Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie Katedra Biotechnologii Żywności BOŻENA STODOLAK Autoreferat (Załącznik nr 2) Kraków 2016
1. Imię i nazwisko: Bożena Stodolak Miejsce pracy: Katedra Biotechnologii Żywności Wydział Technologii Żywności Uniwersytet Rolniczy w Krakowie ul. Balicka 122, 30-149 Kraków 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe - z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytuł rozprawy doktorskiej 1991-1996 studia magisterskie, kierunek Ogrodnictwo, Wydział Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Kraków 27 czerwca 1996 r. dyplom magistra inżyniera, Wydział Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Kraków. Praca magisterska pt. Wpływ uszkodzeń mechanicznych na metabolizm związków fenolowych w korzeniach marchwi (Daucus carota), promotor: dr hab. Maria Leja, prof. AR w Krakowie 1996-2000 studia doktoranckie, Wydział Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Kraków 16 lipca 2001 r. dyplom doktora nauk rolniczych w zakresie ogrodnictwa, Wydział Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Kraków. Rozprawa doktorska pt. Biochemiczne i fizjologiczne aspekty metabolizmu związków fenolowych w korzeniach marchwi poddanych czynnikom stresowym, promotor: dr hab. Maria Leja, prof. AR w Krakowie 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych 17.12.2001-17.12.2003 asystent naukowo- dydaktyczny, Katedra Biotechnologii Żywności, Wydział Technologii Żywności, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja, Kraków 17.12.2003 obecnie adiunkt naukowo- dydaktyczny, Katedra Biotechnologii Żywności, Wydział Technologii Żywności, Akademia Rolnicza (aktualnie Uniwersytet Rolniczy) im. Hugona Kołłątaja, Kraków 2
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) tytuł osiągnięcia naukowego Osiągnięciem naukowym będącym podstawą złożonego przeze mnie wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego jest jednotematyczny cykl publikacji pod zbiorczym tytułem: Modyfikacja wartości odżywczej i potencjału antyoksydacyjnego surowców roślinnych na drodze fermentacji typu tempe b) publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego 1. Stodolak B.(60%), Starzyńska-Janiszewska A. 2008. The influence of tempeh fermentation and conventional cooking on anti- nutrient level and protein bioavailability (in vitro test) of grass- pea seeds. Journal of the Science of Food and Agriculture, 88: 2265-2270 IF: 1,333 MNiSW =24 pkt 2. Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B.(45%), Jamróz M. 2008. Antioxidant properties of extracts from fermented and cooked seeds of polish cultivars of Lathyrus sativus. Food Chemistry, 109: 285-292 IF: 2,696 MNiSW =24 pkt 3. Stodolak B.(70%), Starzyńska-Janiszewska A. 2009. Effect of sunflower seeds addition on the nutritional value of grass pea tempeh. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 59: 145-150 IF: 0 MNiSW =6 pkt 4. Stodolak B.(80%), Starzyńska-Janiszewska A., Mickowska B. 2013. Effect of flaxseed oil-cake addition on the nutritional value of grass pea tempeh. Food Science and Technology Research, 9(6): 1107-1114 IF: 0,355 MNiSW =20 pkt 5. Stodolak B.(80%), Starzyńska-Janiszewska A., Wikiera A. 2015. Wpływ dodatku wytłoków lnianych na potencjał antyoksydacyjny tempe z nasion lędźwianu. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 6(103): 96-105 IF: 0 MNiSW =13 pkt 6. Stodolak B.(80%), Starzyńska-Janiszewska A., Wywrocka-Gurgul A.,Wikiera A. 2016. Solid-state fermented flaxseed oil cake of improved antioxidant capacity as potential food additive. Journal of Food Processing and Preservation, DOI: 10.1111/jfpp.12855 IF: 1,16 MNiSW =20 pkt 3
liczba punktów za cykl publikacji (dane z roku publikacji) MNiSW =107 wartość IF (dane z roku publikacji): 5,544 Oświadczenia współautorów prac określające indywidualny wkład każdego z nich w powstanie publikacji znajdują się w załączniku nr 5. c) omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Wprowadzenie Lędźwian siewny, popularny w Afryce i na subkontynencie Indyjskim jest stosunkowo mało znany w Polsce, gdzie tylko jego lokalne formy występujące pod różnymi nazwami były uprawiane w niektórych regionach, np. na Podlasiu. Cechami charakterystycznymi tej rośliny są duża plenność, wysoka odporność na warunki atmosferyczne, małe wymagania glebowe, atrakcyjność nasion pod względem wartości odżywczej (bogate w białko o korzystnym składzie aminokwasowym) i cech organoleptycznych 1. Podjęte prace mające na celu jego popularyzację 2 zaowocowały rejestracją w 1998 roku dwóch polskich odmian Derek i Krab, różniących się wielkością nasion. Na fali zainteresowania tym mało popularnym gatunkiem roślin strączkowych, w Katedrze Surowców i Przetwórstwa Owocowo- Warzywnego Akademii Rolniczej w Krakowie, prowadzono badania dotyczące oceny przydatności nasion lędźwianu o niepełnej dojrzałości fizjologicznej dla przetwórstwa 3. Suche nasiona można natomiast wykorzystywać jako składnik zup, pasztetów jarskich, farszu do pierogów albo jako surowiec do tworzenia ekstrudatów o korzystnych cechach organoleptycznych. W nasionach lędźwianu, podobnie jak u innych strączkowych znajduje się wiele składników antyodżywczych, takich jak inhibitory amylaz, proteaz, lektyny, polifenole, fosforany mio-inozytolu i oligosacharydy z rodziny rafinozy. Najbardziej toksycznym związkiem lędźwianu jest aminokwas niebiałko- 1 Grela E.R., Winiarska S. 1997. Skład chemiczny i wartość pokarmowa nasion lędźwianu siewnego (Lathyrus sativus L.). Międzynarodowe Sympozjum Naukowe Lędźwian siewny- agrotechnika i wykorzystanie w żywieniu zwierząt i ludzi Radom, 9-10 czerwca 1997. ODR, Radom, pp.49-55 2 Milczak M., Pędziński M., Mnichowska H., Szwed- Urbaś K. 1997. Hodowla twórcza lędźwianu siewnego (Lathyrus sativus L.)- podsumowanie pierwszego etapu. Międzynarodowe Sympozjum Naukowe: Lędźwian siewny- agrotechnika i wykorzystanie w żywieniu zwierząt i ludzi., Lublin- Radom, 13-22 3 Korus A. Przydatność nasion lędźwianu siewnego do mrożenia i sterylizacji. 2002. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 1(30): 78-87 4
wy, kwas 3-N-oksalylo-L-2,3- diaminopopionowy, którego nadmierne spożycie może doprowadzić do latyryzmu 4. Związki przeciwżywieniowe można usuwać z surowych nasion roślin strączkowych stosując obróbkę konwencjonalną, na którą składają się moczenie, opcjonalnie łuszczenie i gotowanie. Procedura ta jest jednak czasochłonna, a ponadto powoduje stratę wartościowych składników. Nasiona lnu oleistego mogą być wykorzystywane jako komponent zdrowej albo funkcjonalnej żywności dzięki unikalnemu składowi chemicznemu. Zawierają od 10 do 30% białka o profilu aminokwasów porównywalnym z białkiem soi, około 40% tłuszczu i 30% błonnika pokarmowego. Olej nasion lnu jest bogaty w kwas α-linolenowy, który może stanowić od 50-70% puli wszystkich kwasów tłuszczowych. Nasiona lnu są też zasobne w różnego rodzaju związki fenolowe, stanowią m.in. najlepsze źródło lignanu diglukozydu secoizolariciresinolu 5. Antyoksydanty obecne w żywności i innych materiałach biologicznych zyskują ostatnio szczególne zainteresowanie. Uważane są za związki bezpieczne, mogące wywierać potencjalnie korzystne efekty żywieniowe i terapeutyczne 6. Zastosowanie zmielonych nasion lnu w zastępstwie części mąki spowodowało wzrost potencjału antyoksydacyjnego wypieczonego z niej chleba 7. W podobny sposób otrzymano również chleb pomocny w zapobieganiu powikłaniom cukrzycowym 8. Wytłoki lniane stanowią produkt odpadowy po ekstrakcji oleju z nasion. Jadalne makuchy (np. z nasion soi, słonecznika, rzepaku) o wysokiej wartości odżywczej są zwykle przeznaczane na paszę dla zwierząt. Możliwe jest jednak wykorzystanie wytłoków lnianych jako komponentu produktów spożywczych dla ludzi. Pozyskane z nich białka oraz ich hydrolizaty o określonych właściwościach mogą służyć jako składniki żywności funkcjonalnej 9 10. Ponad- 4 Campbell C.G. 1997. Gras pea Lathyrus sativus L. IPGRI, Rome, pp. 15-18 5 Hall III C., Tulbek M.C., Xu Y. 2006. Flaxseed. W: Advances in food and nutrition research. S.L. Taylor (red.). Elsevier Academic Press, San Diego, pp. 2-96 6 Dziki D., Różyło R., Gawlik- Dziki U., Świeca M. 2014. Current trends in the enhancement of antioxidant activity of wheat bread by the addition of plant materials rich in phenolic compounds. Trends Food Sci. Technol., 1: 48-61 7 Meral R., Sait Dogan I. 2013. Quality and antioxidant activity of bread fortified with flaxseed. Ital. J. Food Sci., 25: 51-56 8 Mohamed D.A., Al-Okbi S.Y., El-Hariri D.M., Mousa I.I. 2012. Potential health benefits of bread supplemented with defatted flaxseed under dietary regimen in normal and type 2 diabetic subjects. Pol. J. Food Nutr. Sci., 62: 453-460 9 Mueller K., Eisner P., Yoshie- Stark Y., Nakada R., Kirchhoff E. 2010. Functional properties and chemical composition of fractionated brown and yellow linseed meal (Linum usitatissimum L.). J. Food Eng., 98: 453-460 10 Udenigwe C., Lu Y.-L., Han C.-H., Hou W.-C., Aluko R.A. 2009. Flaxseed protein- derived peptide fraction: Antioxidant properties and inhibition of lipopolysaccharide- induced nitric oxide production in murine macrophages. Food Chem., 116: 277-284 5
