Metylacja DNA pełni ważną rolę w epigenetycznej regulacji ekspresji genów człowieka.

Rola 5-hydroksymetylocytozyny i białek Tet w epigenetycznej regulacji ekspresji genów Sylwester Głowacki Janusz Błasiak Katedra Genetyki Molekularnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, Łódź * Katedra Genetyki Molekularnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, ul. Pomorska 141/143, 90-236 Łódź; e- -mail sglowa@biol.uni.lodz.pl Artykuł otrzymano 16 listopada 2012 r. Artykuł zaakceptowano 14 lutego 2013 r. Słowa kluczowe: metylacja DNA, epigenetyka, 5-hydroksymetylocytozyna, regulacja ekspresji genów Wykaz skrótów: 5-caC 5-karboksycytozyna; 5-fC 5-formylcytozyna; 5-hmC 5-hydroksymetylocytozyna; 5-mC 5-metylocytozyna Streszczenie Metylacja DNA pełni ważną rolę w epigenetycznej regulacji ekspresji genów człowieka. Przez długi czas było kwestią dyskusyjną, czy w komórkach ssaków istnieją mechanizmy aktywnej demetylacji DNA. Niedawne odkrycie białek rodziny Tet, zdolnych przekształcać 5-metylocytozynę w 5-hydroksymetylocytozynę, pozwoliło opisać szlak, w którym dochodzi do aktywnej demetylacji DNA. Wyniki dalszych badań sugerują, że 5-hydroksymetylocytozyna jest nie tylko produktem przejściowym w procesie demetylacji DNA, ale może także regulować profil epigenetyczny genomu człowieka. Wprowadzenie Metylacja DNA jest jedną z najważniejszych modyfikacji epigenetycznych genomu człowieka. Nie zmienia ona sekwencji DNA, jest jednak zachowywana w trakcie podziałów komórkowych. Substratem dla metylacji DNA są cytozyny wchodzące w skład dinukleotydów CpG, których większość zgromadzona jest w obrębie wysp CpG, charakterystycznych dla obszarów regulatorowych genomów ssaków, a produktem 5-metylocytozyna (5-mC). Metylacja DNA w promotorach genów może prowadzić do wyciszenia ich ekspresji [1]. Z kolei utrata metylacji może prowadzić do hamowania wzrostu i apoptozy, zarówno w komórkach prawidłowych jak i nowotworowych [2,3]. Metylacja DNA odgrywa także ważną rolę w rozwoju embrionalnym, co potwierdzają wyniki badań przeprowadzonych na myszach [4]. Metylacja DNA może być przeprowadzana de novo przez metylotransferazy DNA DNMT3a i DNMT3b lub odtwarzać wzorzec metylacji po replikacji przez metylazę DNMT1. Przez długi czas jedynym powszechnie akceptowanym mechanizmem demetylacji DNA w komórkach ssaków była pasywna demetylacja będąca skutkiem podziałów komórkowych, prowadzących do rozrzedzania wzoru metylacji. Jednakże do demetylacji DNA dochodzi także w komórkach nieprzechodzących cytokinez, w których nie zachodzi replikacja DNA [5]. Choć u roślin obserwuje się proces demetylacji powodowany działaniem glikozylaz DNA, enzymy te wykazują znacznie słabszą aktywność w stosunku do 5-mC ssaków [6]. 5-hydroksymetylocytozyna (5-hmC), stosunkowo niedawno odkryta modyfikacja cytozyny, powstaje w reakcji enzymatycznej oksydacji 5-mC przeprowadzanej przez enzym Tet1 (ang. ten-eleven translocation 1) (Tab. 1) [7]. Doprowadziło to do wysunięcia hipotezy, zgodnie z którą 5-hmC jest produktem pośrednim reakcji prowadzących do usuwania metylocytozyny z DNA [8]. 5-mC charakteryzuje się wysoką stabilnością chemiczną. Utlenienie tego związku do 5-hmC usuwa grupę metylową, ale pozostawia egzocykliczny podstawnik Tabela 1. Historia badań nad 5-hmC i białkami Tet. Data Wydarzenie Piśmiennictwo 1952 identyfikacja 5-hmC w DNA bakteriofagów [11] 1972 2003 2009 2010 pierwsza praca opisująca wysoki poziom 5-hmC w komórkach ssaków; brak niezależnego potwierdzenia tych wyników doprowadził do zarzucenia badań nad 5-hmC na wiele kolejnych lat wskazanie, że Tet1 jest składnikiem fuzyjnej onkoproteiny w ostrej białaczce szpikowej wykrycie 5-hmC w komórkach Purkiniego i mózgu, oraz wykazanie, że Tet1 dokonuje oksydacji 5-mC do 5-hmC zwrócono uwagę, że wyniki dotyczące bisulfidowania powinny być zweryfikowane, gdyż 5-hmC zachowuje się przy zastosowaniu tej techniki tak samo jak 5-mC [12] [13] [7,14] [14] 64 www.postepybiochemii.pl

