ANALIZA TRENDÓW DANYCH MIKROBIOLOGICZNYCH Z ZASTOSOWANIEM KART KONTROLNYCH Konrad Mysiakowski, FSP Galena; Dariusz Danel, Polska Akademia Nauk, Zakład Antropologii we Wrocławiu Wprowadzenie Obowiązujące regulacje zawarte w rozporządzeniu Ministra Zdrowia w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania [1] narzucają zakładom farmaceutycznym rygorystyczne zasady dotyczące monitoringu szeregu parametrów związanych z produkcją i przechowywaniem materiałów wyjściowych, produktów gotowych oraz innych komponentów (np. opakowań) związanych z produkcją farmaceutyczną. Fundamentalnym celem ustalonych regulacji Dobrej Praktyki Wytwarzania (Good Monufacturing Practice, GMP) jest obowiązek zapewnienia maksymalnej jakości procesów produkcyjnych, aby wytwarzane produkty lecznicze nie narażały pacjentów na ryzyko wynikające z niedostatecznego bezpieczeństwa stosowania, nieodpowiedniej jakości lub niedostatecznej skuteczności. Jedną z zalecanych procedur służących realizacji tego celu jest statystyczna analiza danych związanych z parametrami wytwarzania, a w szczególności analiza trendów. Umożliwia ona regularny, a także stały przegląd jakości środowiska produkcji, wody oczyszczonej, mediów pomocniczych (np. gazów) oraz procesów produkcyjnych. W analizowanym okresie czasowym daje możliwość wykrycia pojawiających się stałych tendencji wzrostowych lub spadkowych analizowanej zmiennej bądź też stwierdzenie braku zależności pomiędzy wartościami obserwowanej zmiennej a czasem. Można wyróżnić kilka metod wykrywania prawidłowości w rozpatrywanych danych, które mającą charakter trendów. Metody te różnią się pod względem wykorzystywanych technik analitycznych i obliczeniowych. Jednym z podstawowych narzędzi używanych w analizie trendów są karty kontrolne. Karty kontrolne, wprowadzone po raz pierwszy przez Waltera Shewharta, są stosunkowo prostym narzędziem statystyczno-graficznym służącym do analizy danych pochodzących z procesów przemysłowych. Proces należy rozumieć w ujęciu ogólnym jako uporządkowany w czasie ciąg zmian i stanów zachodzących po sobie. Mogą one dotyczyć szeregu różnych właściwości, takich jak np. zmiany temperatury w czasie, lecz również liczby mikroorganizmów. Każdy z takich procesów cechuje się zmiennością [2, 3, 4]. Głównym celem stawianym przed kartami kontrolnymi jest wykrywanie nielosowych zmian w obserwowanych procesach, które nie wynikają z naturalnej (własnej) zmienności Copyright StatSoft Polska 2014 www.statsoft.pl 3
obserwowanego parametru procesu, lecz z przyczyn specjalnych, niestandardowych, niemożliwych do przewidzenia (np. błędy wynikające z uszkodzenia aparatury pomiarowej) [5]. Karty kontrolne - informacje ogólne Mimo że karty kontrolne opierają się na statystycznych obliczeniach to jednak w swojej użytkowej wersji są graficzną techniką, pozwalającą w prosty i łatwy sposób zaprezentować dane dotyczące analizowanego procesu w odniesieniu do czasu, lub też innej cechy procesu możliwej do chronologicznego uporządkowania (np. kolejnych serii, partii produkcyjnych, numerów analiz itd.). Istnieje wiele typów kart kontrolnych, które są zaprojektowane ze względu na charakter danych, typ stosowanej statystyki, na jakiej oparta jest karta (np. średnia, mediana, rozstęp, odchylenie standardowe), typ decyzji, jaka będzie podejmowana na jej podstawie (np. systematyczny monitoring procesu w celu jego regulacji lub szybkie wykrycie zmian w celu zatrzymania procesu). Mimo różnorodności typów kart istnieją pewne charakterystyczne cechy wspólne związane z ich budową [2, 3, 5]. Ogólna budowa kart kontrolnych Karta kontrolna w podstawowej formie jest wykresem badanej właściwości procesu (oś y) względem tzw. numeru pomiaru lub czasu (oś x). W tak zdefiniowanym układzie współrzędnych nanoszony jest wykres mierzonej cechy, będący krzywą odwzorowującą rejestrowane wartości. Kolejne punkty to albo bezpośrednio zmierzone wyniki (np. liczba CFU), albo średnie z próbek (np. średnia liczba CFU z 5 posiewów mikrobiologicznych) lub inne cechy analizowane przez kartę (np. frakcja wyrobów wadliwych/próbę). Numer pomiaru może być kolejnym numerem przeprowadzonego badania, datą, kolejnym numerem analizowanej serii czy partii badanej substancji itd. Oprócz wykresu mierzonej cechy na karcie kontrolnej znajdują się jeszcze 3 poziome linie: linia centralna oraz po obu stronach linii centralnej górna granica kontrolna oraz dolna granica kontrolna. Ich położenie wyliczane jest (na przykład przez pakiet STATISTICA) z odpowiednich dla danej karty kontrolnej wzorów matematycznych [2, 3, 5]. Zmienność procesu, na której opiera się działanie kart kontrolnych, w sposób formalny określona jest poprzez rozkład danych, który jest statystycznym opisem prawdopodobieństwa występowania poszczególnych wartości (obserwacji) w badanej próbie. Najczęściej spotykane typy kart kontrolnych oparte są na rozkładzie normalnym, rozkładzie dwumianowym i rozkładzie Poissona. Na podstawie typu rozkładu i jego parametrów definiowane są położenia linii centralnej i górnej oraz dolnej granicy kontrolnej [3, 4, 5]. 4 www.statsoft.pl Copyright StatSoft Polska 2014
Ogólna zasada działania kart kontrolnych Ogólna zasada działania i konstruowania karty kontrolnej zostanie przedstawiona na podstawie karty opartej na danych o rozkładzie normalnym. W przypadkach innych rozkładów danych procedura jest podobna, a metody konstrukcji kart tak dopasowane, aby odzwierciedlały ogólną ideę budowy i interpretacji karty. Jak wspomniano powyżej, precyzyjny sposób obliczania położenia linii centralnej jest określony odpowiednimi formułami matematycznymi i zależy od typu karty. Jednak celem uproszczenia wywodu dla niniejszych rozważań można przyjąć, że linia centralna wyznacza wartość średnią ze wszystkich pomiarów i pokazuje wartość, którą średnio przyjmuje badana charakterystyka. Granice kontrolne w większości kart są umieszczone symetrycznie po obu stronach linii centralnej. Odległość od linii centralnej obliczana jest na podstawie miary podobnej do odchylenia standardowego tzw. sigmy (σ). W ujęciu ogólnym sigma uwzględnia zmienność obserwowaną w poszczególnych próbkach i pomiędzy próbkami. W karcie opartej na danych o rozkładzie normalnym sigma może być traktowana jako rodzaj odchylenia standardowego obserwowanego na analizowanym zbiorze danych. Odzwierciedla zatem zmienności procesu. Położenie granic kontrolnych ustalane jest w odległości +/- 3σ w stosunku do linii centralnej. Jak wiadomo, z reguły 6-sigma w rozkładzie normalnym w przedziale +/- 3σ wokół średniej znajduje się 99,73% wszystkich obserwacji. Zmienność obserwowana w tym przedziale jest uznawana za zmienność naturalną (własną) i poza opisanymi przypadkami pojawiania się charakterystycznych konfiguracji punktów na karcie nie powinna budzić wątpliwości. Jeśli krzywa mierzonej cechy (parametru procesu) przebiega pomiędzy granicami kontrolnymi i nie tworzy charakterystycznych nielosowych konfiguracji, proces jest pod kontrolą, przebiega prawidłowo i uznawany jest za stabilny. Ze stabilnymi poziomami zanieczyszczeń mikrobiologicznych mamy do czynienia najczęściej w przypadku zakwalifikowanych systemów i instalacji pomocniczych oraz w przypadku dobrze wykonanej pętli wody oczyszczonej. Zastosowanie odpowiednich materiałów (stal kwasooporna) oraz odpowiedniego sposobu obsługi takich instalacji zwykle zapewnia stały (niski) poziom zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Jeśli jednak wartości kolejnych obserwacji będą wykraczały poza wyznaczone granice kontrolne lub też na wykresie pojawią się charakterystyczne konfiguracje punktów, to jest prawdopodobne, że taka nienaturalna zmienność jest wynikiem zakłóceń specjalnych. W takiej sytuacji konieczna jest szczegółowa analiza merytoryczna przypadku, w celu ewentualnego zidentyfikowania i wyeliminowania przyczyn powstania rozregulowania. Taka sytuacja na przykładzie pętli wody oczyszczonej może się pojawić w sytuacji, gdy dochodzić będzie do formowania się biofilmu bakteryjnego. Strategia budowy kart kontrolnych Analiza i interpretacja procesów za pomocą kart kontrolnych związana jest z zapewnieniem właściwej jakości analizowanych danych. Copyright StatSoft Polska 2014 www.statsoft.pl 5
