Załącznik 2 AUTOREFERAT 1. Imię i nazwisko: Joanna Karbowska 2. Posiadane dyplomy i stopnie naukowe: doktor nauk medycznych: Akademia Medyczna w Gdańsku; Wydział Lekarski; 2000 r.; tytuł rozprawy doktorskiej: "Wpływ cyklicznego głodzenia i karmienia na poziom mrna syntazy kwasów tłuszczowych i leptyny w tkance tłuszczowej szczura" magister biologii: Uniwersytet Gdański; Wydział Biologii, Geografii i Oceanologii; 1993 r. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych: od 2001 r. adiunkt, Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Lekarski, Akademia Medyczna w Gdańsku (obecnie Gdański Uniwersytet Medyczny); 1996-2001 r. asystent, Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Lekarski, Akademia Medyczna w Gdańsku; 1993-1996 r. biolog, Zespół Enzymologii w Katedrze i Zakładzie Biochemii, Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii Akademii Medycznej w Gdańsku i Uniwersytetu Gdańskiego 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) tytuł osiągnięcia naukowego: ZMIANY W REGULACJI BIOSYNTEZY ADIPOKIN I BIAŁEK KROPLI LIPIDOWYCH ZWIĄZANE Z OBNIŻANIEM MASY TKANKI TŁUSZCZOWEJ b) autorzy, rok wydania, tytuły publikacji, nazwa wydawnictwa: 1. Karbowska J., Kochan Z. (2012) Intermittent fasting up-regulates Fsp27/Cidec gene expression in white adipose tissue. Nutrition 28: 294-299. (IF = 3,025) 2. Karbowska J., Kochan Z. (2012) Fat-reducing effects of dehydroepiandrosterone involve upregulation of ATGL and HSL expression, and stimulation of lipolysis in adipose tissue. Steroids 77: 1359-1365. (IF = 2,829) 1
3. Karbowska J., Kochan Z. (2006) Role of adiponectin in the regulation of carbohydrate and lipid metabolism. J. Physiol. Pharmacol. 57 (Suppl. 6): 103-113. (IF = 2,974) 4. Karbowska J., Kochan Z. (2005) Effect of DHEA on endocrine functions of adipose tissue, the involvement of PPARγ. Biochem. Pharmacol. 70: 249-257. (IF = 3,617) 5. Kochan Z., Karbowska J. (2004) Dehydroepiandrosterone up-regulates resistin gene expression in white adipose tissue. Mol. Cell. Endocrinol. 218: 57-64. (IF = 2,626) Sumaryczny IF wszystkich prac = 15,071 (bez pracy przeglądowej IF = 12,097) Łączna liczba cytowań: 84 (Web of Science, 07.05.2013 r.) c) omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania: Coraz bardziej powszechne występowanie otyłości i towarzyszących jej chorób metabolicznych skłania do poszukiwań skutecznych metod obniżania masy tkanki tłuszczowej, jak również do badania związanych z tym mechanizmów regulacyjnych. Celem naszych badań było poznanie możliwości obniżenia masy tkanki tłuszczowej poprzez suplementację występującego w organizmie człowieka hormonu steroidowego, dehydroepiandrosteronu (DHEA), a także poprzez manipulacje żywieniowe (w postaci przerywanego głodzenia lub ciągłej diety redukcyjnej) oraz określenie towarzyszących temu zmian w regulacji biosyntezy adipokin i białek związanych z kroplami lipidowymi w adipocytach. Badania przeprowadzono na szczurach rasy Wistar karmionych paszą z dodatkiem 0,6% DHEA oraz na szczurach Wistar poddanych diecie redukcyjnej lub przerywanemu głodzeniu (ośmiokrotnie powtórzone 3 dni głodzenia 3 dni karmienia). DHEA powstaje głównie w korze nadnerczy i jest uważany za prohormon, który pełni rolę prekursora aktywnych biologicznie steroidów, takich jak testosteron i 17β-estradiol 1. Jednak sam DHEA również wykazuje aktywność biologiczną 2. DHEA występuje we krwi człowieka w największym stężeniu spośród hormonów steroidowych 3. Z wiekiem stężenie to ulega znacznemu obniżeniu 3, co u ludzi jest skorelowane z częstszym występowaniem otyłości i towarzyszących jej chorób metabolicznych 4. W tkance tłuszczowej, z powodu braku aktywności 17α-hydroksylazy (CYP17) 5, nie zachodzi synteza DHEA de novo, pomimo tego stężenie DHEA w tej tkance może nawet 10-krotnie przekraczać to obserwowane w surowicy 6. DHEA jest zatem bardzo efektywnie pobierany przez tkankę tłuszczową. Wiadomo również, że tkanka tłuszczowa 2
