczynie western-immunoblotting wykazało, że zarówno królicze surowice odpornościowe jak i surowicami uzyskane od osób z mykoplazmozą silnie reagują z uzyskanym rekombinowanym białkiem P1 (Ryc. 2).

234 W. Rastawicki i inni Nr 3 Ryc. 1. Elektroforegramy białek pałeczek E. coli BL21 (DE3) oraz rekombinowanego białka P1 M. pneumoniae uzyskane w trakcie jego oczyszczania. M- marker masowy, 1 Sonikat pałeczek E. coli z białkiem P1 z hodowli indukowanej przez IPTG (strzałka wskazuje rekombinowane białko P1), 2 roztwór białek uzyskany po przepuszczeniu przez kolumienki sonikatu pałeczek E. coli z białkiem P1 po indukcji przez IPTG, 3 oczyszczone białko P1 P1 (39,7 kda) Ryc. 2. 1 2 3 Wynik reakcji w odczynie western - immunoblotting białka P1 M. pneumoniae z surowicą pacjenta chorego na mykoplazmozę ( ścieżka 1 IgA, 2 IgG, 3 IgM ) W następnych etapie badań, wystandaryzowano odczyn ELISA oraz wyznaczono diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał dla rekombinowanego białka P1. Poziom ten

Nr 3 Rekombinowane białko P1 M. pneumoniae 235 wyznaczono na wysokości średniej arytmetycznej wartości absorbancji (OD) powiększonej o dwa odchylenia standardowe uzyskanej podczas badania 80 próbek surowicy krwiodawców. W celu oceny przydatności uzyskanego antygenu do serodiagnostyki mykoplazmozy, oznaczono w odczynie ELISA poziom przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM dla rekombinowanego białka P1 w 87 próbkach surowicy uzyskanych od osób chorych, z innymi niż mykoplazmoza zakażeniami bakteryjnymi oraz w 221 próbkach surowicy, uzyskanych od osób z klinicznymi objawami zakażenia M. pneumoniae, w których w uprzednio wykonanych rutynowych badaniach odczynem wiązania dopełniacza, wykryto obecność mykoplazmowych przeciwciał w mianie diagnostycznie znamiennym ( 60). Przeprowadzone badania wykazały, że przeciwciała dla rekombinowanego białka P1 występowały w podobnym odsetku próbek surowicy uzyskanych od osób zdrowych i osób z innymi niż mykoplazmoza zakażeniami bakteryjnymi (p>0,05) (przeciwciała klasy IgA odpowiednio w 6,3% i 5,7%, klasy IgG w 7,5% i 8,0%, klasy IgM w 3,8% i 3,4% próbek surowicy). W grupie osób podejrzanych o zakażenie mykoplazmowe przeciwciała klasy IgA dla rekombinowanego białka P1 stwierdzono w 70,1%, klasy IgG 71,9% i klasy IgM w 70,6% próbek surowicy. Statystyczna analiza uzyskanych wyników wykazała, że w próbkach surowicy uzyskanych od osób z objawami zakażenia układu oddechowego, podejrzanymi o mykoplazmozę, przeciwciała dla rekombinowanego białka M. pneumoniae wykrywano statystycznie istotnie częściej niż w próbkach surowicy osób zdrowych i osób z innymi zakażeniami bakteryjnymi (p<0,05) (Tabela I). Tabela I. Występowanie przeciwciał dla rekombinowanego białka P1 M. pneumoniae u osób podejrzanych o zakażenie mykoplazmowe, osób chorych z innymi niż mykoplazmoza zakażeniami bakteryjnymi oraz o u osób klinicznie zdrowych krwiodawców. Badana grupa osób Osoby podejrzane o zakażenie mykoplazmowe (L = 221) Osoby chore z innymi niż mykoplazmoza zakażeniami bakteryjnymi (L = 87) Osoby klinicznie zdrowe -krwiodawcy (L = 80) Liczba i odsetek osób, u których wykryto przeciwciała na poziomie diagnostycznie znamiennym w klasie: IgA IgG IgM L (%) Chi 2 p L (%) Chi 2 p L (%) Chi 2 p 155 (70,1) 5 (5,7) 5 (6,3) 93,7 <0,05 3,6 >0,05 - - 159 (71,9) 7 (8,0) 6 (7,5) 95,9 <0,05 2,5 >0,05 - - 156 (70,6) 3 (3,4) 3 (3,8) 102,6 <0,05 9,7 >0,05 - - Porównanie częstości wykrywania przeciwciał dla M. pneumoniae w 38 próbkach surowicy odczynem ELISA z rekombinowanym białkiem P1 uzyskanym we własnym zakresie i komercyjnym odczynem western-immunoblotting firmy Virotech wykazało wysoką zgodność wyników obydwu testów, wynoszącą 84,2% w przypadku oznaczania przeciwciał klasy IgM, 86,8% w przypadku oznaczania przeciwciał klasy IgA i 97,4% w przypadku poszukiwania przeciwciał klasy IgG (Tabela II).