to stosowano je jako zamiennik mąki przy wypieku chleba 11, czy też jako komponent przecieru aroniowego 12. Fermentacja tempe jest jednym z przykładów fermentacji w podłożu stałym (SSF). Jest tradycyjnym sposobem przetwarzania nasion soi w produkt tempe, wywodzącym się z Indonezji. Stanowi alternatywną metodę obróbki nasion roślin strączkowych, dzięki której otrzymuje się produkt o interesujących cechach organoleptycznych i wysokiej wartości odżywczej. Do produkcji tempe wykorzystuje się pleśnie z rodzaju Rhizopus, takie jak R. oryzae, R. arhizus, R. stolonifer i najczęściej R. oligosporus 13. Jednym z interesujących zastosowań procesu SSF jest produkcja żywności wzbogaconej w nieenzymatyczne antyoksydanty 14. Dowiedziono, że fermentacja tempe nasion roślin strączkowych może skutkować wzrostem poziomu związków wykazujących aktywność zmiatania wolnych rodników 15 16. Według mojej wiedzy, w Polsce zagadnieniami związanymi z fermentacją w podłożu stałym z wykorzystaniem pleśni typowych w produkcji tempe oprócz nas zajmowały się lub zajmują zespoły badawcze z Zakładu Fermentacji i Biosyntezy Instytutu Technologii Żywności Pochodzenia Roślinnego UP w Poznaniu oraz z Instytutu Biochemii Technicznej Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej. Cel Celem prac badawczych, których wyniki złożyły się na cykl publikacji stanowiących opisywane osiągnięcie naukowe, było w pierwszej kolejności określenie, na ile fermentacja typu tempe, z udziałem pleśni z rodzaju Rhizopus, wpływa na skład chemiczny nasion lędźwianu siewnego i czy proces ten pozwala na otrzymanie wygodnego produktu, charakteryzującego się zarazem lepszą wartością odżywczą i potencjałem bioaktywnym w porównaniu z ugotowanymi w sposób konwencjonalny nasionami. Kolejnym celem była modyfikacja wartości odżywczej tempe lędźwianowego, dotycząca przede wszystkim zmiany zawartości 11 Ogunronbi O., Jooste P.J., Abu J.O., van der Merwe B. 2011. Chemical composition, storage stability and effect of cold-pressed flaxseed oil cake inclusion on bread quality. J. Food Process. Pres., 35: 64-79 12 Nowicka P., Teleszko M., Wojdyło A., Oszmiański J. 2014. Ocena walorów sensorycznych i wartości żywieniowej przecieru aroniowego z dodatkiem wytłoków lnu i suszonych liści stewii. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 1(92): 124-136 13 Astuti M., Meliala A. Dalais F.S., Wahlqvist M.L. 2000. Tempe, a nutritious and healthy food from Indonesia. Asia Pacific J. Clin. Nutr., 9: 322-325 14 Martins S., Mussatto S.I., Martínez- Avila G., Montañez- Saenz J. 2011. Bioactive phenolic compounds: Production and extraction by solid- state fermentation. A review. Biotechnol. Adv., 29: 365-373 15 Randhir R., Wattem D. Shetty K. 2004. Solid- state bioconversion of fava bean by Rhizopus oligosporus for enrichment of phenolic antioxidants and L-DOPA. Int. J. Food Sci. Technol., 5: 235-244 16 Sheih I.-Ch., Wu H.-Y., Lai Y.-J., Lin Ch.-F. 2000. Preparation of high free radical scavenging tempeh by newly isolated Rhizopus sp. R- 69 from Indonesia. Food Sci. Agric. Chem., 10: 35-40 6
tłuszczu, profilu kwasów tłuszczowych a także aminokwasów, osiągana na drodze wprowadzania do głównego substratu fermentacji kosubstratów w postaci nasion słonecznika lub wytłoków lnianych. Po zrealizowaniu dwóch poprzednich zadań i wysnuciu wniosku, że makuch lniany może stanowić bardzo wartościowy kosubstrat fermentacji tempe dla nasion lędźwianu, ostatnim ale nie mniej ważnym celem było zbadanie, czy możliwe jest uzyskanie z wytłoków lnianych przetworzonych na drodze fermentacji w podłożu stałym funkcjonalnego dodatku do żywności. Cele te bardziej uszczegółowione były realizowane w kolejnych doświadczeniach, których wyniki ukazały się w postaci sześciu publikacji. Materiały i metody Fermentacja nasion lędźwianu Nasiona lędźwianu odmian Derek i Krab przed procesem fermentacji poddawano obróbce wstępnej. Spośród kilku ogólnie przyjętych sposobów przygotowania nasion do szczepienia 17 wybrano metodę, stanowiącą kompromis między ilością etapów, czyli długością całego procesu, a pewnością, że właściwa fermentacja będzie przebiegała jedynie z udziałem szczepu pleśni obecnego w inokulum. Metoda ta polegała na wstępnym gotowaniu nasion przez 30 minut, a następnie moczeniu (18 h) i łuskaniu. Pierwsze gotowanie było sposobem sterylizacji nasion, a ponadto ułatwiło ich łuskanie. Obłuskane nasiona gotowano ponownie w wodzie zakwaszonej do ph 4,5-5,0, w celu otrzymania substratu fermentacji o ph, które uniemożliwi rozwój niepożądanej flory bakteryjnej. Początkowo nasiona lędźwianu obu odmian fermentowano z użyciem startera (producent- Top Cultures, Zoersel, Belgia) zawierającego szczep R. oligosporus z kolekcji DSMZ (R. oligosporus DSM 1964, publikacje 1, 2 i 3). Inkubację zaszczepionego materiału prowadzono w perforowanych woreczkach foliowych w cieplarkach w temperaturze 32 o C przez czas potrzebny, aby nasiona zostały całkowicie przerośnięte i porośnięte białą pleśnią, a zapach amoniaku, wskazujący na daleko posuniętą fermentację był niewyczuwalny. Potem zmieniono sposób szczepienia, stosując zawiesinę zarodników czystych kultur grzybowych: 17 Kuswanto K.R. 2004. Industrialization of tempe fermentation. W: Industrialization of indigenous fermented foods, revised and expanded. 2nd Edition. K.H. Steinkraus (ed.), CRC Press 7
R. oligosporus DSM 1964 lub R. microsporus var. chinensis w ilości dobranej doświadczalnie (publikacje 4, 5). Wprowadzona zmiana miała na celu standaryzację inokulum. Fermentacja wytłoków lnianych Wytłoki lniane przed procesem fermentacji rozdrabniano, a następnie uwadniano do wilgotności 45% i równocześnie zakwaszano do ph 4-5. Tak przygotowany materiał sterylizowano (20 min w temp. 121 o C) (publikacje 4, 5 i 6). Po sterylizacji szczepiono zawiesiną zarodników szczepów R. oligosporus DSM 1964 lub ATCC 64063. Zaszczepione wytłoki inkubowano przez 48 do 144 h w szalkach Petriego, w temp. 30 o C (publikacja 6). Wilgotność substratu oraz ilość wprowadzanych zarodników wyznaczono doświadczalnie. Czas potrzebny na równomierny przerost substratu grzybnią wynosił 48 h. W uzyskanym materiale oznaczano: - białko całkowite, na podstawie ilości azotu według metody Nesslera 18 w próbkach wcześniej zmineralizowanych (publikacje 1, 3, 4 i 6), - tłuszcz całkowity 19 (publikacje 3, 4 i 6), - popiół całkowity 20 (publikacje 3, 4 i 6), - profil aminokwasów (publikacje 3 i 4), - profil kwasów tłuszczowych w ekstraktach sporządzonych według metodyki opisanej przez Folch i in. 21, rozdział prowadzono zgodnie z AOAC 22 (publikacje 3 i 4), -poziom ODAP 23 (publikacja 1), -aktywność inhibitorów trypsyny 24 (publikacja 1), -zawartość fosforanów mio-inozytolu w ekstraktach sporządzonych według Harland i Oberleas 25, według metody podanej przez Latta i Eskin 26 (publikacja 1), 18 Marczenko Z. Balcerzak M. 1998. Spektrofotometryczne metody w analizie nieorganicznej. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, s. 104-105 19 AOAC No. 920,39. 1995. Official Methods of Analysis. AOAC International, Arlington 20 ICC-Standard No.104/1. 1990 21 Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H.A. 1957. Simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem., 226: 497-509 22 AOAC No. 991.39. 1995. Official Methods of Analysis. AOAC International, Arlington 23 Briggs C.J., Parreno N., Campbell C.G. 1983. Phytochemical assessment of Lathyrus species for the neurotoxic agent, β-n-oxalyl-l-α,βdiaminopropionic acid. Planta Med., 47: 188-190 24 Kakade F.L., Rackis J.J., McGhee J.E., Puski G. 1974. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: a collaborative analysis of an improved procedure. Cereal Chem., 51: 376-382 25 Harland B.F., Oberleas D. 1977. A modified method for phytate analysis using an ion-exchange procedure: application to textured vegetable proteins. Cereal Chem., 54: 827 26 Latta M., Eskin M. 1980. A simple and rapid colorimetric method for phytate determination. J. Agric. Food Chem., 28: 1313-1315 8
- biodostępność białka i cukrów po trawieniu in vitro według metody podanej przez Żyłę i in. 27, a zmodyfikowanej tak, aby otrzymać warunki symulujące układ pokarmowy człowieka (publikacje 1, 3 i 6), - biodostępność białka 28 (publikacja 4). W celu oznaczenia właściwości antyoksydacyjnych otrzymanych produktów z ich próbek sporządzano różne rodzaje ekstraktów stosując mieszaninę 96% etanolu, gliceryny i wody w stosunku 1:1:1 (publikacje 1 i 2), 50% aceton (publikacje 5 i 6) lub bufor 0,1 M, ph 7,4 (publikacje 2, 5 i 6). Potencjał antyoksydacyjny ekstraktów szacowano oznaczając: - poziom fenoli rozpuszczalnych 29 (publikacje 1, 2, 5 i 6), - poziom flawonoidów 30 (publikacja 6), - aktywność neutralizacji kationorodnika ABTS 31 (publikacje 2, 5 i 6), - aktywność zmiatania rodnika DPPH 32 (publikacje 2, 5 i 6), - aktywność neutralizacji rodnika hydroksylowego 33 (publikacje 5 i 6), - siłę redukującą 34 (publikacje 5 i 6). Opis wyników Publikacje 1 i 2 Celem publikacji 1 i 2 było porównanie wpływu dwóch sposobów obróbki nasion lędźwianu: fermentacji w podłożu stałym typu tempe z udziałem szczepu R. oligosporus DSM 1964 oraz konwencjonalnego gotowania na poziom związków przeciwżywieniowych, biodostępność białek szacowaną metodą in vitro oraz potencjał antyoksydacyjny. 27 Żyła K., Wikiera A., Korelewski J., Świątkiewicz S., Pironen D.R., Ledoux D.R. 2000. Comparison of the efficiencies if a novel Aspergillus niger mycellium with separate and combined effectiveness of phytase, acid phosphatase and pectinase in dephosphorylation of wheatbased feeds fed to growing broilers. Poultry Science, 79: 1434-1443 28 Monsoor M.A., Yusuf H.K.M. 2002. In vitro protein digestibility of lathyrus pea (Lathyrus sativus), lentil (Lens culinaris) and chickpea (Cicer arietinum). Int. J. Food Sci. Tech., 37: 97-99 29 Swain T., Hillis W.E. 1959. Phenolic constituents of Prunus domestica L. Quantitative analysis of phenolic constituents. J. Sci. Food Agric., 10: 63-68 30 Papoti V.T., Xystouris S., Papagianni G., Tsimidou M.Z. 2011. Total flavonoid content assessment via aluminum [Al(III)] complexation reactions. What we really measure?. Ital. J. Food Sci., 23: 252-259 31 Cano A. Acosta M., Arnao M.B. 2003. Hydrophilic and lipophilic antioxidant activity changes during on-vine ripening of tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill.). Postharvest Biol. Technol., 28: 59-65 32 Pekkarinen S.S. Stockmann H., Schwarz K., Heinonen M., Hopia A.I. 1999. Antioxidant activity and partitioning of phenolic acids in bulk and emulsified methyl linoleate. J. Agric. Food Chem., 47: 3036-3043 33 Marambe P.W.M.L.H.K., Shand P.J., Wanasundara J.P.D. 2008. An in-vitro investigation of selected biological activities of hydrolysed flaxseed (Linum usitatissimum L.) proteins. J. Am. Oil Chem. Soc., 85: 1155-1164 34 Ardestani A., Yazdanparast R. 2007. Antioxidant and free radical scavenging potential of Achillea santolina extracts. Food Chem., 104: 21-29 9