w pozycji 5 [9]. Ponieważ jednak 5-hmC powstała z 5-mC, blokuje ona wiązanie się z DNA enzymu DNTM1 i odtwarzanie wzoru metylacji po replikacji DNA, przekształcenie 5-mC do 5-hmC może być traktowane jako zniesienie znacznika epigenetycznego [9,10]. Dalsze badania z wykorzystaniem profilowania genomowego wykazały jednak, że rozkład 5-hmC odbiega od rozkładu 5-mC i 5-hmC znajduje się w promotorach wielu genów, co sugeruje, że związek ten funkcjonować może także jako samodzielny epigenetyczny regulator ekspresji genów o funkcji odmiennej od 5-mC [8]. Biogeneza 5-hmC i rola białek Tet Białka z rodziny Tet zawierającej trzy paralogi to zależne od oksoglutaranów i żelaza dioksygenazy (Tab. 2) [16]. U myszy produkty wszystkich trzech genów mogą przekształcać 5-mC w 5-hmC. Poziom metylacji DNA wzrasta w wyniku wyciszenia aktywności genów Tet [17]. Co więcej, enzymy te katalizować mogą także inne przemiany 5-mC w 5-formylcytozynę (5-fC) i 5-karboksycytozynę (5-caC), zaś obie te pochodne wykryte zostały w DNA embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz w pełni zróżnicowanych komórek myszy [18]. Białka Tet zawierają wśród swoich domen bogate w reszty cysteiny rejony odpowiedzialne za wiązanie DNA. Tet1 i Tet3 zawierają także dodatkowe domeny zawierające palce cynkowe CXXC, podobne do domen wiążących DNA, występujących w DNMT1. Z drugiej strony analiza genomu wskazuje, że domena ta w przypadku genu Tet2 zachowała się jako osobne białko, którego gen został oddzielony od oryginalnego genu Tet2 w wyniku inwersji chromosomowej [16]. Nie wiadomo jeszcze, czy cechy strukturalne tej domeny w Tet1 umożliwiają, czy wręcz przeciwnie, uniemożliwiają wiązanie się tego białka z DNA [19,20]. Wyniki badań sugerują, że domena ta nie bierze udziału w wiązaniu DNA i jest zbędna dla zachowania katalitycznej aktywności Tet1 in vivo [19]. Zasugerowano, że aktywne wiązanie się z DNA poprzez domeny zawierające palce cynkowe może blokować dostęp metylotransferaz DNA i w ten sposób dodatkowo negatywnie modulować poziom metylacji DNA [20]. W Tet1 zidentyfikowano też unikalne, bogate w reszty cysteiny struktury podobne do występujących w białku AlkB, gdzie funkcjonują jako domeny wiążące DNA [16]. Ponadto w białkach Tet zidentyfikowano domeny mogące ulegać sumoilacji, co wskazuje, że modyfikacja ta może być jednym ze sposobów na regulację aktywności tych białek [16]. Rola 5-hmC w metabolizmie komórkowym 5-hmC może funkcjonować jako produkt pośredni w szlakach demetylacji DNA. W tym celu musi zostać poddana dalszym przemianom, które doprowadzą do odtworzenia niezmetylowanej cytozyny w miejscu pierwotnie występującej 5-mC (Ryc. 1). Jednym z możliwych szlaków jest szlak deaminacji z wykorzystaniem aktywności deaminazy AID/APOBEC, na co wskazywałaby korelacja między nadprodukcją AID/APOBEC a spadkiem stężenia 5-hmC [5]. Jednoczesna nadprodukcja Tet1 i AID/APOBEC prowadzi z kolei do akumulacji 5-hydroksymetylouracylu, deaminowanej pochodnej 5-hmC, która usuwana jest przez glikozylazę DNA uracylu 1 [5,21]. W szlaku tym mogą także brać udział białko MBD4, które wykazuje zdolność usuwania 5-hydroksyuracylu; oraz glikozylaza tyminy w DNA (TDG), usuwająca tyminę z błędnego sparowania G:T [22]. TDG może też usuwać oksydacyjne pochodne 5-hmC takie jak 5-fC i 5-caC [22]. Pochodne te mogą być też usuwane w szlaku naprawy DNA przez wycinanie zasad azotowych (BER), choć sugeruje się także, że ich przemiana zachodzić może również na drodze deformylacji i dekarboksylacji [8,23]. Dotychczas biologiczna rola 5-hmC była najdokładniej badana w kontekście rozwoju osobniczego, w regulacji procesów krwiotwórczych, roli w funkcjonowaniu komórek nerwowych oraz w nowotworach [8]. W