236 W. Rastawicki i inni Nr 3 Tabela II. Występowanie przeciwciał dla białka P1 M. pneumoniae oznaczonych odczynem ELISA u osób chorych podejrzanych o mykoplazmozę w zależności od okresu choroby. Okres choroby Liczba badanych próbek Liczba i odsetek osób, u których wykryto przeciwciała na poziomie diagnostycznie znamiennym w klasie: IgA IgG IgM < 2 tyg 47 33 (70,2%) 32 (68,1%) 41 (87,2%) 2-4 tyg 40 34 (85,0%) 33 (82,5%) 32 (80,0%) > 4 tyg 16 11 (68,8%) 14 (87,5%) 7 (43,8%) W ostatnim etapie pracy przeanalizowano częstość występowania przeciwciał dla rekombinowanego białka P1 w zależności od okresu choroby, w którym uzyskano do badania próbkę surowicy. Przeciwciała klasy IgM najczęściej wykrywano w próbkach surowicy uzyskanych w ostrej fazie choroby, tj. w pierwszych dwóch tygodniach choroby, przeciwciała klasy IgA w okresie 2-4 tygodni a przeciwciała klasy IgG powyżej czterech tygodni od wystąpienia objawów klinicznych (Tabela II). Tabela III. Porównanie częstości wykrywania przeciwciał dla M. pneumoniae w 38 próbkach surowicy odczynem ELISA z rekombinowanym białkiem P1 uzyskanym we własnym zakresie i komercyjnym odczynem western-immunoblotting firmy Virotech. Liczba i odsetek próbek z wynikiem: Klasa Liczba i odsetek próbek Virotech + Virotech + Virotech - Virotech - z wynikiem zgodnym ELISA P1 + ELISA P1 - ELISA P1 + ELISA P1 - IgA 27 2 3 6 33 (86,8%) IgG 32 1 0 5 37 (97,4%) IgM 30 2 4 2 32 (84,2%) Przeprowadzone badania wykazały pełną przydatność uzyskanego rekombinowanego białka P1 M. pneumoniae jako wysoce swoistego antygenu w badaniu odpowiedzi humoralnej w przebiegu mykoplazmozy u ludzi. Na szczególną uwagę zasługuje brak krzyżowych, nieswoistych reakcji tego białka z przeciwciałami dla innych patogenów bakteryjnych. Uzyskanie tak wysoce swoistego antygenu było możliwe dzięki zastosowaniu technik inżynierii genetycznej, pozwalającej precyzyjne zaprojektować i oczyścić rekombinowane białko. Co równie istotne, odczyn immunoenzymatyczny ELISA, w którym jako antygen wykorzystano oczyszczone białko P1, odznacza się również, w porównaniu do odczynu western-immunoblotting firmy Virotech, bardzo wysoką czułością, przekraczającą 93,0%. Jest to o tyle znamienne, że w odczynie komercyjnym producent, oprócz rekombinowanego białka P1, zastosował również szereg innych rekombinowanych białek a także lipoproteidy i glikolipidy (11). Aktualnie na rynku dostępne są komercyjne zestawy ELISA oraz western-immunoblotting służące do serodiagnostyki mykoplazmozy oparte na rekombinowanym białku P1. Należy mieć jednakże na uwadze, że badania mające na celu wyznaczenie poziomu cut- -off w komercyjnych testach przeprowadzone były zazwyczaj na wybranej populacji osób zdrowych w krajach Europy Zachodniej, niekoniecznie reprezentatywnej dla populacji osób w Polsce. W rutynowo prowadzonej serodiagnostyce mykoplazmozy nie bez znaczenia jest również wysoki koszt zakupu tych zestawów. Przedstawiona w pracy metodyka umożliwia