W surowych nasionach odmiany drobnoziarnistej Derek oznaczono 1,9 g/kg s.m. aminokwasu niebiałkowego ODAP. Ilość ta była zgodna z wcześniejszymi doniesieniami 35 i potwierdzała, że polskie odmiany lędźwianu siewnego należą do niskotoksycznych. Procesy poprzedzające szczepienie (krótkie gotowanie, moczenie, łuskanie i ponowne krótkie gotowanie) spowodowały eliminację aż 82% neurotoksyny, a sama fermentacja usuwała kolejne 11% ODAP. W efekcie po fermentacji oznaczono jedynie 7% wyjściowej zawartości aminokwasu. Wskazywało to na zdolności zastosowanego w procesie fermentacji szczepu R. oligosporus do detoksykacji nasion. Już wcześniej obserwowano, że kultury pleśni Aspergillus i Rhizopus, wykorzystane w procesie następczej fermentacji są zdolne do usuwania większości neurotoksyny z nasion odmian zaliczanych do niskotoksycznych 36. Na podkreślenie zasługuje jednak fakt, że nasza procedura produkcji tempe była bardziej skuteczna w eliminacji ODAP, niż zastosowana przez Kuo i in 37. Drugi badany przez nas sposób przetwarzania nasion lędźwianu siewnego, czyli gotowanie do miękkości był w zdecydowanie mniej efektywny w usuwaniu neurotoksyny. W nasionach tych pozostało jeszcze 53% wyjściowego poziomu ODAP. Fermentacja w podłożu stałym poprzedzona obróbką wstępną nasion, jak również ich gotowanie do miękkości przyczyniły się do usunięcia około 99% inhibitorów trypsyny. Wyjściowy poziom oznaczony w suchych nasionach wynosił 18947 TIU/g s.m., natomiast w przetworzonych wahał się w granicach 228-298 TIU/g s.m. Nie obserwowano istotnych statystycznie różnic w aktywności inhibitorów trypsyny pomiędzy produktem tempe a nasionami gotowanymi. Otrzymane dane wskazują na to, że głównym czynnikiem eliminującym te antyżywieniowe związki z nasion lędźwianu była obróbka hydrotermiczna. Podobny efekt uzyskano w przypadku fosforanów mio-inozytolu. Zarówno konwencjonalne gotowanie nasion, jak i ich obróbka poprzedzająca szczepienie spowodowały istotne zmniejszenie zawartości tych składników, średnio o 30% w porównaniu z poziomem oznaczonym w suchych nasionach. Nie obserwowano pozytywnego wpływu samego procesu fermentacji na eliminację tych antyodżywczych związków. Wręcz przeciwnie, poziom fosforanów mio-inozytolu w tempe był ok. 10% wyższy (różnica statystycznie istotna) w porównaniu z nasionami przy- 35 Grela E.R., Studziński T., Matras J. 2001. Antinutritional factors in seeds of Lathyrus sativus cultivated in Poland. Lathyrus, Lathyrism Newsletter, 2: 101-104 36 Yigzaw Y., Gorton L., Solomon T., Akalu G. 2004. Fermentation of seeds of teff (Eragrostis teff), grass-pea (Lathyrus sativus) and their mixtures: aspects of nutrition and safety. J. Agric. Food Chem., 52: 1163-1169 37 Kuo Y.-H., Bau H.-M., Quemener B., Khan J.K., Lambein F. 1995. Solid-state fermentation of Lathyrus sativus seeds using Aspergillus oryzae and Rhizopus oligosporus spt3 to eliminate the neurotoxin β-odap without loss of nutritional value. J. Sci. Food Agric., 69: 81-89 10
gotowanymi do szczepienia lub ugotowanymi. Nie musi to jednak świadczyć o braku zdolności stosowanego szczepu R. oligosporus do produkcji fitaz. Suche nasiona lędźwianu odmiany Derek zawierały 270 g/kg s.m. białka. W tempe oznaczono 333 g/kg s.m., czyli o 23% więcej w porównaniu z materiałem wyjściowym, natomiast gotowanie nasion do miękkości skutkowało 5% utratą białka. Zastosowanie obróbki hydrotermicznej, poprzedzającej szczepienie nasion, spowodowało wzrost biodostępności białka o 9%. Fermentacja z udziałem szczepu R. oligosporus DSM 1964 skutkowała zauważalnym, ale nieistotnym statystycznie wzrostem tego parametru. Obserwacje te znalazły potwierdzenie w literaturze. Wcześniej donoszono bowiem, że całkowita strawność białka nasion soi i fasolnika chińskiego poprawia się znacząco w wyniku gotowania, natomiast proces fermentacji grzybowej powoduje wzrost już tylko o 3% 38. Biodostępność białka na poziomie ok. 61% oznaczono w przypadku nasion ugotowanych do miękkości i była ona wyższa odpowiednio o 19% i 8% w porównaniu z nasionami surowymi i produktem tempe. Szacowana metodą in vitro dostępność białek w wysokim stopniu korelowała zarówno z poziomem inhibitorów trypsyny, jak i zawartością fosforanów mio-inozytolu (współczynniki korelacji nieliniowej wynosiły odpowiednio 0,84 i 0,8). Zauważono, że podczas trawienia znacznie więcej, odpowiednio o 45% i 55%, rozpuszczalnych białek uwalniało się do dializatu z nasion poddanych obróbce wstępnej i tempe niż z nasion surowych. Należy podkreślić również, że pomimo niższej biodostępności białka z produktu fermentacji niż z nasion konwencjonalnie gotowanych, podczas trawienia w warunkach in vitro, zdecydowanie więcej białek rozpuszczalnych było uwalnianych ze 100 g tempe niż 100 g nasion ugotowanych do miękkości. W celu oceny potencjału antyoksydacyjnego surowych i przetworzonych nasion lędźwianu stosowano różne testy dla ekstraktów sporządzonych w buforze (wodnych) oraz w mieszaninie 96% etanolu, gliceryny i wody (1:1:1, v:v). Stwierdzono, że wszystkie rodzaje badanych nasion (surowe, przygotowane do fermentacji oraz fermentowane obu odmian- Derek i Krab) wykazują zdolność do neutralizacji wolnych stabilnych rodników ABTS i DPPH. Ponadto średnia aktywność zmiatania wolnych rodników wyrażana w postaci ekwiwalentów troloksu (μmol/g s.m.) była czterokrotnie wyższa względem rodnika ABTS niż DPPH. Przygotowanie do szczepienia spowodowało istotne obniżenie aktywności przeciwrodnikowej nasion. Fermentacja z kolei przyczyniła się do znacznego wzrostu zdolności do neutralizacji 38 Nout M.J.R., Kiers J.L. 2005. A review. Tempe fermentation, innovation and functionality: update into the third millennium. J. App. Microbiol., 98: 789-805 11
wolnych rodników w porównaniu z nasionami surowymi (w przypadku DPPH 5,5 razy i o 60%, a w przypadku ABTS + o 9% i 24%, odpowiednio dla odmiany Krab i Derek). Gotowanie do miękkości skutkowało obniżeniem aktywności neutralizacji wolnych rodników. Ekwiwalenty troloksu wyznaczone dla nasion gotowanych obu odmian były istotnie niższe w porównaniu z nasionami surowymi i z tempe. Ekstrakty z nasion gotowanych wykazywały trzykrotnie (odmiana Derek) i sześciokrotnie (odmiana Krab) mniejszą aktywność względem DPPH oraz dwukrotnie niższą aktywność względem ABTS + w porównaniu z produktami fermentacji. Aktywność antyrodnikowa obu rodzajów ekstraktów była wysoce skorelowana z zawartością w nich związków fenolowych (współczynniki korelacji dla nieliniowej zależności wynosiły 0,81 i 0,91 odpowiednio dla metody z DPPH i ABTS + ). W ekstraktach wodnych oznaczono większy poziom fenoli niż w glicerynowo- etanolowych. Wiadomo, że odczynnik Folina- Ciocalteu wykorzystywany w analizie zawartości fenoli jest również w stanie reagować z innymi związkami o zdolnościach redukujących w warunkach oznaczenia, np. aminokwasami aromatycznymi, peptydami i polipeptydami. Związki te mogły być w większym stopniu rozpuszczalne w wodzie (buforze) niż w mieszaninie glicerynowo- alkoholowej. Proces obróbki nasion przed szczepieniem spowodował znaczące obniżenie zawartości fenoli w nasionach obu odmian. Zmiana ta była oczekiwana, ponieważ związki te obecne są zwłaszcza w okrywach nasiennych w celu ochrony nasion przed patogenami i szkodnikami 39. Natomiast sama fermentacja z udziałem R. oligosporus DSM 1964 skutkowała wzrostem zawartości fenoli do poziomu podobnego (ekstrakty glicerynowoetanolowe) albo niższego o 9-35% niż w nasionach surowych (ekstrakty buforowe). Wzrost zawartości fenoli będący skutkiem fermentacji grzybowej był zgodny z obserwacjami innych badaczy 40. Enzymatyczna hydroliza składników ścian komórkowych, mająca miejsce podczas fermentacji, może przyczyniać się do uwalniania glikozydów fenoli, a także ich aglikonów wykazujących większą aktywność antyrodnikową niż wyjściowe glikozydy. Porównanie zmian poziomu związków fenolowych oraz aktywności antyrodnikowej między nasionami przygotowanymi do szczepienia a produktami tempe wskazywało też, że w wyniku aktywności pleśni doszło do jakościowej zmiany profilu fenoli. Jeśli chodzi o nasiona ugotowane do 39 Liyana-Pathirana C.M., Shahidi F. 2006. Importance of insoluble-bound phenolics to antioxidant properties of wheat. J. Agric. Food Chem., 54: 1256-1264 40 Randhir R., Wattem D. Shetty K. 2004. Solid- state bioconversion of fava bean by Rhizopus oligosporus for enrichment of phenolic antioxidants and L-DOPA. Innov. Food Sci. Emerg., 5(2): 235-244 12