warunkach in vitro w kulturach komórek z nadprodukcją Tet1 stwierdzono obniżoną ilość 5-mC i nieznacznie podwyższoną ilość niezmetylowanej cytozyny [7]. W dojrzałych tkankach poziom 5-hmC jest zróżnicowany i zwiera się w przedziale 0,03-0,69%, osiągając największe wartości w neuronach, w których stanowi do około 0,7% wszystkich cytozyn. Poziom ten jest niższy w rejonach hipokampa bogatych w komórki macierzyste [24]. Z drugiej strony, wyniki badań nad komórkami macierzystymi myszy sugerują, że wyciszenie genów Tet1 i Tet2 wywołuje spadek aktywności genów związanych z pluripotencją i wzrost poziomu metylacji ich promotorów. Sugerowałoby to, że poziom hydroksymetylacji DNA spada wraz z różnicowaniem się komórek [25]. Badano także wpływ procesów metylacji i demetylacji DNA na liczbę kopii mtdna w komórkach różnych tkanek. Zaobserwowano na przykład, że 5-hmC jest elementem systemów regulujących syntezę kodowanej jądrowo polimerazy DNA γ, której aktywność istotnie wpływa na liczbę kopii mtdna [26]. Tabela 2. Charakterystyka ludzkich enzymów Tet. Dane pochodzą z bazy uniprot.org. Cecha Tet1 Tet2 Tet3 Długość (aminokwasy) 2136 2002 1660 Masa (Da) 235 309 223 811 179 350 Katalizowana reakcja DNA 5mC + 2-oksoglutaran + O 2 DNA 5-hmC + bursztynian + CO 2 Kofaktor 1Fe 2+ na podjednostkę Specyficzność tkankowa syntezowany w sercach, płucach i mózgu płodów, ale nie wykryty w tych samych narządach u dorosłych; wykryty w mięśniach szkieletowych, grasicy i jajnikach dorosłych syntezowany w wielu tkankach, szczególnie mocna w komórkach hematopoetycznych, przy czym najwyższa ekspresja obserwowana jest w granulocytach; ekspresja w granulocytach krwi obwodowej zredukowana u pacjentów cierpiących na zespoły mielodysplastyczne synteza w jelicie, mięśniach i limfocytach krwi obwodowej Postępy Biochemii 59 (1) 2013 65

Rycina 1. Rola 5-hydroksymetylocytozyny (5-hmC) w szlakach metylacji i demetylacji DNA. Metylacja DNA przeprowadzana jest przez metylotransferazy DNA(DNMT). Powstała 5-metylocytozyna (5-mC) jest modyfikowana przez enzymy z rodziny TET do 5-hmC i jej dalszych pochodnych. 5-hmC może być deaminowana do 5-hydroksymetylouracylu (5-hmU), usuwanego następnie w szlaku naprawy DNA przez wycinanie zasad azotowych. C cytozyna; 5-fC 5-formylocytozyna; 5-caC 5-karboksycytozyna. Na podstawie [9], zmienione. Należy także zaznaczyć, że 5-hmC może działać jak inhibitor metylacji zachowawczej, hamując wiązanie się z hemimetylowanymi sekwencjami enzymu DNMT1. 5-hmC powstająca jako produkt oksydacji 5-mC przez reaktywne formy tlenu, pośredniczy w ten sposób w akumulacji zaburzeń profilu metylacji DNA indukowanych stresem oksydacyjnym [27]. Oddziaływanie między IDH (dehydrogenaza izocytrynianu) a Tet sugeruje istnienie relacji pomiędzy stresem środowiskowym a hydroksymetylacją DNA. Zaproponowano mechanizm, w którym stres oksydacyjny indukuje aktywację SIRT3, które z kolei aktywuje IDH2. Wytworzony przez IDH2 α-ketoglutaran aktywuje Tet, które przetwarzają 5-mC do 5-hmC [28]. Rola 5-hmC i białek Tet w regulowaniu rozwoju Aktywność Tet ma fundamentalne znaczenie dla prawidłowego rozwoju zarodkowego. Poszczególne enzymy z rodziny Tet są aktywne na różnych etapach rozwoju i/ lub w różnych tkankach. Tet1 jest głównym enzymem aktywnym w ESC, zaś wyciszenie jego aktywności na drodze interferencji RNA jest pozytywnie skorelowane ze spadkiem zawartości 5-hmC w genomie tych komórek [7]. Tet3 osiąga najwyższą aktywność w oocytach i zygotach, gdzie najprawdopodobniej uczestniczy w reprogramowaniu genomu ojcowskiego po zapłodnieniu. Proces ten powiązany jest ze znacznym wzrostem poziomu 5-hmC i ustaje po osiągnięciu stadium dwukomórkowego [29]. Jak dotąd jednak nie wykazano bezpośrednio enzymatycznej aktywności Tet3 w katalizowaniu przemiany 5-mC w 5-hmC [8]. Niemniej proces reprogramowania epigenetycznego