MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 85-92 1 Anna Midak-Siewirska 1, Karolina Karabin 2, Emilia Chudzik 2, Tomasz Dzieciątkowski 1, Maciej Przybylski 1, Anna Majewska 1, Mirosław Łuczak 1, Grażyna Młynarczyk 1 ZASTOSOWANIE TECHNIKI REAL-TIME PCR DO WYKRYWANIA DNA LUDZKIEGO WIRUSA OPRYSZCZKI TYPU 1 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny Kierownik: prof. dr hab. G. Młynarczyk 2 Wydział Rolnictwa i Biologii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego Kierownik: dr hab. G. Garbaczewska Celem pracy było zaprojektowanie i zbadanie użyteczności metody real-time PCR do diagnostyki zakażeń ludzkim wirusem opryszczki typu 1, zwłaszcza u pacjentów poddanych immunosupresji oraz z zakażeniami ośrodkowego układu nerwowego. Zakażenia wirusem opryszczki typu 1 (HSV-1, HHV-1) (2) należą do najpowszechniejszych chorób o etiologii wirusowej i występują na całym świecie (16). Do zakażenia dochodzi w wyniku bezpośredniego kontaktu, podczas gdy wrota zakażenia stanowi błona śluzowa lub uszkodzona skóra. Poza zakażeniami w obrębie jamy ustnej takimi jak: zmiany pęcherzykowe okolic ust i innych części twarzy (11), HSV-1 może uczestniczyć w toczących się schorzeniach przyzębia (1). Wirus ten może również być czynnikiem etiologicznym wielu przypadków zapalenia mózgu, zarówno u osób immunokompetentnych (4), jak i nosicieli HIV (6). Badania z terenów Polski wskazują, że typ 1 wirusa opryszczki jest wariantem dominującym w przypadkach wystąpienia zakażeń narządów płciowych, zwłaszcza wśród młodych kobiet (8), u których może prowadzić do utraty ciąży w pierwszym trymestrze (5). Po pierwotnym zakażeniu, wirus zwykle ustala stan latencji w zwojach trójdzielnych lub lędźwiowo-krzyżowych (16). Przez lata złotym standardem w diagnostyce zakażeń opryszczkowych była izolacja i namnażanie wirusa w hodowlach komórkowych, głównie w diploidalnych komórek HEL oraz ustalonej linii Vero (7). Materiałem stosowanym do zakażania mogą być płyn pęcherzowy, wymazy z powierzchni zmian skórnych oraz próbki tkanek (7). Uzyskany płyn może zostać użyty zarówno jako materiał do izolacji DNA, jak i do zakażenia hodowli komórkowych. Obecnie rutynowo w diagnostyce zakażeń HSV-1/2 stosuje się głównie metody biologii molekularnej, przede wszystkim reakcję łańcuchowej polimeryzacji (PCR). Tradycyjne 1 Praca była współfinansowana z programu 1M20/W2/2009 Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego.
86 A. Midak-Siewirska i inni Nr 1 testy PCR służyły głównie do jakościowego badania obecności wirusa (10) i stopniowo zastępowane są przez metody ilościowe, jak real-time PCR (qpcr), który ze względu na swą wysoką czułość oraz szybkość wykonania stał się najlepszym testem w diagnostyce zakażeń HSV-1/2 (15). Badania takie mają ogromne znaczenie u pacjentów z niedoborami immunologicznymi, w przypadkach neuroinfekcji oraz przy monitorowaniu skuteczności terapii przeciwwirusowej (13,14). Celem pracy było opracowanie i optymalizacja metody PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania DNA ludzkiego wirusa opryszczki typu 1, określenie jej czułości analitycznej oraz porównanie z testem komercyjnym, jako metodą odniesienia. MATERIAŁ I METODY Do jakościowych badań techniką real-time PCR (określenie swoistości reakcji) użyto całogenomowego DNA wyizolowanego ze standardowego szczepu McIntyre ludzkiego wirusa opryszczki typu 1 (ATCC nr. VR-539). Jako kontrolę ujemną wykorzystano DNA wyekstrahowane z niezakażonej linii Vero, zaś za kontrolę specyficzności reakcji posłużył DNA izolowany z: wirusa opryszczki typu 2 (HSV-2), wirusa cytomegalii (CMV), wirusa Epsteina-Barr (EBV) oraz ludzkiego adenowirusa typu 7 (HAdV). Określenie czułości metody wykonano