miękkości, to charakteryzowały się one istotnie mniejszą ilością fenoli niż nasiona surowe i produkty tempe. Publikacja 3 Celem prac przedstawionych w tej publikacji była modyfikacja wartości odżywczej tempe z lędźwianu i poprawa jego cech sensorycznych. Substrat główny fermentacji modyfikowano wprowadzając do niego nasiona słonecznika w ilości 1/5, 2/5 i 3/5, czyli 20, 40 i 60% wagowo. Ziarna słonecznika zostały wybrane głównie ze względu na zawartość tłuszczu, ponieważ same nasiona lędźwianu są niskotłuszczowe. W doświadczeniu opisanym w tej i w kolejnych publikacjach do fermentacji w podłożu stałym wybrano nasiona lędźwianu odmiany średnioziarnistej Krab, ponieważ tempe z nich otrzymany charakteryzował się wyższym potencjałem antyoksydacyjnym niż tempe z odmiany Derek (publikacja 2). Produkt fermentacji samych nasion lędźwianu odznaczał się niską zawartością tłuszczu, 12 g/kg s.m. Wprowadzenie nasion słonecznika do głównego substratu fermentacji skutkowało wzrostem zawartości tłuszczu ogólnego. Poziom lipidów oznaczony w produkcie o udziale słonecznika wynoszącym 40% był zbliżony do tempe z soi (340 g/kg s.m.). Zmianie zawartości tłuszczu towarzyszyła też zmiana profilu kwasów tłuszczowych. Wzrastał udział wielonienasyconych kwasów tłuszczowych z 52 (tempe z lędźwianu) do 60%, a równocześnie stosunek kwasów n-6 do n-3 ulegał korzystnemu obniżeniu (z 18:1 do 16:1), choć nadal był istotnie wyższy od optymalnego dla diety dorosłego człowieka, wynoszącego 1:1 do 4:1 41. Należało więc poszukiwać innego źródła tłuszczu, którego wprowadzenie jako kosubstratu w procesie fermentacji znacząco poprawiłoby ten parametr. Tempe z nasion odmiany Krab otrzymane w opisywanym doświadczeniu zawierało ponad 330 g/kg s.m. białka, którego 47% było biodostępne w warunkach in vitro. Dodatek słonecznika spowodował istotne obniżenie poziomu białka w tempe (od 15 do 25%), ale zasadniczo nie wpłynął na ilość rozpuszczalnego białka uwalnianego podczas trawienia. Oznaczało to, że zastosowanie słonecznika jako kosubstratu znacząco poprawia biodostępność białka z produktów fermentacji (do 62% przy 40% udziale słonecznika). Zawartość Leu, Val, Thr oraz sumy aminokwasów siarkowych w białku tempe z samych nasion lędźwianu była 41 Simopoulos A.P. 2002. Dossier: Polyunsaturated fatty acids in biology and diseases. The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids. Biomed. Pharmacother., 56: 365-379 13
nieco niższa niż w białku referencyjnym (publikacja 3, tabela 5). Można jednakże przyjąć, że tylko pod względem zawartości Leu białko to nie odpowiadało rekomendacjom FAO (publikacja 4, tabela 4). Tempe otrzymane z substratu zawierającego 40% nasion słonecznika charakteryzowało się znacznie większą ilością aminokwasów egzogennych w porównaniu z produktem standardowym. Największa różnica uwidoczniła się w sumie Met i Cys, która była dwukrotnie większa niż w białku tempe z lędźwianu. Tempe sporządzone z mieszanego substratu było oceniane pod względem organoleptycznym wyżej niż produkt z samego lędźwianu przez nietrenowany panel (ogólna akceptowalność w pięciostopniowej skali odpowiednio 4,3 i 3,6). Publikacje 4 i 5 Celem doświadczeń opisanych w tych dwóch publikacjach było określenie możliwości wykorzystania produktu odpadowego, jakim są wytłoki lniane otrzymywane po tłoczeniu oleju na zimno, do modyfikowania wartości odżywczej oraz potencjału antyoksydacyjnego tempe z nasion lędźwianu. Zastosowanie makuchu lnianego jako składnika żywności może być alternatywnym sposobem zagospodarowania tego produktu odpadowego. Do fermentacji nasion lędźwianu wybrano Rhizopus microsporus var. chinensis (poprzednio stosowana nazwa R. oligosporus spt3), kierując się wynikami prac opisanych w publikacji Starzyńska- Janiszewska i in. 42. Kosubstratem fermentacji były wytłoki otrzymane z lnu odmiany ciemnonasiennej. Zawierały one 15% tłuszczu, o typowym dla wysokolinolenowych odmian lnu profilu kwasów tłuszczowych oraz 26% białka charakteryzującego się 70% biodostępnością szacowaną w warunkach trawienia in vitro. Wytłoki wprowadzano do głównego substratu fermentacji w ilości od 5 do 35% wagowo. Dodatek makuchu lnianego, podobnie jak ziaren słonecznika, powodował istotny wzrost zawartości tłuszczu całkowitego w produkcie fermentacji. Tempe zawierające 35% wytłoków charakteryzowało się prawie trzykrotnie wyższym poziomem lipidów niż produkt otrzymany z samego lędźwianu. Ponownie zmianie zawartości tłuszczu towarzyszyła znacząca modyfikacja profilu kwasów tłuszczowych. Wzrost ilości wytłoków w substracie fermen- 42 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Duliński R., Mickowska B. 2012. The influence of inoculum composition on selected bioactive and nutritional parameters of grass pea tempeh obtained by mixed-culture fermentation with Rhizopus oligosporus and Aspergillus oryzae strains. Food Sci. Technol. Int., 18: 113-122 14
tacji korespondował z obniżeniem poziomu kwasów nasyconych, a także linolowego i n-6 linolenowego w puli kwasów tłuszczowych tempe. Zarazem produkty otrzymane z mieszanego substratu charakteryzowały się znacząco wyższym udziałem procentowym kwasu n-3 linolenowego, odpowiednio od 3,6 do 10 razy w przypadku 5% i 35% dodatku wytłoków w porównaniu z tempe standardowym. Skutkowało to wzrostem procentowego udziału wielonienasyconych kwasów w puli kwasów tłuszczowych, maksymalnie do 64% (35% dodatek wytłoków) oraz korzystną zmianą stosunku kwasów n-6 do n-3. W przypadku tempe z najmniejszym udziałem wytłoków (5%) stosunek ten wynosił 2,5:1, a w przypadku największego dodatku makuchu (35%)- 0,5:1. Wprowadzenie więc wytłoków lnianych do substratu fermentacji, który stanowiły nasiona lędźwianu pozwoliło otrzymać produkt o stosunkowo niskiej zawartości tłuszczu (maksymalnie 56 g/kg s.m.) i bardzo korzystnym składzie nienasyconych kwasów tłuszczowych. Zawartość białka w tempe standardowym wynosiła ok. 300 g/kg s.m., białko to było strawne w niemal 70% w warunkach in vitro. Dane te różnią się nieco od zaprezentowanych w publikacji 3. Należy jednak wziąć pod uwagę, że w omawianym doświadczeniu do fermentacji nasion wzięto inny szczep, który mógł wpływać nie tylko na ogólny poziom białka, ale także na jego biodostępność szacowaną metodami in vitro. Dodatek wytłoków lnianych do substratu fermentacji nie skutkował znaczącymi zmianami w zawartości i strawności białka otrzymanych produktów. Można stwierdzić, że wszystkie tempe, z wyjątkiem zawierającego najmniejszą ilość wytłoków (5%) charakteryzowały się zbliżonym poziomem protein o bardzo podobnej biodostępności, ok. 70%. Poziom aminokwasów egzogennych białka tempe standardowego był zgodny (Leu) lub wyższy od normy rekomendowanej przez FAO. Dodatek wytłoków (15-35%) powodował obniżenie zawartości Lys i Leu nieznacznie poniżej poziomu białka wzorcowego. Z drugiej strony wprowadzenie makuchu do substratu fermentacji skutkowało korzystnymi zmianami w profilu aminokwasów (stosunek Lys/Arg, suma Arg, Glu i His, poziom aminokwasów siarkowych). Zmiany te w jakiejś mierze mogą warunkować działanie bioaktywne produktów z dodatkiem wytłoków lnianych. Tempe zawierające wytłoki lniane charakteryzowało się istotnie wyższym (od 20 do 80%) poziomem związków fenolowych rozpuszczalnych w wodzie niż produkt standardowy. Wzrost ilości fenoli związany ze zmianą składu substratów fermentacji był skorelowany z aktywnością antyrodnikową i siłą redukującą. Istotne współczynniki korelacji Pearsona wskazują na silną zależność badanych parametrów. Ekstrakty wodne uzyskane z tempe z do- 15
datkiem makuchu wykazywały większą zdolność wygaszania kationorodnika ABTS, od 50 (5% dodatek) do ponad 100% (35% dodatek). Stosunkowo niewielki (15%) dodatek wytłoków lnianych powodował również maksymalny wzrost potencjału zmiatania rodnika hydroksylowego, objawiający się obniżeniem efektywnej dawki IC50 o ponad 20%. Produkty wzbogacone w wytłoki wykazywały dodatkowo większą siłę redukcji jonów Fe 3+. Wskaźnik RP0,5 zmierzony dla ekstraktu wodnego z tempe o 35% udziale makuchu był o 40% niższy w porównaniu z tempe standardowym. Wprowadzenie wytłoków lnianych do głównego substratu przyczyniło się również do wzrostu zawartości fenoli ekstrahowanych mieszaniną wody i acetonu (1:1, v:v) w produktach fermentacji. W tempe zawierającym makuch oznaczono od 0,5 (5% dodatek) do 3,7 razy (35% dodatek) więcej tych związków niż w tempe standardowym. Obserwowane zmiany były więc jeszcze bardziej spektakularne niż w przypadku fenoli rozpuszczalnych w wodzie. Poziom fenoli w badanych ekstraktach był ponownie wysoko skorelowany z aktywnością antyrodnikową i siłą redukującą. Dodatek wytłoków lnianych do nasion lędźwianu spowodował istotny wzrost (1,5 10 razy) aktywności ekstraktów wodno- acetonowych względem stabilnego rodnika DPPH. Ekstrakty z produktów zawierających wytłoki charakteryzowały się również większą siłą redukującą. Dawka efektywna wyrażona w postaci RP0,5 była ponad trzykrotnie niższa w tempe z 35% udziałem wytłoków niż w tempe standardowym. Ponownie dała się zauważyć prawidłowość, że związki reagujące z odczynnikiem Folina-Ciocalteu obecne w standardowym tempe łatwiej przechodzą do wody niż do ekstrahenta zawierającego rozpuszczalnik organiczny, w tym przypadku aceton. Prawidłowość ta uległa zmianie w przypadku produktów wzbogaconych w makuch lniany, który stanowił nośnik fenoli w większym stopniu rozpuszczalnych w fazie organicznej. Natomiast aktywność względem stabilnych syntetycznych rodników, wyrażana w postaci ekwiwalentów troloksu była niezależnie od rodzaju produktu wyższa dla ekstraktów wodnych niż wodno-acetonowych. Publikacja 6 Wyniki przedstawione w publikacjach 4 i 5 pozwalały stwierdzić, że wytłoki lniane mogą być interesującym kosubstratem fermentacji tempe z nasion lędźwianu, wzbogacającym finalny produkt przede wszystkim w związki o aktywności antyoksydacyjnej. Powstało więc pytanie, czy nie można by otrzymać z wytłoków lnianych, na drodze fermentacji w podłożu 16