w klonowaniu reprodukcyjnym zwierząt wymaga aktywności Tet3 i jest analogiczny do reprogramowania ojcowskich projąder po zapłodnieniu [30]. Drugim obok reprogramowania epigenetycznego procesem związanym z rozwojem jest piętnowanie genetyczne, czyli zjawisko specyficznego zachowania rodzicielskiego wzoru metylacji w wybranych genach. Geny poddane piętnowaniu muszą być zabezpieczone przed aktywną demetylacją przeprowadzaną przez białka Tet. Jeden z wykrytych mechanizmów działa w oparciu o aktywność białka STEL- LA. Mutanty z nieaktywną formą tego białka nie rozróżniają w trakcie pierwszych etapów rozwoju zarodkowego genomu matczynego i ojcowskiego i dokonują aktywnej demetylacji obu, w tym elementów retrotranspozonowych zawartych w genomie matczynym. Prowadzi to do zahamowania rozwoju zarodkowego na wczesnym etapie. Wykazano, że specyficzna rekrutacja STELLA do sekwencji 66 www.postepybiochemii.pl

poddanych piętnowaniu hamuje wiązanie białek Tet i w ten sposób chroni je przed demetylacją [31]. Wyniki badań z zastosowaniem immunofluorescencji sugerują, że 5-hmC znajduje się zazwyczaj w obszarach euchromatyny, w tym z rejonami oddziałującymi z sekwencjami wzmacniającymi (ang. enhancers) i wykazującymi metylację H3K4me1 i H3K27ac [32]. Stwierdzono także, że poziom 5-hmC w mysich embrionalnych komórkach macierzystych jest podwyższony w regionach wiążących czynniki transkrypcyjne związane z pluripotencjalnością, zaś wyciszenie Tet1 i Tet2 skutkuje ich metylacją i hamowaniem ekspresji [25,33]. Choć nie obniża to żywotności, myszy z delecją Tet2 wykazują zmiany rozwojowe i tendencję do nowotworów krwi lub szpiku [34]. Jednym z mechanizmów takiego działania może być osłabianie przez 5-hmC oddziaływania z czynnikami wiążącymi metylowane DNA [35]. Jednakże obecność mutacji Tet1 w embrionalnych komórkach macierzystych myszy ma mniejszy wpływ na rozwój zarodkowy [17,36]. Choć wyciszenie genów Tet wywołuje hamowanie ekspresji szeregu genów, powoduje ono także uaktywnienie innych, w tym będących obiektem działania kompleksu represorowego Polycomb 2 [37]. Sugeruje to podwójną rolę jaką może pełnić 5-hmC, zarówno aktywatora i represora ekspresji genów. Wśród indukowanych genów znajduje się szereg markerów różnicowania, w tym Cdx2, Eomes, Gata4 i Gata6 [38]. Rola 5-hmC i białek Tet w hematopoezie i nowotworzeniu Mutacje Tet2 wpływające na jego aktywność katalityczną są częste u chorych na białaczki różnego typu, zaś ich obecność jest skorelowana z obniżonym poziomem 5-hmC [39]. Zauważono, że w komórkach niektórych białaczek dochodzi do obniżenia aktywności białek Tet i jednoczesnego spadku poziomu metylacji DNA. Zaproponowano, iż może to wynikać z zaburzenia mechanizmów regulujących metylację DNA [39]. Sugeruje się, że mutacje Tet2 mogą odgrywać rolę w regulacji aktywności komórek macierzystych krwi i procesach ich różnicowania. Myszy z mutacją Tet2 zmieniającą aktywność domeny katalitycznej charakteryzowały się podwyższonym poziomem hematopoetycznych komórek macierzystych krwi (HSC, ang. hematopoietic stem cells). W testach transplantacyjnych, HSC z mutacją w Tet2 wykazały selekcyjną przewagę nad prawidłowymi HSC [40]. Myszy z obniżoną aktywnością Tet2 rozwijają się początkowo prawidłowo, lecz z czasem zaczynają zapadać na różne choroby układu krwiotwórczego, w tym obejmujące zaburzenia różnicowania się komórek [37,41]. Myszy z ekspresją Tet2 zredukowaną o 80% umierają już po trzech dniach od narodzin, zaś w ich wątrobach obserwuje się wysokie poziomu komórek progenitorowych krwi [42]. Jedną z konsekwencji utraty aktywności Tet2 jest wzrost potencjału komórek macierzystych do odnawiania się. Co więcej, właściwości takie obserwuje się nawet w komórkach z wyłączoną tylko jedną kopią Tet2 (Tet2 +/- ) [41]. Stwierdzono także oddziaływanie między konstytutywnie aktywną onkogenną