z zastosowaniem seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń wzorcowego DNA HSV-1 w jałowej, redestylowanej wodzie w zakresie od 10 0 do 10-6 (50-0,00005 ng/µl). Zakres ten, ustalony przy zastosowaniu komercyjnego testu HSV-1/2 LC PCR Kit (Artus/ Qiagen ), odpowiadał 4,35x10 5-4,00x10 1 kopii/ml. W celu opracowania starterów i sondy do metody real-time PCR wykorzystano sekwencję DNA dostępną w internetowej bazie danych GenBank (AB 297670), kodującego specyficzną wirusową glikoproteinę G (gg). Zaprojektowane do niej, z użyciem oprogramowania LightCycler Probe Design (Roche Diagnostics ), startery amplifikują fragment genomu o długości 100 par zasad (Tabela I). Dodatkowo celem zwiększenia specyficzności reakcji zastosowano zaprojektowaną sondę fluorescencyjną typu TaqMan wyznakowaną na końcu 5 fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym JOE oraz wygaszaczem BHQ-1 na końcu 3 (Oligo ). Tabela I. Sekwencje użytych w doświadczeniach starterów i sondy Nazwa Sekwencja (5 3 ) HHV-1_A ATC CAC ACC TTA TCG TTT TTG T HHV-1_B CGT AAC GCA CGC TAG GGT HHV-1_JOE JOE GGC GGT TGG TCC AGA CGC BHQ1 Badania techniką real-time PCR wykonywano w aparacie LightCycler 2.0 z użyciem zestawu amplifikacyjnego LightCycler TaqMan Master (Roche Diagnostics ). Mieszanina reakcyjna zawierała 5 µl DNA; 2,25 µm starterów HHV-1_A oraz HHV-1_B oraz 150 nm sondy HHV-1-JOE w końcowej objętości 20 µl. PCR rozpoczynał się etapem aktywacji (hotstart) termostabilnej DNA polimerazy przez 10 min w temp. 95 0 C, po którym następowało 40 cykli składających się z denaturacji 10 s w temp. 95 0 C, przyłączania starterów przez 10 s w 60 0 C oraz wydłużania nici w temperaturze 72 0 C przez 5 s. Reakcję kończyło schłodzenie próbek do temp. 40 0 C na 60 sekund. Odczyt fluorescencji odbywał się przy długości fali
Nr 1 Real-time PCR w wykrywaniu wirusa opryszczki 87 560 nm, typowej dla fluoroforu JOE. Wzrost poziomu fluorescencji był proporcjonalny do ilości produktu w mieszaninie. Materiał do badań stanowiło 15 izolatów z hodowli komórkowych, pochodzących z kolekcji szczepów Katedry i Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej WUM oraz 20 próbek surowicy krwi, pobranych od pacjentów z Kliniki Hematologii i Onkologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego z lat 2008-2009. Izolację DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics ), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta, zawieszając wyizolowany DNA w końcowej objętości 35 µl buforu elucyjnego. Użyte do opisywanych doświadczeń próbki kliniczne zostały uprzednio zbadane komercyjnym testem ilościowym. Wszystkie opisane powyżej badania prowadzono w trzykrotnych, niezależnych powtórzeniach. WYNIKI Przy badaniu specyficzności opracowanej reakcji real-time PCR wynik dodatni, wyrażony wykładniczym przyrostem fluorescencji mieszaniny reakcyjnej, osiągnięto tylko w próbce zawierającej materiał genetyczny ludzkiego wirusa opryszczki typu 1. W pozostałych próbkach, zawierających kontrolne DNA niezakażonej linii Vero, wirusa opryszczki typu 2, wirusa cytomegalii, wirusa Epsteina-Barr oraz adenowirusa typu 7, nie zaobserwowano fluorescencji, co wskazuje na brak w nich swoistej amplifikacji kwasu nukleinowego. Obserwacja taka poczyniona dla próbek zawierających materiał genetyczny innych wirusów świadczy o wysokiej specyficzności metody (Ryc. 1). Ryc. 1. Wynik reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania ludzkiego wirusa opryszczki typu 1. Krzywa oznaczona HSV-1 oznacza amplifikację DNA wirusa opryszczki typu 1. Wykres K (-) to kontrola ujemna (DNA izolowane z niezakażonej linii Vero), zaś wykresy: HSV-2, CMV, EBV oraz HAdV oznaczają kontrole specyficzności reakcji.