stałym z wykorzystaniem pleśni z rodzaju Rhizopus, produktu o potencjale funkcjonalnego składnika żywności wnoszącego do niej związki bioaktywne. Fermentację wytłoków lnianych prowadzono z udziałem dwóch szczepów R. oligosporus, znanego z poprzednich prac - DSM 1964 oraz ATCC 64063, który znalazł szczególne zastosowanie w fermentacji substratów wysokoskrobiowych, np. zbóż 43. Ponadto proces prowadzono w dłuższym niż standardowo czasie (od 2 do 6 dni), aby zbadać, w jakim stopniu przedłużanie fermentacji może wpłynąć na zmianę składu chemicznego, a przede wszystkim potencjału antyoksydacyjnego surowca. Wytłoki lniane wykorzystane w doświadczeniu zawierały 28 g/100 g s.m. białka. Ich fermentacja z udziałem szczepów DSM 1964 i ATCC 64063 skutkowała niewielkim wzrostem poziomu protein, maksymalnie dziesięcioprocentowym. Znaczne zmiany dotyczyły natomiast zawartości tłuszczów. R. oligosporus DSM 1964 powodował stopniowe obniżenie poziomu lipidów, finalnie o 42% po 144 h fermentacji. W przypadku szczepu ATCC 64063, już po 96 h fermentacji oznaczono o 64% mniej tłuszczów w porównaniu z substratem, co wskazuje jednoznacznie na różnice w aktywności metabolicznej obu szczepów. Podobnie jak w poprzednich doświadczeniach (publikacje 2 i 5), w celu oznaczenia związków fenolowych oraz zbadania ich aktywności antyrodnikowej materiał poddawano ekstrakcji stosując różne ekstrahenty co pozwalało na uzyskanie pełniejszego obrazu potencjału antyoksydacyjnego otrzymanych produktów fermentacji. Porównując ilość fenoli oznaczoną w środowisku wodnym oraz w wodno- acetonowym, można stwierdzić, że związki te, niezależnie od typu surowca lepiej rozpuszczały się w fazie organicznej. W przypadku wytłoków przygotowanych do szczepienia oznaczono 8,5 mg kwasu galusowego/g s.m. w ekstrakcie wodno- acetonowym oraz 3,6 mg/g s.m. w ekstrakcie buforowym. Zgodnie z oczekiwaniami fermentacja w podłożu stałym spowodowała wzrost poziomu fenoli rozpuszczalnych. Zawartość tych związków w ekstraktach wodno- acetonowych po 48 h fermentacji z udziałem szczepów DSM 1964 i ATCC 64063 była odpowiednio o 13 i 71% wyższa niż w substracie. W przypadku fermentacji szczepem DSM największą ilość fenoli oznaczono po 96 h inkubacji (o 23% wyższą w porównaniu z substratem), podczas gdy dla szczepu ATCC po 72 h fermentacji (o 78% wyższą w porównaniu z substratem). W jeszcze większym stopniu widoczne 43 Berg S., Olsson J., Swanberg M., Schnurer J., Eriksson A. 2007. Method for the production of fermented whole grain barley with Rhizopus, and product thereof. European Patent 1363505 B1 17
były względne zmiany w poziomie fenoli rozpuszczalnych w wodzie. W ich przypadku odnotowano 40 i 86% wzrost po 48 h fermentacji odpowiednio szczepem DSM i ATCC. Przedłużenie inkubacji do 144 h spowodowało dalszą akumulację tych związków, szczególnie widoczną dla szczepu ATCC. W produkcie otrzymanym z jego udziałem oznaczono ponad dwukrotnie więcej fenoli rozpuszczalnych w wodzie w porównaniu z substratem. Fermentacja w podłożu stałym skutkowała także znaczącym wzrostem aktywności przeciwrodnikowej analizowanego materiału. Dawki efektywne EC50 wyznaczone w metodzie z rodnikiem DPPH były niższe od EC50 surowca maksymalnie o 60% dla 72 h fermentacji szczepem ATCC i 144 h fermentacji szczepem DSM. Warto podkreślić, że w przypadku wytłoków lnianych zarówno substrat, jak i produkty fermentacji wykazywały zdecydowanie wyższą aktywność względem rodnika DPPH niż ABTS +. Ponadto potencjał neutralizacji kationorodnika ABTS mierzony dla ekstraktów buforowych był w wysokim stopniu skorelowany w zawartością związków fenolowych (r= -0,84), podczas gdy dla aktywności względem DPPH badanej w ekstraktach wodno-acetonowych wyznaczono zdecydowanie niższy współczynnik korelacji (-0,58) z poziomem fenoli. Dane te wskazują na istnienie synergizmu między związkami rozpuszczalnymi w 50% acetonie, który przełożył się na wysoki potencjał antyrodnikowy tych ekstraktów. Proces fermentacji spowodował również wzrost zdolności do zmiatania rodnika hydroksylowego. Ponieważ aktywność wygaszania OH była wysoce skorelowana z poziomem fenoli (r= -0,95), dla produktów otrzymanych z udziałem szczepu ATCC wyznaczono niższe dawki efektywne niż dla szczepu DSM. Fermentacja spowodowała także wzrost siły redukującej otrzymanych produktów. Większą zdolność do redukcji Fe 3+ oznaczono dla ekstraktów wodno-acetonowych i materiału otrzymanego po fermentacji szczepem ATCC. Wytłoki lniane przygotowane do inokulacji oraz produkty otrzymane po 48 i 96 h fermentacji oboma szczepami R. oligosporus poddano trawieniu in vitro, w warunkach symulujących układ pokarmowy człowieka. Do tego doświadczenia wybrano próbki otrzymane po 2 dobach fermentacji, ponieważ już po tym czasie widoczny był pozytywny wpływ procesu na mierzone parametry bioaktywne. Wydłużenie z kolei inkubacji o dodatkowe dwie doby skutkowało znaczącą poprawą aktywności antyoksydacyjnej. Biodostępność białka z substratu wynosiła ok. 40%. Proces fermentacji obniżył ją tylko w niewielkim stopniu (od 3 do 8%), pomimo znaczącego wzrostu zawartości fenoli rozpuszczalnych. Obserwacje te można po- 18
przeć poprzednimi doniesieniami, w których stwierdzono, że obecność związków fenolowych w niewielkim tylko stopniu wpływa na strawność białka 44. Ilość związków fenolowych oznaczona w dializatach otrzymanych po trawieniu fermentowanego makuchu była o ok. 10% wyższa niż po trawieniu surowca niefermentowanego. Znacząco wyższa (nawet o 60%) była też zdolność takiego dializatu do wygaszania DPPH. W celu oceny, czy wytłoki lniane fermentowane przez R. oligosporus mogą być stosowane jako funkcjonalny składnik żywności, wykonano pilotażowe doświadczenie wykorzystując materiał otrzymany po 96 h fermentacji szczepem ATCC 64063. Produkt ten wytypowano, ponieważ wykazywał najwyższy wypadkowy potencjał antyoksydacyjny. Dodatek zliofilizowanego makuchu do jogurtu w ilości 10 g/100 g ś.m. skutkował dwukrotnym zwiększeniem poziomu białka oraz 20% wzrostem ilości białka rozpuszczalnego uwalnianego do dializatu podczas trawienia in vitro. Ponadto stwierdzono, że dializaty po trawieniu jogurtu wzbogaconego w fermentowany makuch były o 40% bardziej aktywne względem rodnika DPPH niż w przypadku samego jogurtu. Wnioski W wyniku fermentacji typu tempe można otrzymać z nasion lędźwianu produkt charakteryzujący się niższym poziomem neurotoksyny ODAP, inhibitorów trypsyny i fitynianów, odpowiednio o 93, 99 i 22%, od wyjściowego substratu. Fermentowane i gotowane konwencjonalnie (do miękkości) nasiona lędźwianu charakteryzowały się zbliżoną jakością. Produkt tempe zawierał jednak znacznie mniejszą ilość neurotoksyny, co jest obiecujące w kontekście alternatywnego wykorzystania tej mało popularnej rośliny strączkowej. Fermentacja nasion lędźwianu z udziałem szczepu Rhizopus oligosporus DSM 1964 skutkowała znacząco wyższą aktywnością względem wolnych rodników w porównaniu z nasionami surowymi i ugotowanymi do miękkości. Spośród dwóch polskich odmian lędźwianu siewnego, odmiana Krab i tempe z niej otrzymane miały wyższy potencjał antyoksydacyjny. 44 Salgado P.R., Drago S.R., Molina Ortiz S.E., Petruccelli S., Andrich O., González R.J., Mauri A.N. 2012. Production and characterization of sunflower (Helianthus annuus L.) protein-enriched products obtained at pilot plant scale. LWT- Food Science and Technology, 45: 65-72 19
Kofermentacja lędźwianu i słonecznika w porównaniu do fermentacji samego lędźwianu pozwala otrzymać produkt o korzystniejszym profilu NKT, lepszej strawności białka, zawierającego wszystkie egzogenne aminokwasy w ilościach zgodnych lub wyższych niż w białku wzorcowym i odznaczający się wyższą akceptowalnością wśród konsumentów. Wytłoki lniane mogą być interesującym kosubstratem fermentacji typu tempe nasion roślin strączkowych poprawiającym znacząco profil aminokwasów, stosunek kwasów tłuszczowych n-6: n-3 oraz zawartość fenoli i potencjał antyoksydacyjny produktu. Nasiona lędźwianu oraz produkty ich fermentacji i kofermentacji inaczej niż wytłoki lniane i produkty ich fermentacji są bardziej aktywne względem rodnika ABTS niż DPPH. Związki fenolowe nasion lędźwianu i produktów ich fermentacji są lepiej rozpuszczalne w ekstraktach wodnych, podczas gdy fenole z wytłoków lnianych łatwiej przechodzą do fazy organicznej. Fermentacja wytłoków lnianych z udziałem R. oligosporus skutkowała wzrostem zawartości fenoli, co przekładało się na poprawę potencjału antyoksydacyjnego i tylko w niewielkim stopniu wpływało na biodostępność białka. Dodatek przefermentowanych wytłoków lnianych do jogurtu powodował wzrost zawartości białka oraz zwiększenie potencjału antyoksydacyjnego. Przefermentowane wytłoki lniane mogą stanowić potencjalnie korzystny dodatek do żywności. Ze względu na interesujące wyniki doświadczenia opisanego w publikacji 6 będę w najbliższej przyszłości kontynuować badania nad wykorzystaniem przefermentowanych wytłoków lnianych jako funkcjonalnego składnika żywności. Plany obejmują analizowanie efektów wprowadzenia zliofilizowanych wytłoków do różnych produktów spożywczych (np. sera śmietankowego, płatków śniadaniowych) pod kątem wyboru takiej ilości, która z jednej strony zapewni oczekiwaną poprawę potencjału bioaktywnego, a z drugiej pozwoli otrzymać produkt o akceptowalnym smaku i wyglądzie. Badania będą opierały się na doświadczeniach in vitro, obejmujących symulację całego przewodu pokarmowego człowieka, tak by można było ocenić skutki fermentacji produktów zawierających makuch w okrężnicy. Rozważana 20