kinazą tyrozynową BCR/ABL a białkami Tet. Oddziaływanie to prowadzi do umiejscowienia Tet w cytozolu i spadku poziomu 5-hmC w genomie. Oddziaływanie inhibitora BCR/ABL imatynibu, z kinazą BCR/ABL reaktywuje Tet i przywraca fizjologiczny poziom 5-hmC w DNA [43]. Na rolę białek Tet w hematopoezie wskazują także oddziaływania z innymi białkami. Mutacje w genach białek IDH1 i IDH2 występują często u pacjentów cierpiących na ostrą białaczkę szpikową. Produktem aktywności IDH jest α-ketoglutaran. Stwierdzono, że zmutowane warianty tych białek upośledzają aktywność Tet2 i hamują różnicowanie się komórek w trakcie hematopoezy [44]. Zwrócono także uwagę na potencjał diagnostyczny i prognostyczny utraty hydroksymetylacji w rozwoju czerniaka. Proces ten związany jest z utratą aktywności dehydrogenazy 2 izocytrynianu oraz enzymów Tet. W badaniach na zwierzętach stwierdzono, że wprowadzenie aktywnych form Tet osłabia wzrost nowotworu i zwiększa przeżywalność zwierząt doświadczalnych [45]. Rola 5-hmC i białek Tet w tkankach nerwowych Tkanki nerwowe były obiektem badań, które pozwoliły zrekonstruować niektóre z hipotetycznych szlaków demetylacji opisanych wcześniej. Jako komórki niedzielące się, stały się kandydatem do poszukiwania szlaków aktywnej demetylacji, ponieważ w zróżnicowanych neuronach nie zachodzi pasywna demetylacja na drodze podziału komórkowego [5]. W przypadku badań nad tkanką nerwową myszy stwierdzono, że poziom 5-hmC może rosnąć wraz z rozwojem i różnicowaniem komórek macierzystych układu nerwowego u dorosłych myszy [46]. Z wynikami tymi jest spójna korelacja stwierdzona między stopniem rozwoju móżdżku u człowieka a poziomem akumulacji 5-hmC w jego tkankach [47]. Jest to także zgodne ze stwierdzonymi obniżonymi poziomami 5-hmC pozytywnie skorelowanymi z anaplazjami w guzach mózgu [48]. Pod tym względem funkcja 5-hmC wydaje się być w komórkach mózgu inna niż w komórkach macierzystych, gdzie zwykle różnicowaniu towarzyszy spadek ilości 5-hmC. Różnice dotyczą także rozkładu 5-hmC, w komórkach nerwowych jest ona raczej nieobecna w regionach promotorowych, występuje zaś częściej w regionach kodujących genów [49]. Zmiany w hydroksymetylacji mogą też odgrywać rolę w rozwoju chorób neurologicznych. Stwierdzono zwiększoną częstość zmian w hydroksymetylacji genów powiązanych z rozwojem autyzmu [47]. Wykazano, że pewne formy autyzmu związane są z mutacjami w genie białka MeCP2, które w warunkach in vitro blokuje aktywnością Tet1 [9]. Jak się wydaje 5-hmC i enzymy z rodziny Tet uczestniczą także w epigenetycznej regulacji ekspresji genów mitochondrialnych w tkankach mózgu [50]. Stwierdzono obecność 5-hmC w DNA mitochondrialnym, a także lokalizację białek Tet w mitochondriach. Zauważono także, że wpływ na aktywność Tet i poziom 5-hmC może mieć proces starzenia [50]. W móżdżku myszy w szeregu genów dochodzi do akumulacji 5-hmC w trakcie starzenia, przy czym geny te są związane z takimi procesami jak podatność na hipoksję, angiogeneza czy związane z wiekiem procesy neurodegeneracyjne [9]. Podsumowanie Odkrycie aktywności TET pogłębiło naszą wiedzę na temat demetylacji DNA, która jest jednym z istotnych mechanizmów kontroli aktywności genów na poziomie epi- Postępy Biochemii 59 (1) 2013 67

genetycznym. W ostatnich kilku latach uzyskano szereg wyników potwierdzających znaczenie hydroksymetylacji w regulacji takich procesów jak rozwój i różnicowanie komórek macierzystych, procesy transformacji nowotworowej czy procesy starzenia. Jednakże pełna rola 5-hmC pozostaje do wyjaśnienia. Dalszych badań wymaga określenie różnic między rolą 5-hmC w regulacji fizjologii komórek macierzystych, a rolą w komórkach zróżnicowanych. Także szlaki przekształceń 5-hmC prowadzące do odtworzenia niezmetylowanej cytozyny wymagają dalszych badań. Wstępne wyniki wskazują także, że badania nad 5-hmC