Głównymi aspektami, na jakie należy zwrócić uwagę, to odpowiednia liczebność prób i częstość ich pobierania [4], [5]. Typowe karty kontrolne opierają się na próbach o równej liczebności (np. dane z powtarzanego cyklicznie pięciokrotnego posiewu takiej samej objętości badanej substancji), jednak inne typy kart umożliwiają analizę danych otrzymywanych z prób o zmiennej liczebności czy nawet analizę danych z pojedynczych obserwacji. Ten ostatni typ konstrukcji kart kontrolnych ma szczególne zastosowanie w analizie trendów danych mikrobiologicznych. Wyniki badań mikrobiologicznych bardzo często są przedstawiane jako wynik pojedynczego pomiaru. Dotyczy to większości danych mikrobiologicznych z zakresu monitoringu warunków wytwarzania (powietrze pomieszczeń czystych, stan higieniczny podłóg, ścian, urządzeń produkcyjnych), badań wody oczyszczonej, mediów pomocniczych (sprężone powietrze, gazy). Częstość pobierania prób zazwyczaj narzucana jest przez przyjęty harmonogram badań. Zwykle w początkowych etapach zakładania kart próby powinny być pobierane z możliwie jak największą częstością, szczególnie jeśli mamy do czynienia z badaniami w ramach kwalifikacji instalacji czy systemu. Warto jednak zauważyć, iż zarówno liczebność prób, jak i częstość ich pobierania to wynik kompromisu pomiędzy chęcią maksymalnej dokładności badań a ponoszonymi kosztami. Procedurę zakładania i prowadzenia kart można podzielić na kilka ogólnych kroków (por. [4] i [5]). Pierwszy z nich obejmuje etap uczenia się karty. Polega on na ustaleniu roboczego położenia linii centralnej i granic kontrolnych, zwykle opartych na niewielkiej puli danych i/lub doświadczeniu analityka. Kolejny krok następuje po zebraniu odpowiedniej liczby danych i polega na przeliczeniu i dopasowaniu roboczych parametrów karty do wartości właściwych dla danego, ustabilizowanego procesu. W trzecim kroku właściwe położenie linii centralnej i granic kontrolnych jest blokowane (nowe dane z procesu nie modyfikują parametrów karty), co umożliwia monitoring procesu i wykrywanie ewentualnych odstępstw od normy. Strategia analizy danych za pomocą kart kontrolnych Analiza danych za pomocą kart kontrolnych jest prosta i intuicyjna. W dużej mierze polega na analizie sporządzonych wykresów. Interpretacja położenia punktów oraz kształtu otrzymanego wykresu (konfiguracji ułożenia punktów) pozwala podjąć decyzję, czy zmienność badanej charakterystyki jest naturalna czy też działają na nią jakieś czynniki specjalne, które należy poddać analizie. Samą procedurę analizy danych można podzielić na dwa etapy. 1. Analiza naruszenia granic kontrolnych polega na zbadaniu, czy któryś z punktów widocznych na wykresie przekracza granice kontrolne. Naturalne pojawienie się wyniku będącego poza granicami kontrolnymi występuje bardzo rzadko. W związku z tym wynik taki sugeruje, że na proces mogły zadziałać czynniki specjalne, które spowodowały rozregulowanie procesu. Taki przypadek często jest spotykany w analizie trendów danych monitoringu warunków wytwarzania (szczególnie powietrza), gdzie na 6 www.statsoft.pl Copyright StatSoft Polska 2014