Nr 3 Rekombinowane białko P1 M. pneumoniae 237 uzyskanie we własnym zakresie oczyszczonego, rekombinowanego białka P1 M. pneumoniae, które może być z powodzeniem użyte jako wysoce swoisty antygen w odczynach serologicznych opracowanych samodzielnie. PIŚMIENNICTWO 1. Chaudhry R, Nisar N, Bhavna H i inni. Expression and immunological characterization of the carboxy-terminal region of the P1 adhesion protein of Mycoplasma pneumoniae. J Clin Microbiol 2005; 43: 321-5. 2. Biberfeld G. Antibodies to brain and other tissues in cases of Mycoplasma pneumoniae infection. Clin Exp Immunol 1971; 8: 319-33. 3. Lind K. Immunological relationships between Mycoplasma pneumoniae and Streptococcus MG. Acta Path Microbiol Scand 1968; 73: 237-44. 4. Lind K, Lindhardt BO, Schutten HJ i inni. Serological cross-reactions between Mycoplasma genitalium and Mycoplasma pneumoniae. J Clin Microbiol 1984; 20: 1036-43. 5. Montagnani F, De Paolis F, Beghetto E, Gargano N. Use of recombinant chimeric antigens for the serodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2010; 29: 1377-86. 6. Pönka A, Pönka T, Sarna S, Penttinen K. Questionable specificity of lipid antigen in the Mycoplasma pneumoniae complement fixation test in patients with extrapulmonary manifestations. J Infect 1981; 3: 332-8. 7. Rastawicki W. Ocena odczynami tradycyjnymi i nowej generacji odpowiedzi humoralnej na antygeny Mycoplasma pneumoniae w przebiegu naturalnego zakażenia u ludzi. I. Występowanie i poziom mykoplazmowych przeciwciał u osób klinicznie zdrowych. Med Dośw Mikrobiol 1995; 47: 35-53. 8. Rastawicki W. Ocena przydatności odczynu western-immunoblotting do badania humoralnej odpowiedzi na antygeny Mycoplasma pneumoniae w przebiegu naturalnego zakażenia u ludzi. Med Dośw Mikrobiol 1996; 48: 39-48 9. Rastawicki W., Räty R., Kleemola M. Detection of antibodies to Mycoplasma pneumoniae adhesin P1 in serum specimens from infected and non-infected subjects by immunoblotting. Diagn Microbiol Infect Dis 1996; 26: 141-3 10. Rastawicki W, Jagielski M. Elektroforetyczna i immunologiczna analiza porównawcza komórkowych białek Mycoplasma pneumoniae i Mycoplasma genitalium. Med Dośw Mikrobiol 1998; 50: 259-67. 11. Rastawicki W, Rokosz N, Jagielski M. Ocena przydatności wybranych antygenów Mycoplasma pneumoniae w serodiagnostyce mykoplazmozy. Med Dośw Mikrobiol 2009; 61: 175-82. Otrzymano: 20 VIII 2012 Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH e-mail: Rastawicki@pzh.gov.pl