mogą dostarczyć nowych informacji o genezie i rozwoju niektórych chorób. PIŚMIENNICTWO 1. Prokhortchouk E, Defossez P-A (2008) The cell biology of DNA methylation in mammals. Biochim Biophys Acta 1783: 2167-2173 2. Jackson-Grusby L, Beard C, Possemato R, Tudor M, Fambrough D, Csankovszki G, Dausman J, Lee P, Wilson C, Lander E, Jaenisch R (2001) Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nat Genet 27: 31-39 3. Chen T, Hevi S, Gay F, Tsujimoto N, He T, Zhang B, Ueda Y, Li E (2007) Complete inactivation of DNMT1 leads to mitotic catastrophe in human cancer cells. Nat Genet 39: 391-396 4. Takebayashi S-I, Tamura T, Matsuoka C, Okano M (2007) Major and essential role for the DNA methylation mark in mouse embryogenesis and stable association of DNMT1 with newly replicated regions. Mol Cell Biol 27: 8243-8258 5. Guo JU, Su Y, Zhong C, Ming G-L, Song H (2011) Hydroxylation of 5-methylcytosine by TET1 promotes active DNA demethylation in the adult brain. Cell 145: 423-434 6. Zhu J-K (2009) Active DNA demethylation mediated by DNA glycosylases. Annu Rev Genet 43: 143-166 7. Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Pastor WA, Bandukwala H, Brudno Y, Agarwal S, Iyer LM, Liu DR, Aravind L, Rao A (2009) Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science 324: 930-935 8. Branco MR, Ficz G, Reik W (2012) Uncovering the role of 5-hydroxymethylcytosine in the epigenome. Nat Rev Genet 13: 7-13 9. Kriukienė E, Liutkevičiūtė Z, Klimašauskas S (2012) 5-Hydroxymethylcytosine the elusive epigenetic mark in mammalian DNA. Chem Soc Rev 41: 6916-6930 10. Inoue A, Zhang Y (2011) Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science 334: 194 11. Wyatt GR, Cohen SS (1952) A New Pyrimidine Base from Bacteriophage Nucleic Acids. Nature 170: 1072-1073 12. Penn NW, Suwalski R, O Riley C, Bojanowski K, Yura R (1972) The presence of 5-hydroxymethylcytosine in animal deoxyribonucleic acid. Biochem J 126: 781-790 13. Lorsbach RB, Moore J, Mathew S, Raimondi SC, Mukatira ST, Downing JR (2003) TET1, a member of a novel protein family, is fused to MLL in acute myeloid leukemia containing the t(10;11)(q22;q23). Leukemia 17: 637-641 14. Kriaucionis S, Heintz N (2009) The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science 324: 929-930 15. Jin S-G, Kadam S, Pfeifer GP (2010) Examination of the specificity of DNA methylation profiling techniques towards 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nucleic Acids Res 38: e125 16. Iyer LM, Tahiliani M, Rao A, Aravind L (2009) Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle 8: 1698-1710 17. Ito S, D Alessio AC, Taranova OV, Hong K, Sowers LC, Zhang Y (2010) Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature 466: 1129-1133 18. Ito S, Shen L, Dai Q, Wu SC, Collins LB, Swenberg JA, He C, Zhang Y (2011) Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science 333: 1300-1303 19. Frauer C, Rottach A, Meilinger D, Bultmann S, Fellinger K, Hasenöder S, Wang M, Qin W, Söding J, Spada F, Leonhardt H (2011) Different binding properties and function of CXXC zinc finger domains in Dnmt1 and Tet1. PLoS ONE 6: e16627 20. Xu Y, Wu F, Tan L, Kong L, Xiong L, Deng J, Barbera AJ, Zheng L, Zhang H, Huang S, Min J, Nicholson T, Chen T, Xu G, Shi Y, Zhang K, Shi YG (2011) Genome-wide regulation of 5hmC, 5mC, and gene expression by Tet1 hydroxylase in mouse embryonic stem cells. Mol Cell 42: 451-464 21. Cortellino S, Xu J, Sannai M, Moore R, Caretti E, Cigliano A, Le Coz M, Devarajan K, Wessels A, Soprano D, Abramowitz LK, Bartolomei MS, Rambow F, Bassi MR, Bruno T, Fanciulli M, Renner C, Klein-Szanto AJ, Matsumoto Y, Kobi D, Davidson I, Alberti C, Larue L, Bellacosa A (2011) Thymine DNA glycosylase is essential for active DNA demethylation by linked deamination-base excision repair. Cell 146: 67-79 22. Sjolund