chwilowe odchylenie poziomu zanieczyszczenia mikrobiologicznego od wartości zwykle obserwowanych ma wpływ wiele czynników, które stosunkowo łatwo mogą zaistnieć (np. przestrzeganie procedur sanitarnych przez personel produkcji, obciążenie mikrobiologiczne materiałów wyjściowych). 2. Wykonanie testów konfiguracji polega na analizie występowania charakterystycznych i ustandaryzowanych w normach konfiguracji punktów wykresu, których prawdopodobieństwo pojawienia się w przypadku procesu ustabilizowanego jest odpowiednio niskie. Zarejestrowanie charakterystycznego układów punktów (zob. [4]) sugeruje działanie czynników specjalnych. Jedna z tych konfiguracji, sześć kolejnych wartości pojawiąjących się w tendencji rosnącej lub malejącej, sygnalizuje występowanie trendu. Ten test konfiguracji znajduje zatem zastosowanie jako jedna z technik analizy trendów i jest szczególnie użyteczny w badaniach mikrobiologicznych. Program STATISTICA generuje wszystkie testy konfiguracji, umożliwiając łatwą i szybką identyfikacje występujących trendów lub rozregulowań badanego parametru. Wybór odpowiednich kart Wybór kart kontrolnych zdeterminowany jest przez rodzaj danych, które będą podlegać analizie. Spora część kart oparta jest na danych, których rozkład nie różni się znacząco od rozkładu normalnego. Niestety w praktyce mikrobiologicznej taki typ rozkładu często jest rzadkością. W takich przypadkach dane można: a) poddać odpowiednim przekształceniom, które matematycznie upodobnią ich rozkład do rozkładu normalnego, b) odpowiednio skorygować stosowane karty lub też c) wykorzystać karty kontrolne, których konstrukcja nie bazuje na rozkładzie normalnym. Ogólnie karty można podzielić na dwie kategorie [5]: Karty kontrolne przy liczbowej ocenie właściwości (np. karta X-R, X-S, IX-MR) opierają się na wartościach pomiarów jednostek będących przedmiotem analizy. Takim typem analizy danych może być ocena czystości mikrobiologicznej produktu leczniczego na przestrzeni określonego czasu (np. gdy liczba przebadanych serii jest odpowiednio duża). Podstawowe założenie w przypadku tych kart dotyczy normalności rozkładu analizowanych danych. Istnieją jednak specjalne procedury, które umożliwiają analizę danych, które nie mają rozkładu normalnego. Karty kontrolne przy alternatywnej ocenie właściwości (np. karta: p, np, c, u) - opierają się na danych pochodzących z obserwacji o charakterze jakościowym. Obserwacje dzieli się na dwie kategorie, np. dobre, złe, jest / nie ma, i nie przeprowadza się bezpośrednio pomiaru badanej właściwości. Zlicza się jedynie, czy dana cecha/niezgodność/wada wystąpiła lub nie, a w niektórych przypadkach analitycznych ile razy. Przykładem takich danych mogą być: fakt stwierdzenia zabarwienia w teście, pojawienia się wzrostu kolonii lub nie, liczba pojemników, które nie przeszły procesu sterylizacji w autoklawie itp. Karty tego typu nie mają założenia o normalności rozkładu danych i oparte są na rozkładzie Bernoullego i Poissona. Copyright StatSoft Polska 2014 www.statsoft.pl 7
Przykład analizy danych za pomocą kart kontrolnych Przedmiotem analizy były dane historyczne powietrza pomieszczeń czystych. Analizowano liczbę drobnoustrojów w jednym metrze sześciennym powietrza (CFU/1m 3 ), oznaczonych w kolejnych, okresowych badaniach mikrobiologicznych. Analizę przeprowadzono za pomocą kart kontrolnych. Do konstruowania kart wykorzystano program STATISTICA. Analiza przeprowadzana była dwuetapowo. W pierwszym, wstępnym etapie dane zebrane w analizowanym pomieszczeniu zostały zbadane pod kątem weryfikacji hipotezy o normalności ich rozkładu. Wyniki analizy wstępnej wskazywały na istotną statystycznie różnicę kształtu rozkładu analizowanych danych i kształtu rozkładu normalnego. Dane (stwierdzone w analizie mikrobiologicznej liczby CFU/m 3 ) poddano transformacji logarytmicznej celem upodobnienia ich do rozkładu normalnego. Ponowna weryfikacja normalności rozkładu transformowanych danych wykazała, iż uzyskany rozkład nie różni się istotnie statystycznie od rozkładu normalnego. Ostateczna analiza danych została więc przeprowadzona za pomocą kart kontrolnych dla pojedynczych obserwacji (dane po transformacji logarytmicznej) i testów konfiguracji. Zamieszczone na wykresach wartości linii centralnej oraz górnych i dolnych linii kontrolnych są wartościami logarytmów naturalnych liczby CFU/m 3. Kryterium akceptacji 200 CFU/m 3 poddane transformacji logarytmicznej wynosiło ln(200 CFU/m 3 ) 5,298 i zostało naniesione na wykres. W wyniku przeprowadzonych analiz statystycznych: ani razu nie stwierdzono przekroczenia ustalonego kryterium akceptacji ln(200 CFU/m 3 ), 8 www.statsoft.pl Copyright StatSoft Polska 2014