88 A. Midak-Siewirska i inni Nr 1 Podczas określania zakresu czułości metody technika real-time PCR umożliwiała wykrycie użytych rozcieńczeń DNA HSV-1 zakresie od 10 0 do 10-5 (Ryc.2). Nie wykryto natomiast rozcieńczenia DNA 10-6, jednak odpowiada ono wiremii na poziomie kilku kopii na mililitr badanego materiału (Ryc. 2). Podobnie otrzymana krzywa kalibracyjna wykazywała wysoki współczynnik liniowości, co świadczy o dobrej precyzji zaprojektowanej metody (Ryc. 3). Ryc. 2. Badanie czułości metody real-time PCR w kierunku wykrywania HSV-1. Poszczególne krzywe oznaczają amplifikację DNA seryjnych rozcieńczeń szczepu McIntyre w zakresie od 10 0 do 10-6. K (-) to kontrola ujemna reakcji: DNA izolowane z niezakażonej linii Vero. Ryc. 3. Krzywa kalibracyjna fluorescencji metody real-time PCR w kierunku wykrywania DNA HSV-1. Poszczególne punkty na krzywej oznaczają fluorescencję seryjnych rozcieńczeń HSV-1 w zakresie od 10 0 do 10-5. Opisane powyżej próbki kliniczne oraz izolaty z hodowli komórkowych poddano opracowanej reakcji real-time PCR z użyciem sondy fluoroscencyjnej TaqMan. Wzrost poziomu fluorescencji barwnika reporterowego JOE, będący następstwem przyrostu ilości produktu w mieszaninie oraz degradacji sondy TaqMan zaobserwowano we wszystkich próbkach zawierających DNA izolowane ze szczepów wirusa namnożonych w hodowli komórkowej oraz
Nr 1 Real-time PCR w wykrywaniu wirusa opryszczki 89 w 8 próbkach materiału klinicznego. Pozostałe 12 próbek surowic nie zawierało sekwencji DNA typowych dla ludzkiego wirusa opryszczki typu 1, o czym świadczy brak przyrostu fluorescencji. Dodatnie wyniki badań stwierdzono więc w 23 z 35 (65,7%) badanych próbek DNA. Identyczne wyniki osiągnięto przy użyciu testu HSV-1/2 LC PCR Kit, co świadczy o wysokiej wartości diagnostycznej nowo opracowanej metody (Tabela II). Tabela II. Porównanie wyników uzyskanych za pomocą opracowanej metody i komercyjnego testu odniesienia Nr Próbka Wynik uzyskany opracowaną metodą real-time PCR Wynik uzyskany testem komercyjnym (Artus/Qiagen) 1. Izolat komórkowy 1 (+) (+) 2. Izolat komórkowy 2 (+) (+) 3. Izolat komórkowy 3 (+) (+) 4. Izolat komórkowy 4 (+) (+) 5. Izolat komórkowy 5 (+) (+) 6. Izolat komórkowy 6 (+) (+) 7. Izolat komórkowy 7 (+) (+) 8. Izolat komórkowy 8 (+) (+) 9. Izolat komórkowy 9 (+) (+) 10. Izolat komórkowy 10 (+) (+) 11. Izolat komórkowy 11 (+) (+) 12. Izolat komórkowy 12 (+) (+) 13. Izolat komórkowy 13 (+) (+) 14. Izolat komórkowy 14 (+) (+) 15. Izolat komórkowy 15 (+) (+) 16. Surowica 1 (-) (-) 17. Surowica 2 (+) 1100 kopii/ml (+) 1280 kopii/ml 18. Surowica 3 (+) 2500 kopii/ml (+) 2750 kopii/ml 19. Surowica 4 (-) (-) 20. Surowica 4 (-) (-) 21. Surowica 6 (+) 2100 kopii/ml (+) 1840 kopii/ml 22. Surowica 7 (-) (-) 23. Surowica 8 (-) (-) 24. Surowica 9 (-) (-) 25. Surowica 10 (-) (-) 26. Surowica 11 (-) (-) 27. Surowica 12 (-) (-) 28. Surowica 13 (-) (-) 29. Surowica 14 (-) (-) 30. Surowica 15 (+) 700 kopii/ml (+) 860 kopii/ml 31. Surowica 16 (+) 3400 kopii/ml (+) 3670 kopii/ml 32. Surowica 17 (+) 300 kopii/ml (+) 260 kopii/ml 33. Surowica 18 (+) 11700 kopii/ml (+) 12350 kopii/ml 34. Surowica 19 (+) 500 kopii/ml (+) 720 kopii/ml 35. Surowica 20 (-) (-)