AB, Senejani AG, Sweasy JB (2012) MBD4 and TDG: Multifaceted DNA glycosylases with ever expanding biological roles. Mutat Res. doi: 10.1016/j.mrfmmm.2012.11.001 23. Maiti A, Drohat AC (2011) Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: potential implications for active demethylation of CpG sites. J Biol Chem 286: 35334-35338 24. Globisch D, Münzel M, Müller M, Michalakis S, Wagner M, Koch S, Brückl T, Biel M, Carell T (2010) Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS ONE 5: e15367 25. Ficz G, Branco MR, Seisenberger S, Santos F, Krueger F, Hore TA, Marques CJ, Andrews S, Reik W (2011) Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation. Nature 473: 398-402 26. Kelly RDW, Mahmud A, McKenzie M, Trounce IA, St John JC (2012) Mitochondrial DNA copy number is regulated in a tissue specific manner by DNA methylation of the nuclear-encoded DNA polymerase gamma A. Nucleic Acids Res 40: 10124-10138 27. Valinluck V, Sowers LC (2007) Endogenous cytosine damage products alter the site selectivity of human DNA maintenance methyltransferase DNMT1. Cancer Res 67: 946-950 28. Chia N, Wang L, Lu X, Senut M-C, Brenner C, Ruden DM (2011) Hypothesis: environmental regulation of 5-hydroxymethylcytosine by oxidative stress. Epigenetics 6: 853-856 29. Iqbal K, Jin S-G, Pfeifer GP, Szabó PE (2011) Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proc Natl Acad Sci USA 108: 3642-3647 30. Gu T-P, Guo F, Yang H, Wu H-P, Xu G-F, Liu W, Xie Z-G, Shi L, He X, Jin S, Iqbal K, Shi YG, Deng Z, Szabó PE, Pfeifer GP, Li J, Xu G-L (2011) The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature 477: 606-610 31. Messerschmidt DM (2012) Should I stay or should I go: protection and maintenance of DNA methylation at imprinted genes. Epigenetics 7: 969-975 32. Szulwach KE, Li X, Li Y, Chun-Xiao Song C-X, Han JW, Kim SS, Namburi S, Hermetz K, Kim JJ, Rudd MK, Yoon Y-S, Ren B, He C, Jin P (2011) Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet 7: e1002154 33. Wu H, D Alessio AC, Ito S, Wang Z, Cui K, Zhao K, Sun YE, Zhang Y (2011) Genome-wide analysis of 5-hydroxymethylcytosine distribution reveals its dual function in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells. Genes Dev 25: 679-684 34. Li Z, Cai X, Cai C-L, Wang J, Zhang W, Petersen BE, Yang F-C, Xu M (2011) Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood 118: 4509-4518 35. Valinluck V, Tsai H-H, Rogstad DK, Burdzy A, Bird A, Sowers LC (2004) Oxidative damage to methyl-cpg sequences inhibits the binding of the methyl-cpg binding domain (MBD) of methyl-cpg binding protein 2 (MeCP2). Nucleic Acids Res 32: 4100-4108 68 www.postepybiochemii.pl

36. Dawlaty MM, Ganz K, Powell BE, Hu Y-C, Markoulaki S, Cheng AW, Gao Q, Kim J, Choi S-W, Page DC, Jaenisch R (2011) Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell 9: 166-175 37. Quivoron C, Couronné L, Valle Della V, Lopez CK, Plo I, Wagner-Ballon O, Cruzeiro MD, Delhommeau F, Arnulf B, Stern M-H, Godley L, Opolon P, Tilly H, Solary E, Duffourd Y, Philippe Dessen, Merle-Beral H, Nguyen-Khac F, Fontenay M, Vainchenker W, Bastard C, Mercher T, Bernard OA (2011) TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell 20: 25-38 38. Wu H, D Alessio AC, Ito S, Xia K, Wang Z, Cui K, Zhao K, Sun YE, Zhang Y (2011) Dual functions of Tet1 in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells. Nature 473: 389-393 39. Ko M, Huang Y, Jankowska AM, Pape UJ, Tahiliani M, Bandukwala HS, An J, Lamperti ED, Koh KP, Ganetzky R, Liu XS, Aravind L, Agarwal S, Maciejewski JP, Rao A (2010) Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature 468: 839-843 40. Ko M, Bandukwala HS, An J, Lamperti ED, Thompson EC, Hastie R, Tsangaratou A, Rajewsky K, Koralov SB, Rao A (2011) Ten-Eleven- Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proc Natl Acad Sci USA 