jest też możliwość wykorzystania do fermentacji wytłoków innych jadalnych pleśni znanych z tradycyjnych produktów azjatyckich. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo badawczych Problematyka pozostałych badań, w których brałam udział obejmowała następujące zagadnienia: 1) Zastosowanie enzymów do defosforylacji pasz dla drobiu; 2) Ocena możliwości zastosowania kwasu fitynowego jako dodatku do żywności; 3) Charakterystyka izolatów białek z nasion lędźwianu siewnego; 4) Fermentacja nasion roślin strączkowych z wykorzystaniem bakterii kwasu mlekowego oraz innych niż Rhizopus pleśni; 5) Zastosowania fermentacji typu tempe w przetwarzaniu pseudozbóż; 6) Enzymatyczna ekstrakcja pektyny z wytłoków jabłkowych. Ad. 1. W początkowym okresie mojej pracy zostałam włączona w badania realizowane w Katedrze Biotechnologii Żywności AR w Krakowie, dotyczące wzbogacenia pasz dla drobiu w enzymy fosforolityczne, w celu poprawienia wykorzystania fosforu fitynowego. Byłam w tym czasie wykonawcą w projekcie badawczym NR 6 P06E 052 20 pt. Efekty żywieniowe różnicowania stopnia konwersji fitynianów przy zmiennych poziomach defosforylacji pasz. Kwas fitynowy i jego sole, fityniany, powszechnie występują w tkankach roślinnych i produktach pochodzenia roślinnego. Związek ten wykazuje silne właściwości chelatujące. Wiążąc jony różnych metali, ogranicza ich dostępność w przewodzie pokarmowym człowieka i zwierząt. Ponadto obniża strawność białek, skrobi i lipidów. Wprowadzanie enzymów fosforolitycznych (fitaza A, fitaza B- niespecyficzna kwaśna fosfomonoesteraza) do paszy dla drobiu ma na celu poprawę biodostępności fosforu fitynowego, składników mineralnych, poprawę strawności białek, a także obniżenie zawartości fosforanów w odchodach. Paszę wzbogacano w fitazę A w dawkach od 0 do 1 000 FTU/kg i fitazę B w dawkach od 0 do 6400 ACPU/kg. Wykazano, że fitaza A wpływa asymptotycznie na stopień defosforylacji (DL) paszy i konwersję kwasu fitynowego (CD). Z kolei fitaza B wywiera pozytywny efekt na DL tylko przy niskich dawkach fitazy A (do 250 FTU/kg), natomiast powoduje wzrost stopnia konwersji fitynianów niezależnie od dawki fitazy A. W doświadczeniu żywieniowym 3- fitaza A i 6- fitaza A w dawce 750 FTU/kg miały zbliżony wpływ na wzrost broj- 21
lerów, mineralizację kości oraz retencję P i Ca. Podczas gdy fitaza B wspomagała pobieranie paszy, wzrost masy ciała oraz mineralizację kości i retencję P, ale nie Ca. W warunkach wyższego stopnia konwersji kwasu fitynowego (większe dawki fitazy B) 3-fitaza A miała znacznie większy wpływ na wydajność brojlerów niż 6-fitaza A, ale ograniczała retencję Ca 45 46 47. Stopnień konwersji kwasu fitynowego wyraża się jako procent fosforu uwolnionego z paszy, który przechodzi do dializatu podczas trawienia w warunkach in vitro. Innym sposobem pomiaru CD mógłby być wzrost stężenia wolnego mio-inozytolu. Znane są dwie metody pomiaru stężenia mio-inozytolu. Metoda mikrobiologiczna z wykorzystaniem Saccharomyces cerevisie ATCC 9080 nadaje się szczególnie do oznaczenia inozytolu, który jako wolny przechodzi do dializatu w warunkach trawienia in vitro. Druga z metod, chromatografia jonowymienna z detekcją amperometryczną, HPAEC-PAD, bardziej nadaje się do pomiaru całkowitej zawartości inozytolu w materiale roślinnym 48. Ad. 2. Kwas fitynowy ze względu na swoje właściwości jest zaliczany do składników przeciwżywieniowych. Związek ten może z drugiej strony pełnić rolę efektywnego przeciwutleniacza, ponieważ jest w stanie formować nieaktywne w reakcji Fentona kompleksy z żelazem. Badano wpływ dodatku kwasu fitynowego w stężeniu od 0,1 do 5 mm na stabilność oksydacyjną zmielonego mięsa wołowego i wieprzowego przechowywanego w temperaturze chłodniczej. IP6 efektywnie obniżał akumulację związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym. Ponadto hamował w stopniu zależnym od dawki utlenianie mioglobiny w surowym mięsie wieprzowym. Wpływ dodatku kwasu fitynowego uwidocznił się w większym stopniu w przypadku przechowywania mięsa gotowanego niż surowego oraz w przypadku wołowiny niż wieprzowiny 49. 45 Żyła K., Mika M., Stodolak B., Wikiera A., Koreleski J., Świątkiewicz S. 2004. Towards complete dephosphorylation and total conversion of phytates in poultry feeds. Poultry Science, 83: 1175-1186. 46 Żyła K., Koreleski J., Mika M., Stodolak B., Świątkiewicz S., Wikiera A. 2003. Complete dephosphorylation and total conversion of phytates in maize- soybean feeds fed to broilers. 14 th European Symposium on Poultry Nutrition. 10-14 sierpnia 2003r., Lillehammer, Norwegia. 47 Żyła K., Mika M., Stodolak B., Koreleski J., Świątkiewicz S. 2004. Changes in dephosphorylation level and in phytate conversion degree studied in turkey poults. XXII World s Poultry Congress. 8-13 czerwca 2014r., Stambuł, Turcja. 48 Duliński R., Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Żyła K. 2011. Comparison of high-performance ion chromatography technique with microbiological assay of myo-inositol in plant components of poultry feeds. Journal of Animal and Feed Sciences, 20: 143-156. 49 Stodolak B., Starzyńska A., Czyszczoń M., Żyła K. 2007. The effect of phytic acid on oxidative stability of raw and cooked meat. Food Chemistry, 101: 1041-1045. 22
Ad. 3. Niekorzystne zmiany jakości produktów żywnościowych często zachodzą na skutek procesów oksydacyjnych powiązanych z aktywnością wolnych rodników. W celu zapobiegania tym zmianom stosuje się syntetyczne albo naturalne antyoksydanty. Źródłem związków o tym potencjale mogą być m.in. izolaty białkowe pozyskiwane z nasion roślin strączkowych. Izolaty wykorzystuje się jako składniki żywności zwykle ze względu na ich wysoką wartość odżywczą i właściwości funkcjonalne. Z nasion polskich odmian lędźwianu siewnego Krab i Derek pozyskiwano izolaty stosując metodę strącania białka z alkalicznych ekstraktów w pi 50 51. Izolaty otrzymano z nasion surowych, moczonych i kiełkowanych przez 1 do 5 dni. Izolaty z nasion surowych zawierały 95 (Krab) lub 83% (Derek) białka, którego strawność szacowana metodą in vitro wynosiła 83%. Z kolei w izolatach z pięciodniowych kiełków oznaczono ok. 85% białka, charakteryzującego się ponad 90% biodostępnością mimo istotnie wyższej aktywności inhibitorów trypsyny. Ponadto izolat ze skiełkowanych nasion odmiany Krab charakteryzował się korzystniejszym składem aminokwasowym w porównaniu z wyjściowym surowcem. Pozytywna zmiana dotyczyła szczególnie aminokwasów siarkowych, których suma w białku wyizolowanym z surowych nasion stanowiła 67% poziomu wzorca FAO, natomiast w przypadku białka z kiełków aż 95%. Izolat z nasion surowych wykazywał działanie prooksydacyjnie w metodzie polegającej na oznaczeniu pierwotnych produktów indukowanej peroksydacji kwasu linolowego. W tej samej metodzie izolaty z nasion moczonych i krótko kiełkowanych charakteryzowały się całkowitą aktywnością antyoksydacyjną na poziomie kilku procent. Natomiast białka pozyskane z pięciodniowych kiełków ograniczały już utlenianie kwasów tłuszczowych o 15% (odmiana Derek), a nawet o 25% (odmiana Krab). Co więcej posiadały one też istotnie większą zdolność chelatowania jonów Fe 2+ (o 40% odmiana Derek i o 81% odmiana Krab) w porównaniu z nasionami surowymi. 50 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Mickowska B. 2010. The effect of germination on antioxidant and nutritional parameters of protein isolates from grass pea (Lathyrus sativus) seeds. Food Science and Technology International, 16(1): 73-78. 51 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B. 2007. Protein isolates from grass pea (Lathyrus sativus) seeds as potential food additives - estimation of antioxidant and nutritional parameters. Zborník referátových a posterových príspevkov z XXI. vedeckej konferencie Cudzorodé Látky v Požívatinách. 24 26 września 2007r., Štrebské Pleso, Słowacja. 23