90 A. Midak-Siewirska i inni Nr 1 DYSKUSJA Wirus opryszczki pospolitej jest ważnym patogenem człowieka, odpowiedzialnym za zakażenia występujące na całym świecie. Charakter zakażenia, predyspozycja do nawrotów, intensywność zmian oraz przebieg choroby zależą od funkcjonowania układu immunologicznego gospodarza, zarówno od odpowiedzi humoralnej jak i komórkowej (12,16). Ze względu na coraz większe rozpowszechnienie we współczesnej medycynie zabiegów przeszczepiania zarówno komórek krwiotwórczych, jak i narządów unaczynionych, coraz większą rolę zaczęła odgrywać diagnostyka wirusowych zakażeń potransplantacyjnych (14). Zakażenia u pacjentów poddanych immunosupresji są najczęściej wynikiem reaktywacji latentnego wirusa i charakteryzują się poważniejszym przebiegiem: bolesne zmiany chorobowe są rozległe i trudne do leczenia, obserwuje się także nietypową lokalizację zmian. Rutynowo stosowane podawanie leków immunosupresyjnych prowadzi do zaburzenia funkcji komórek efektorowych układu odpornościowego, odpowiedzialnych za obronę ustroju przed zakażeniami wirusowymi (9). Objawowe zakażenia spowodowane przez wirusa opryszczki obserwuje się u znacznego odsetka chorych przyjmujących leki immunosupresyjne, a ich częstość waha się od 18 do 53% (9). Wiremia prowadzi często do rozsianego zakażenia, obejmującego procesem chorobowym wiele narządów wewnętrznych (3), co może prowadzić do nasilonej reakcji ogólnoustrojowej i śmierci pacjentów. Rokowanie jest tym bardziej niepomyślne, kiedy zakażenie przebiega bez typowych zmian skórnych, a pierwsze objawy przedstawiają obraz charakterystyczny dla zakażenia ogólnoustrojowego, co ma miejsce w 10% przypadków. Opóźnienie w postawieniu prawidłowej diagnozy i rozpoczęciu leczenia powoduje, że odsetek zgonów przekracza 65% (3). Ograniczona czułość stosowanych testów serologiczych, powiązana z koniecznością wczesnego zastosowania leczenia przeciwwirusowego zmusiła do rozpowszechnienia w diagnostyce poprzeszczepowej metod biologii molekularnej (9,14). Konwencjonalne testy PCR mają zbyt niską czułość, co wskazuje na konieczność używania metod real-time PCR w monitorowaniu poziomu DNA herpeswirusów u pacjentów z immunosupresją. Ich wielokrotnie opisywana i podkreślana wysoka czułość gwarantuje wykrycie zakażeń pierwotnych lub reaktywacji wirusa przy niskim poziomie wiremii (14). Dostępność półilościowych lub ilościowych metod monitorowania wiremii HSV-1 może więc znacząco ułatwić szybką diagnostykę zakażenia, a w konsekwencji prawidłowe postępowanie terapeutyczne. A.Midak-Siewirska, K.Karabin, E.Chudzik, T. Dzieciątkowski, M. Przybylski, A.Majewska, M. Łuczak, G. Młynarczyk APPLICATION OF REAL-TIME PCR ASSAY FOR INVESTIGATING THE PRESENCE OF HERPES SIMPLEX VIRUS TYPE 1 DNA SUMMARY Herpes simplex virus type 1 is a member of the Alphaherpesviridae subfamily, as it can infect both skin and nerves and develop latent infection within the dorsal root and trigeminal ganglia. Infection with this virus is common and causes a wide range of clinical syndromes. Although HSV-1
Nr 1 Real-time PCR w wykrywaniu wirusa opryszczki 91 infect healthy children and adults, disease is more severe and extensive in the immunocompromised individuals. The goal of the study was development of real-time PCR assay for detection of herpes simplex virus type 1 DNA in clinical samples, using primers targeting a conserved region of the viral DNA glycoproteine G gene and a specific TaqMan hydrolyzing probe. The analytical sensitivity of assay was tested using serial dilutions of HSV-1 DNA in range between 10 0 and 10-6 (4,35x10 5-4,00x10 1 copies/ml). Fifteen cell line isolates and twenty plasma samples taken from a group of adult recipients of allogeneic HSCT were tested for the presence of HSV-1 DNA in the LightCycler