108: 14566-14571 41. Moran-Crusio K, Reavie L, Shih A, Abdel-Wahab O, Ndiaye-Lobry D, Lobry C, Figueroa ME, Vasanthakumar A, Patel J, Zhao X, Perna F, Pandey S, Madzo J, Song C, Dai Q, He C, Ibrahim S, Beran M, Zavadil J, D Nimer SD, Melnick A, Godley LA, Aifantis I, Levine RL (2011) Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell 20: 11-24 42. Shide K, Kameda T, Shimoda H, Yamaji T, Abe H, Kamiunten A, Sekine M, Hidaka T, Katayose K, Kubuki Y, Yamamoto S, Miike T, Iwakiri H, Hasuike S, Nagata K, Marutsuka K, Iwama A, Matsuda T, Kitanaka A, Shimoda K (2012) TET2 is essential for survival and hematopoietic stem cell homeostasis. Leukemia 26: 2216-2223 43. Mancini M, Veljkovic N, Leo E, Aluigi M, Borsi E, Galloni C, Iacobucci I, Barbieri E, Santucci MA (2012) Cytoplasmatic compartmentalization by Bcr-Abl promotes TET2 loss-of-function in chronic myeloid leukemia. J Cell Biochem 113: 2765-2774 44. Figueroa ME, Abdel-Wahab O, Lu C, Ward PS, Patel J, Shih A, Li Y, Bhagwat N, Vasanthakumar A, Fernandez HF, Tallman MS, Sun Z, Wolniak K, Peeters JK, Liu W, Choe SE, Fantin VR, Paietta E, Löwenberg B, Licht JD, Godley LA, Delwel R, Valk PJM, Thompson CB, Levine RL, Melnick A (2010) Leukemic IDH1 and IDH2 mutations result in a hypermethylation phenotype, disrupt TET2 function, and impair hematopoietic differentiation. Cancer Cell 18: 553-567 45. Lian CG, Xu Y, Ceol C, Wu F, Larson A, Dresser K, Xu W, Tan L, Hu Y, Zhan Q, Lee C-W, Hu D, Lian BQ, Kleffel S, Yang Y, Neiswender J, Khorasani AJ, Fang R, Lezcano C, Duncan LM, Scolyer RA, Thompson JF, Kakavand H, Houvras Y, Zon LI, Mihm MC, Kaiser UB, Schatton T, Woda BA, Murphy GF, Shi YG (2012) Loss of 5-hydroxymethylcytosine is an epigenetic hallmark of melanoma. Cell 150: 1135-1146 46. Song C-X, Szulwach KE, Fu Y, Dai Q, Yi C, Li X, Li Y, Chen C-H, Zhang W, Jian X, Wang J, Zhang L, Looney TJ, Zhang B, Godley LA, Hicks LM, Lahn BT, Jin P, He C (2011) Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Biotechnol 29: 68-72 47. Wang T, Pan Q, Lin L, Szulwach KE, Song C-X, He C, Wu H, Warren ST, Jin P, Duan R, Li X (2012) Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Hum Mol Genet. doi: 10.1093/hmg/ dds394 48. Kraus TFJ, Globisch D, Wagner M, Eigenbrod S, Widmann D, Münzel M, Müller M, Pfaffeneder T, Hackner B, Feiden W, Ulrich Schüller U, Carell T, Kretzschmar HA (2012) Low values of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), the sixth base, are associated with anaplasia in human brain tumors. Int J Cancer 131: 1577-1590 49. Szulwach KE, Li X, Li Y, Song C-X, Wu H, Dai Q, Irier H, Upadhyay AK, Gearing M, Levey AI, Vasanthakumar A, Godley LA, Chang Q, Cheng X, He C, Jin P (2011) 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat Neurosci 14: 1607-1616 50. Dzitoyeva S, Chen H, Manev H (2012) Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging 33: 2881-2891 Role of 5-hydroxymethylcytosine and Tet proteins in epigenetic regulation of gene expression Sylwester Glowacki *, Janusz Blasiak Department of Molecular Genetics, University of Lodz, 141/143 Pomorska St., 90-236 Lodz, Poland e-mail sglowa@biol.uni.lodz.pl Key words: DNA methylation, 5-hydroksymethylcytosine, epigenetics, gene expression regulation Abstract DNA methylation plays an important role in epigenetic regulation of human gene expression. Mechanism of active demethylation of the human genome have been a matter of discussion for many years. Recently, a novel group of TET protein family enzymatically converting 5-methylcytosine into 5-hydroxymethylcytosine was discovered, playing a role in active DNA demethylation pathway. Results obtained in subsequent studies pointed that 5-hydroxymethylcytosine was not only an intermediate in that pathway, but might also modify epigenetic profile of the human genome. Postępy Biochemii 59 (1) 2013 69