Otrzymane wyniki upoważniają do rozważenia możliwości zastosowania izolatów białkowych z pięciodniowych kiełków lędźwianu odmiany Krab jako dodatku do żywności ograniczającego peroksydację nienasyconych kwasów tłuszczowych. Ad. 4. Wśród wielu procesów stosowanych w celu poprawy wartości odżywczej nasion roślin strączkowych, fermentacja jest uznawana za jeden z najbardziej efektywnych. Można fermentować całe nasiona, stosując typ grzybowej lub mieszanej bakteryjno- grzybowej fermentacji w podłożu stałym, albo w postaci mąki, wykorzystując bakteryjną fermentację zanurzeniową. Najbardziej popularnym typem procesu zanurzeniowego w przypadku nasion roślin strączkowych jest naturalna albo kontrolowana fermentacja z udziałem bakterii mlekowych. Mąkę z nasion lędźwianu poddano fermentacji mlekowej, stosując 5 lub 10% (v/v) dodatek inokulum zawierającego Lactobacillus plantarum DSM 20174 52 53. Dwudziestoczterogodzinna fermentacja skutkowała obniżeniem poziomu neurotoksyny β-odap (ok. 10%) i inhibitorów trypsyny (ok. 20 i 30%, odpowiednio dla odmiany Derek i Krab) w stosunku do wartości oznaczonych w nasionach surowych. Obserwowano również efektywną eliminację zawartości fitynianu w przetwarzanej mące. Z drugiej strony proces prowadzony przez L. plantarum spowodował znaczną akumulację fenoli rozpuszczalnych. W przefermentowanej mące oznaczono dwukrotnie (odmiana Krab, 5% inokulum), a nawet czterokrotnie (odmiana Derek, 10% inokulum) więcej tych związków niż w wyjściowych nasionach. Zaszczepienie zawiesiny mąki z nasion lędźwianu mniejszą ilością bakterii mlekowych (5% inokulum) umożliwiło otrzymanie produktu fermentacji o lepszej jakości niż w przypadku zastosowania większej ilości bakterii (10% inokulum). Z uwagi na to, że stosowany w omówionych pracach szczep L. plantarum DSM 20174 wykazał zdolności z jednej strony do eliminowania związków przeciwżywieniowych, z drugiej do akumulacji fenoli, wykorzystano go w kolejnych doświadczeniach, których celem było otrzymanie produktu tempe z niełuskanych nasion fasoli kolorowej- Małopolanki. 52 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B. 2011. Effect of inoculated lactic acid fermentation on antinutritional and antiradical properties of grass pea (Lathyrus sativus Krab ) flour. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 61(4): 245-249. 53 Stodolak B., Starzyńska-Janiszewska A. 2007. Effect of inoculated lactic acid fermentation on the level of antinutrients in grass pea. Zborník referátových a posterových príspevkov z XXI. vedeckej konferencie Cudzorodé Látky v Požívatinách. 24 26 września 2007r., Štrebské Pleso, Słowacja. 24
Tempe tradycyjnie wytwarza się z nasion łuskanych. Wykorzystanie nasion całych, z okrywami, do fermentacji w podłożu stałym może być z kolei pożyteczne, jeśli celem tego procesu jest otrzymanie produktu o wysokim potencjale antyoksydacyjnym. Modyfikacja produkcji tempe z nasion fasoli nie polegała tylko na tym, że fermentowano nasiona niełuskane. Oprócz, w zasadzie standardowego tempe, otrzymano też produkt z nasion uprzednio poddanych kontrolowanej fermentacji mlekowej (L. plantarum DSM 20174 wprowadzano na etapie moczenia nasion) oraz produkt z nasion szczepionych mieszanym inokulum, zawierającym zarówno zarodniki R. microsporus var. chinensis jak i komórki L. plantarum 54. Fermentacja z udziałem bakterii kwasu mlekowego (niezależnie od etapu ich wprowadzania) skutkowała otrzymaniem produktu o istotnie wyższej (ok. 20%) zawartości białka charakteryzującego się również większą biodostępnością (ok. 6%) w porównaniu z tempe standardowym. Ponadto w tempe otrzymanym po równoczesnej fermentacji kulturą Rhizopus i Lactobacillus oznaczono zdecydowanie mniej oligosacharydów wzdęciogennych (odpowiednio 30, 24 i 64% mniej dla rafinozy, stachiozy i werbaskozy) oraz tanin skondensowanych (o 20% mniej) niż w produkcie standardowym. Fermentacja następcza (bakteryjna na etapie moczenia, właściwa z udziałem jedynie pleśni) była natomiast mniej efektywna w eliminowaniu tych antyodżywczych związków niż typowy proces. Wykazano również, że tempe standardowe i otrzymane w wyniku fermentacji mieszanej charakteryzowały się podobnym poziomem fenoli rozpuszczalnych w 80% acetonie, wyższym w porównaniu z produktem fermentacji następczej. Jednocześnie produkt fermentacji mieszanej przewyższał typowe tempe pod względem aktywności antyoksydacyjnej. Fermentacja tempe z równoczesnym udziałem R. microsporus var. chinensis oraz Lactobacillus plantarum DSM 20174 niełuskanej fasoli Małopolanki skutkowała otrzymaniem produktu o większym potencjale antyoksydacyjnym niż nasiona ugotowane do miękkości 55. W tempe oznaczono podobną jak w nasionach gotowanych konwencjonalnie ilość fenoli rozpuszczalnych w wodzie, ale więcej flawonoidów i fenoli rozpuszczalnych w 80% acetonie. 54 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Mickowska B. 2014. Effect of controlled lactic acid fermentation on selected bioactive and nutritional parameters of tempeh obtained from unhulled common beans (Phaseolus vulgaris) seeds. Journal of the Science of Food and Agriculture, 94: 359-366. 55 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Wikiera A. 2015. Antioxidant potential and α-galactosides content of unhulled seeds of dark common beans subjected to tempe-type fermentation with Rhizopus microsporus var. chinensis and Lactobacillus plantarum. Food Science and Technology Research, 21(6): 765-770. 25
Większa ilość związków fenolowych przełożyła się też na zdecydowanie wyższą aktywność antyrodnikową i siłę redukującą oznaczoną dla ekstraktów z produktu tempe. Ponadto proces fermentacji prowadzony równocześnie przez pleśń i bakterie mlekowe był bardziej skuteczny w eliminowaniu oligosacharydów wzdęciogennych. W tempe oznaczono dwa razy mniej stachiozy i werbaskozy oraz trzy razy mniej rafinozy niż w ugotowanych nasionach. Można stwierdzić, że zmodyfikowana fermentacja tempe stanowi obiecującą i ciekawą metodę przetwarzania nasion niełuskanej fasoli Małopolanki. Zagadnieniem, które wyniknęło w toku prac nad przetwarzaniem nasion roślin strączkowych w produkt tempe, była potencjalna możliwość zastosowania do fermentacji w podłożu stałym pleśni Aspergillus oryzae. W tradycyjnej produkcji tempe skład mikroflory jest złożony, podczas gdy w procesach prowadzonych w warunkach laboratoryjnym materiał zwykle zaszczepia się pojedynczą kulturą pleśni. Możliwe jest jednakże stosowanie kultur mieszanych, zawierających nie tyle bakterie, o czym była mowa w poprzednio opisanych pracach, ale inne pleśnie. Aspergillus oryzae jest gatunkiem wykorzystywanym w tradycyjnych fermentacjach azjatyckich typu koji. Szczepy A.oryzae wykazują wysoką aktywność enzymatyczną, szczególnie amylo- i proteolityczną, które są bardzo istotne przy produkcji sosu sojowego i miso. Nasiona lędźwianu siewnego odmiany Krab, przygotowane według standardowej procedury (moczenie, łuskanie, gotowanie) szczepiono inokulum zawierającym połowę lub całą dawkę zarodników R. microsporus var. chinesis wzbogacaną w połowę lub całą dawkę A. oryzae DSM 1861 56. Celem doświadczenia było określenie wpływu jedoczesnej fermentacji obiema pleśniami na jakość otrzymanego tempe. Okazało się, że tempe uzyskane w wyniku fermentacji nasion zaszczepionych równocześnie pełną dawką R. microsporus i połową dawki A. oryzae charakteryzował się znacznie lepszymi parametrami niż produkt standardowy (w tym przypadku inokulum złożone jedynie z całej dawki zarodników R. microsporus). W tempe otrzymanym z udziałem Aspergillus oznaczono wyższy o 70% poziom fenoli, a w efekcie większą o 70% aktywność względem rodnika DPPH, niż w typowym produkcie fermentacji monokulturowej. Produkt ten charakteryzował się również zdecydowanie naj- 56 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Duliński R., Mickowska B. 2012. The influence of inoculum composition on selected bioactive and nutritional parameters of grass pea tempeh obtained by mixed-culture fermentation with Rhizopus oligosporus and Aspergillus oryzae strains. Food Science and Technology International, 18(2): 113-122. 26
większą zawartością witamin z grupy B, spośród wszystkich przebadanych wariantów fermentacji. Poziom tiaminy był czterokrotnie, a ryboflawiny pięćdziesięciosześciokrotnie wyższy niż w nasionach przygotowanych do szczepienia. Szacowana metodą in vitro biodostępność białka była najwyższa w przypadku tempe uzyskanego w wyniku równoczesnej fermentacji całą dawką Rhizopus i połową dawki Aspergillus i nie różniła się statystycznie istotnie od wartości wyznaczonej dla substratu, co zasługuje na podkreślenie, ponieważ fermentacja grzybowa nasion lędźwianu siewnego zwykle skutkuje obniżeniem strawności białka. Ponadto fermentacja typu tempe, którą prowadzono z udziałem szczepu A. oryzae była bardziej efektywna w eliminacji neurotoksyny β-odap niż fermentacja jedynie szczepem Rhizopus. Oba wykorzystane w poprzednim doświadczeniu szczepy pleśni wykazywały podobną dynamikę produkcji proteaz podczas 32 h fermentacji nasion lędźwianu 57. Grzyby te produkowały przede wszystkim kwaśne proteazy o optimum ph 3,0. Aktywność proteolityczna oznaczona w przypadku R. microsporus var. chinensis po 24 i 32 h trwania procesu była znacząco większa w porównaniu z A. oryzae DSM 1861, co równocześnie znalazło odzwierciedlenie w wyznaczonych stopniach hydrolizy białka. Szczepienie nasion lędźwianu mieszanym inokulum zawierającym zarodniki A. oryzae w dawce mniejszej lub równej ilości wprowadzonych zarodników R. microsporus skutkowało otrzymaniem produktu tempe charakteryzującego się wyższą biodostępnością białka, o nieco wyższym stopniu hydrolizy oraz zawierającego większą ilość wolnych aminokwasów. Na podstawie naszych badań można stwierdzić, że równoczesna fermentacja szczepami R. microsporus oraz A. oryzae wpływa pozytywnie na jakość produktu tempe. Problemem staje się jednak wyznaczenie precyzyjnych stosunków obu pleśni w inokulum, którym zaszczepia się substrat. Wydaje się, że do ustalenia odpowiednich dawek zarodników niezbędna jest równoczesna ocena ich żywotności, co z kolei może stanowić duże utrudnienie przy standaryzacji metody. Ad. 5. Substratem fermentacji była gryka nieprażona, jedno z pseudozbóż. Nasiona gryki są źródłem bezglutenowych białek o dobrze zbilansowanym składzie aminokwasów, błonnika pokarmowego i różnych związków bioaktywnych. Zwykle gryka jest przetwarzana do postaci 57 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Wikiera A. 2015. Proteolysis in tempeh-type products obtained with Rhizopus and Aspergillus strains from grass pea (Lathyrus sativus) seeds. Acta Scientiarum Polonorum: Technologia Alimentaria, 14(2): 125-132. 27