jest wrażliwa na działanie DHEA, który jest uważany za jeden z hormonów redukujących jej masę. Mimo to, wpływ DHEA na tkankę tłuszczową jest wyjątkowo słabo poznany zważywszy, że ten aktywny biologicznie steroid został odkryty niemal 80 lat temu 7. Ponieważ obniżenie masy tkanki tłuszczowej pod wpływem DHEA nie jest związane ze zmniejszeniem ilości pobieranego pokarmu, najbardziej prawdopodobny wydaje się udział DHEA w regulacji metabolizmu tej tkanki. DHEA został wcześniej uznany za silny proliferator peroksysomów, który w wątrobie może indukować transkrypcję wielu genów przez aktywację czynników transkrypcyjnych z rodziny receptorów jądrowych aktywowanych przez proliferatory peroksysomów (PPAR) 2. W związku z tym przyjęliśmy założenie, że również w tkance tłuszczowej DHEA może wpływać na ekspresję i aktywność PPAR, a następnie z ich udziałem regulować ekspresję różnych genów w adipocytach. W badaniach zmian ekspresji genów kodujących receptor jądrowy PPARα, rezystynę i leptynę w tkance tłuszczowej, związanych z obniżaniem masy tej tkanki pod wpływem DHEA, (wyniki zostały opublikowane w Molecular and Cellular Endocrinology, 2004) wykazaliśmy, że: karmienie szczurów dietą z dodatkiem DHEA nie wpływa na ilość spożywanego pokarmu, a mimo to prowadzi do obniżenia masy tkanki tłuszczowej, DHEA nie wpływa na stężenie insuliny, glukozy, triacylogliceroli i testosteronu w surowicy, suplementacja DHEA zwiększa ekspresję genu kodującego receptor PPARα w wątrobie, zwiększa także aktywność PPARα jako czynnika transkrypcyjnego, czego dowodem jest wzrost ekspresji regulowanego przez PPARα genu kodującego enzym jabłczanowy, karmienie dietą zawierającą DHEA prowadzi do wielokrotnego wzrostu ilości mrna PPARα w tkance tłuszczowej, pod wpływem DHEA dochodzi również do wzrostu ekspresji genu kodującego rezystynę w tkance tłuszczowej, ponadto ilość mrna rezystyny jest dodatnio skorelowana z ilością mrna PPARα, co sugeruje udział tego receptora w wywołanej przez DHEA nadekspresji genu rezystyny, obniżeniu masy tkanki tłuszczowej pod wpływem DHEA towarzyszy tendencja spadkowa ekspresji genu kodującego leptynę w tkance tłuszczowej i znaczne zmniejszenie stężenia leptyny w surowicy. W omawianej pracy jako pierwsi wykazaliśmy, że obniżeniu masy tkanki tłuszczowej pod wpływem DHEA towarzyszy wzrost ekspresji genu kodującego receptor jądrowy PPARα w tej tkance oraz związana z tym zmiana jej aktywności wydzielniczej udowodniliśmy, że DHEA 3
wywołuje wzrost ekspresji regulowanego przez PPARα genu kodującego rezystynę. Wskazuje to, że DHEA obniża masę tkanki tłuszczowej między innymi poprzez wywołanie nadekspresji PPARα, a następnie indukcję transkrypcji genu kodującego rezystynę, która działając auto- lub parakrynnie może hamować różnicowanie komórek tkanki tłuszczowej. Ponadto PPARα jest aktywatorem transkrypcji wielu genów kodujących enzymy związane z pobieraniem i utlenianiem kwasów tłuszczowych, w związku z tym zaproponowaliśmy, że wzrost ekspresji i aktywności PPARα może prowadzić do zwiększonego katabolizmu lipidów w tkance tłuszczowej. Zaobserwowane przez nas w surowicy szczurów karmionych dietą z DHEA znaczne obniżenie stężenia leptyny, uważanej za adipokinę informującą o ilości lipidów w adipocytach, potwierdza zmniejszenie zasobów energetycznych zgromadzonych w tkance tłuszczowej. Praca opublikowana w 2005 roku w Biochemical Pharmacology dotyczy wpływu DHEA na biosyntezę i wydzielanie dominującego ilościowo hormonu tkanki tłuszczowej adiponektyny oraz na ekspresję genów kodujących jej receptory, AdipoR1 i AdipoR2. W tkance tłuszczowej szczurów karmionych dietą zawierającą DHEA zbadaliśmy również ekspresję genu kodującego receptor jądrowy PPARγ, który może brać udział w regulacji ekspresji genów kodujących adiponektynę i jej receptory. Wyniki badań przedstawione w omawianej publikacji dowodzą, że obniżeniu masy tkanki tłuszczowej pod wpływem DHEA towarzyszy: wzrost ekspresji genu kodującego adiponektynę w tkance tłuszczowej i zwiększenie stężenia adiponektyny w surowicy krwi badanych zwierząt, obniżenie stężenia leptyny w surowicy, wzrost ekspresji genu kodującego receptor adiponektyny AdipoR1 w tkance tłuszczowej, wzrost ekspresji genu kodującego receptor jądrowy PPARγ, który