ani razu nie stwierdzono przekroczenia górnej granicy kontrolnej, co mogłoby świadczyć o niekontrolowanym wzroście poziomu zanieczyszczeń, przeprowadzone testy konfiguracji wygenerowały jeden sygnał ostrzegawczy o możliwym przesunięciu przeciętnego poziomu zanieczyszczenia; sygnał dotyczył wyników 5 kolejnych analiz przeprowadzonych w okresie od 10.12.2012 do 23.04.2013 i sugerował okresowe zmniejszenie przeciętnego poziomu zanieczyszczenia, co można zaklasyfikować jako sygnał pozytywny. Potwierdzenie tego sygnału wymaga kontroli poziomu zanieczyszczeń w kolejnych badaniach, przeprowadzone testy konfiguracji nie wygenerowały sygnału świadczącego o pojawieniu się trendów w zanieczyszczeniach powietrza w analizowanym czasookresie. Testy konfiguracji Numery obserwacji (daty) 9 obserwacji po tej samej stroni linii centralnej Nie stwierdzono Nie stwierdzono 6 kolejnych obserwacji w trendzie rosnącym/malejącym (analiza trendu) od Nie stwierdzono do Nie stwierdzono 14 obserwacji naprzemiennie w górę i w dół Nie stwierdzono Nie stwierdzono 2 z 3 obserwacji w strefie A lub powyżej Nie stwierdzono Nie stwierdzono 4 z 5 obserwacji w strefie B lub powyżej 10.12.2012 23.04.2013 15 obserwacji w strefie C Nie stwierdzono Nie stwierdzono 8 obserwacji powyżej w strefy C Nie stwierdzono Nie stwierdzono Strefy: A/B/C: 3/2/1 * Sigma Wnioski: Stwierdzony poziom zanieczyszczeń w badanym pomieszczeniu w całym analizowanym czasookresie kształtował się na poziomie nieprzekraczającym ustalonego kryterium akceptacji. W analizowanym czasookresie nie wystąpiły trendy w zmianie poziomu zanieczyszczeń. Możliwość trwałego obniżenia przeciętnego poziomu zanieczyszczeń wymaga potwierdzenia wynikami kolejnych badań. Podsumowanie Karty kontrolne są prostą i szybką techniką pozwalającą analizować dane uzyskiwane w rutynowych analizach laboratoryjnych. Połączenie w kartach kontrolnych stosunkowo nieskomplikowanego aparatu statystycznego oraz technik analizy graficznej pozwala na intuicyjną i sprawną interpretację wyników. Zastosowanie komputerowych technik wspomagania analiz danych takich, jakie oferuje pakiet STATISTICA (wraz z modułem Przegląd Jakości Produktu), przyczynia się do automatyzacji i zwiększania precyzji i efektywności Copyright StatSoft Polska 2014 www.statsoft.pl 9
pracy analityka. Zalety te znacznie ułatwiają sprostanie zaleceniom dotyczącym statystycznej analizy danych, sformułowanym w zapisach GMP. Technikę analizy trendów z zastosowaniem kart kontrolnych z powodzeniem można zastosować w trakcie analizy danych mikrobiologicznych z: kwalifikacji instalacji wody oczyszczonej, kwalifikacji instalacji pomocniczych (powietrze sprężone, azot), kwalifikacji pomieszczeń czystych, analizy danych historycznych w ramach okresowego Przeglądu Jakości Produktu. Literatura 1. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 1 października 2008 w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania z późniejszymi zmianami (Dz. U. z 2008. Nr 184 poz. 1143 z późn. zm.). 2. Montgomery, D.C. Introduction to statistical quality control, 6 th ed., John Wiley & Sons, Inc, 2009. 3. PN-ISO 7870 Karty kontrolne Ogólne wytyczne i wprowadzenie, PKN, Warszawa 2006. 4. PN-ISO 8258+AC1 Karty kontrolne Shewharta, PKN, Warszawa 1996. 5. Greber T. Statystyczne sterowanie procesami doskonalenie jakości z pakietem STATISTICA, StatSoft, Kraków 2000. * praca opiera się na efektach projektu zrealizowanego w ramach programu: Kumulacja kompetencji stażowy program angażowania pracowników naukowych w rozwój branż Nano, Bio i Energia - współfinansowanego ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego i realizowanego przez Wrocławskie Centrum Badań EIT +. 10 www.statsoft.pl Copyright StatSoft Polska 2014