system. For comparison commercial quantitative HSV-1/2 LC PCR Kit (Artus/Qiagen) was used, according to the manufacturer s instructions. Both LightCycler assays, including in-house real-time PCR, detected HSV-1 DNA in 23 specimens. The conclusion is that developed TaqMan-based probe real-time PCR test is very reliable and valuable for detection of HSV-1 viremia in different kind of samples. The high level of sensitivity and accuracy provided by the LightCycler instrument is favorable for the use of this method in the detection of herpes simplex virus 1 DNA also in clinical specimens. PIŚMIENNICTWO 1. Bilichodmath S, Mangalekar SB, Sharma DC i inni. Herpesviruses in chronic and aggressive periodontitis patients in an Indian population. J Oral Sci; 2009; 51: 79-86. 2. Davison A, Eberle R, Hayward GS i inni. Herpesviruses. W: Virus taxonomy - classification and nomenclature of viruses. VIIIth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Red. C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff i inni, Elsevier Academic Press, San Diego 2005, 193-212. 3. Herget GW, Riede UN, Schmitt-Gräff A i inni. Generalized herpes simplex virus infection in immunocompromised patient report of a case and review of the literature. Pathol Res Pract; 2005; 201: 123-9. 4. Huppatz C, Durrheim DN, Levi C i inni. Etiology of encephalitis in Australia, 1990-2007. Emerg Infect Dis; 2009; 15: 1359-65. 5. Kapranos NC, Kotronias DC. Detection of herpes simplex virus in first trimetr pregnancy loss using molecular techniques. In Vivo; 2009; ;23: 839-42 6. Li JZ, Sax PE. HSV-1 encephalitis complicated by cerebral hemorrhage in an HIV-positive person. AIDS Read; 2009; 19: 153-5. 7. Madhavan HN, Priya K, Anand AR i inni. Detection of Herpes simplex virus (HSV) genome using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples. Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV. J Clin Virol; 1999; 14: 145-51. 8. Majewska A, Kilijańczyk M, Gajewska M i inni. Identyfikacja wirusów opryszczki pospolitej w materiale pobranym z błony śluzowej narządów płciowych od pacjentek poradni ginekologicznej przy I Katedrze i Klinice Położnictwa i Ginekologii WUM w Warszawie. Gin Prakt; 2009; 17: 17-20. 9. Miller GG, Dummer JS. Herpes simplex and varicella zoster viruses: forgotten but not gone. Am J Transpl; 2007; 7: 741-7. 10. Puchhammer-Stöckl E, Popow-Kraupp T, Heinz FX i inni. Establishment of PCR for the early diagnosis of herpes simplex encephalitis. J Med Virol; 1990; 32: 77-82. 11. Powell HR, Almeyda J. An immunocompetent patient presenting with severe nasal herpes simplex: a case report. Cases J; 2009; 23: 9079. 12. Rebora A. Life-threatening cutaneous viral diseases. Clin Dermatol; 2005; 23: 157-63. 13. Schloss L, Falk KI, Skoog E i inni. Monitoring of herpes simplex virus DNA types 1 and 2 viral load in cerebrospinal fluid by real-time PCR in patients with herpes simplex encephalitis. J Med Virol; 2009; 81: 1432-7.
92 A. Midak-Siewirska i inni Nr 1 14. Watzinger F, Suda M, Preuner S i inni. Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients. J Clin Microbiol; 2004; 42: 189-98. 15. Weidmann M, Meyer-König U, Hufert FT. Rapid detection of herpes simplex virus and varicellazoster virus infections by real-time PCR. J Clin Microbiol; 2003; 41: 1565-8. 16. Whitley RJ, Roizman B. Herpes simplex virus infections. Lancet; 2001; 357: 1513-18. Otrzymano: 27 I 2010 r. Adres Autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny e-mail: annams@wp.pl