mąki, albo poddawana prażeniu. Nieprażona kasza, choć dostępna na rynku, jest zdecydowanie mniej popularna. Wyniki doświadczeń zostały opublikowane w jednym artykule 58 i w trzech doniesieniach na konferencje 59 60 61. Nieprażona gotowana kasza gryczana zawierała dwa razy więcej białka, ale o 16% niższej biodostępności w porównaniu z prażoną. Natomiast tempe otrzymane w wyniku fermentacji nieprażonej gryki z udziałem R. oligosporus ATCC 64063 charakteryzowało się zwiększoną o 65% zawartością białka o porównywalnej strawności w stosunku do gotowanej kaszy prażonej. Zawartość poszczególnych aminokwasów egzogennych w produkcie fermentacji przewyższała wzorzec FAO. Ponadto tempe zawierało też większą ilość aminokwasów siarkowych i aromatycznych niż ugotowane kasze. Charakteryzowało się również zdecydowanie większą ilością ryboflawiny i tiaminy. Produkt fermentacji wykazywał też zdecydowanie wyższy potencjał antyoksydacyjny niż oba rodzaje ugotowanej gryki. Wynikało to przede wszystkim z obecności zdecydowanie większej ilości fenoli rozpuszczalnych (od 20-55% więcej w porównaniu z gryką nieprażoną, od 95-157% więcej w porównaniu z gryką prażoną), która w wysokim stopniu korelowała zarówno z aktywnością antyrodnikową, jak i zdolnością do redukcji jonów żelaza. Reasumując, z nieprażonej kaszy gryczanej można otrzymać tempe, czyli wygodny produkt spożywczy o korzystnej wartości odżywczej i potencjale antyoksydacyjnym, dobrze wypadający w testach sensorycznych. W ocenie trenowanego panelu tempe z niesolonej gryki uzyskało średni wynik 4 w pięciostopniowej skali ogólnej akceptowalności. Ad. 6. Pektyny to polisacharydy roślinne wykorzystywane w przemyśle spożywczym jako składniki żelujące w produkcji dżemów i galaretek, zagęszczacze, emulgatory i stabilizatory w produkcji margaryn, majonezów oraz zastępniki tłuszczów w produkcji lodów i słodyczy. Zwykle pozyskuje się je na skalę przemysłową z wytłoków jabłkowych albo skórek owoców 58 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Duliński R., Bączkowicz M., Mickowska B., Wikiera A., Byczyński Ł. 2016. Effect of solid-state fermentation tempe-type on antioxidant and nutritional parameters of buckwheat groats, as compared to hydrothermal processing. Journal of Food Processing and Preservation, 40(2): 298-305. 59 Duliński R., Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Byczyński Ł. 2014. Zastosowanie chromatografii jonowej w analizie biodostępności fosforanów mio-inozytolu w produktach fermentowanych z gryki i komosy. Identyfikacja i ocena żywności o gwarantowanej wysokiej jakości. 18 listopada 2014r., Poznań. 60 Duliński R., Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Byczyński Ł. 2015. Application of ion chromatography in profile analysis of myo-inositol phosphates from fermented buckwheat seeds. XIX Międzynarodowa konferencja Laboralim 2015 o analytických metódach v potravinárstve, 5-6 marca 2015r., Gabčíkovo, Słowacja. 61 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Bączkowicz M., Wikiera A., Mika M. 2015. Bioactive parameters of buckwheat tempe as compared to roasted and cooked groats. Biologically active compounds in food. 15-16 października 2015r., Łódź. 28
cytrusowych stosując ekstrakcję kwasową (ph 1,5-3,0, temp. 70-100 o C). Celem badań było wskazanie bardziej przyjaznej środowisku, alternatywnej metody ekstrakcji pektyn z wykorzystaniem tanich wieloaktywnościowych preparatów enzymatycznych oraz dopracowanie precyzyjnej metody oznaczania składu otrzymanych polisacharydów. Wykazano, że dokładne oznaczenie ilościowe poszczególnych monosacharydów neutralnych oraz kwasu galakturonowego w pektynach izolowanych metodą enzymatyczną z wytłoków jabłkowych musi być poprzedzone dwuipółgodzinną hydrolizą polisacharydu w obecności 2 M TFA prowadzoną w różnych temperaturach. W celu zbadania profilu monosacharydów hydrolizę należy prowadzić w 100 o C, natomiast do określenia ilości kwasu galakturonowego- w 120 o C. Warunki te minimalizują błędy oznaczenia wynikające z jednej strony z dużej podatności monosacharydów na degradację w środowisku kwasowym w wyższych temperaturach, z drugiej zaś z dużej oporności kwasu poligalakturonowego na hydrolizę w niższej temperaturze. Precyzyjny rozdział metodą HPLC monosacharydów obecnych w pektynie osiągnięto stosując kolumnę CarboPac PA 20 w temp. 20 o C i 2,5 mm NaOH jako fazę ruchomą (0,5 ml/min). Natomiast do efektywnego, szybkiego oznaczenia kwasu galakturonowego wykorzystano kolumnę HyperCarb w 55 o C, stosując 0,05% TFA (1 ml/min) jako eluent 62 63. Wydajność ekstrakcji pektyny z wytłoków jabłkowych prowadzonej z udziałem preparatu Celluclast 1.5L w dawkach od 25 do 75 μl/g surowca była porównywalna lub wyższa o ok. 4% od wydajności konwencjonalnej izolacji kwasowej. Zastosowanie enzymatycznej ekstrakcji pozwoliło otrzymać polimery zróżnicowane pod względem masy, stopnia estryfikacji, zawartości kwasu galakturonowego i cukrów neutralnych oraz aktywności biologicznej. Nawet najniższa dawka preparatu Celluclast spowodowała izolację pektyny z wydajnością odpowiadającą metodzie kwasowej. Pektyna ta równocześnie zawierała istotnie mniejszą ilość glukozy stanowiącej zanieczyszczenie, a znacznie większą ilość arabinozy i fukozy, monocukrów typowych dla frakcji RGI i RGII. Ponadto otrzymany polimer charakteryzował się wyższym o 14% poziomem kwasu galakturonowego, wyższym o 8% stopniem estryfikacji oraz posiadał kilkukrotnie większą aktywność względem stabilnych rodników (ABTS 62 Wikiera A., Mika M., Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B. 2015. Development of complete hydrolysis of pectins from apple pomace. Food Chemistry, 172(1): 675-680. 63 Wikiera A., Mika M., Duliński R., Stodolak B. 2015. Application of HPLC technique in pectin analysis. XIX Międzynarodowa konferencja Laboralim 2015 o analytických metódach v potravinárstve, 5-6 marca 2015r., Gabčíkovo, Słowacja. 29
i DPPH) niż polimer otrzymany metodą konwencjonalną. Wykazano również, że pektyna wyizolowana z wytłoków jabłkowych z udziałem wyższych dawek preparatu skutecznie hamowała proliferację i migrację komórek nowotworu okrężnicy 64 65. Najważniejszym procesem podczas enzymatycznej izolacji pektyny z wytłoków jabłkowych wydaje się dezintegracja ksylanów. Nawet przy zastosowaniu monoaktywnościowego preparatu endo-ksylanazy można uzyskać prawie całkowitą ekstrakcję pektyny oraz kwasu poligalakturonowego z surowca. Polimer otrzymany na tej drodze charakteryzował się bardzo dużą masą cząsteczkową, wynikającą prawdopodobnie częściowo z obecności mannanów, glukanów, białek oraz fenoli. Odznaczał się także bardzo wysokim stopniem metylacji (73%), nieosiągalnym podczas konwencjonalnej kwasowej ekstrakcji pektyny jabłkowej. Mniej istotnym czynnikiem dla izolacji pektyny z wytłoków jabłkowych jest hydroliza celulozy. Jakkolwiek polimer otrzymany po zastosowaniu monoaktywnościowej endo-celulazy charakteryzował się wysokim poziomem kwasu galakturonowego i stopniem metylacji 66. 6. Podsumowanie działalności naukowo-badawczej Całkowita liczba publikacji, których jestem współautorką wynosi 34, z czego 16 stanowią oryginalne prace twórcze opublikowane w czasopismach posiadających współczynnik wpływu- Impact Factor (4 z nich stanowi część osiągnięcia naukowego). Kolejnych 6 prac oryginalnych ukazało się w recenzowanych czasopismach nieposiadających współczynnika wpływu (z czego 2 stanowią część osiągnięcia naukowego). Wartość mojego dotychczasowego dorobku naukowego, liczonego zgodnie z podanymi zasadami (punkty za pracę z roku jej wydania) wynosi 442 punktów MNiSW (z czego 107 przypada na osiągnięcie naukowe), a łączny IF to 27,186. Liczba cytowań (z wyłączeniem autocytowań) według bazy Web of Science to 107, a indeks Hirscha to 4. Szczegółowy spis wszystkich publikacji znajduje się w załączniku nr 6. Wyniki badań, w których brałam udział były tez prezentowane na konferencjach krajowych (4 komunikaty) i międzynarodowych (10 komunikatów). 64 Wikiera A., Mika M., Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B. 2015. Application of Celluclast 1.5L in apple pectin extraction. Carbohydrate Polymers, 134: 251-257. 65 Wikiera A., Mika M., Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Babicz A. 2015. Antioxidant and anticancer properties of apple pectin. Biologically active compounds in food. 15-16 października 2015r., Łódź. 66 Wikiera A., Mika M., Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B. 2016. Endo-xylanase and endo-cellulase- assisted extraction of pectin from apple pomace. Carbohydrate Polymers, http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2016.01.063. 30
Tabelaryczne zestawienie dorobku Liczba publikacji Punktacja według roku publikacji Przed doktoratem Po doktoracie MNiSW IF Publikacje naukowe 16 399 27,186 w czasopismach znajdujących się w bazie JCR Publikacje w czasopismach 1 5 43 - spoza listy JCR Doniesienia opublikowane w 12 - - materiałach konferencyjnych Suma 1 33 442 27,186 31