jako czynnik transkrypcyjny może regulować ekspresję genów kodujących adiponektynę i jej receptor AdipoR1, wzrost ekspresji genów kodujących enzymy, które biorą udział w procesach: lipolizy lipazy zależnej od hormonów (HSL) i utleniania kwasów tłuszczowych izoformy wątrobowej palmitoilotransferazy karnitynowej 1 (LCPT-1) w tkance tłuszczowej, brak zmian ekspresji genu kodującego kluczowy enzym lipogenny syntazę kwasów tłuszczowych (FAS) w tkance tłuszczowej. Badania te dostarczyły dowodów na nieznany wcześniej wpływ DHEA na ekspresję genów kodujących adiponektynę i jej receptor AdipoR1. Wykazaliśmy, że DHEA stymuluje ekspresję obu tych genów w tkance tłuszczowej. Podjęliśmy również próbę wyjaśnienia molekularnego 4
mechanizmu działania DHEA na ekspresję wymienionych wyżej genów i wykazaliśmy, że DHEA może zwiększać ich ekspresję poprzez indukcję receptora jądrowego PPARγ dominującej izoformy PPAR w adipocytach. Stanowi to istotny wkład w zrozumienie mechanizmów regulacyjnych związanych z działaniem DHEA na tkankę tłuszczową. Warto zaznaczyć, że regulacja ekspresji genu AdipoR1 w tkance tłuszczowej nie była dotychczas znana i została po raz pierwszy opisana w omawianej pracy. W tkance tłuszczowej szczurów karmionych dietą z dodatkiem DHEA zaobserwowaliśmy również indukcję ekspresji genów kodujących enzymy związane z katabolizmem lipidów w adipocytach, HSL i LCPT-1. Ponadto wykazaliśmy, że obniżanie masy tkanki tłuszczowej pod wpływem DHEA nie jest związane z działaniem tego steroidu na lipogenezę podawanie DHEA szczurom nie wywołało istotnych zmian ilości mrna FAS w tkance tłuszczowej. Stymulujący wpływ DHEA na ekspresję genu i wydzielanie adiponektyny przez tkankę tłuszczową może leżeć u podstaw przeciwmiażdżycowego działania tego steroidu. Dobroczynny wpływ adiponektyny na układ sercowo-naczyniowy jest dosyć dobrze poznany, a rola adiponektyny w regulacji metabolizmu węglowodanów i lipidów w mięśniu sercowym, mięśniu szkieletowym i wątrobie została szczegółowo opisana w pracy opublikowanej w 2006 roku w Journal of Physiology and Pharmacology. Przedstawiliśmy tam również wynik eksperymentu, który dowodzi, że ekspresja genów kodujących receptory adiponektyny, AdipoR1 i AdipoR2, ulega zmianie w przerośniętym mięśniu sercowym dochodzi do wzrostu ekspresji genu kodującego AdipoR1, przy jednoczesnym obniżeniu ekspresji genu kodującego AdipoR2. Biorąc pod uwagę swoistość tych receptorów w stosunku do różnych form multimerycznych adiponektyny zaproponowaliśmy, że opisane zmiany mogą mieć wpływ na zmianę wrażliwości badanej tkanki na adiponektynę, co może mieć znaczenie w regulacji metabolizmu substratów energetycznych węglowodanów i lipidów podczas przerostu mięśnia sercowego. Badania, których wyniki zostały opublikowane w 2012 roku w Steroids dotyczyły wyjaśnienia mechanizmu działania DHEA na lipolizę. Przyjęliśmy hipotezę, że DHEA może obniżać masę tkanki tłuszczowej poprzez działanie na związane z kroplą lipidową główne enzymy lipolityczne, adipocytarną lipazę triacyloglicerolową (ATGL) i lipazę zależną od hormonów (HSL), a w konsekwencji przez stymulację lipolizy. Zbadaliśmy zmiany ekspresji genów kodujących wymienione lipazy w tkance tłuszczowej szczurów i wykazaliśmy, że u 5
zwierząt karmionych dietą z dodatkiem DHEA oprócz obniżenia masy tkanki tłuszczowej dochodzi do: wzrostu stężenia wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy, zwiększonego uwalniania glicerolu z tkanki tłuszczowej, wzrostu ilości mrna i białka ATGL w tkance tłuszczowej, wzrostu ilości mrna oraz stopnia ufosforylowania HSL w tej tkance, wzrostu ilości mrna receptora jądrowego PPARγ2 w tkance tłuszczowej, wzrostu ekspresji genu kodującego translokazę kwasów tłuszczowych (FAT), znanego jako gen docelowy receptora PPARγ w tkance tłuszczowej. W tej publikacji jako pierwsi pokazaliśmy, że DHEA może zwiększać ekspresję genu kodującego ATGL enzym, który odpowiada za hydrolizę triacylogliceroli i ogranicza tempo lipolizy w tkance tłuszczowej. Udowodniliśmy na modelu zwierzęcym, że spożywanie diety zawierającej DHEA prowadzi do wzrostu ilości mrna i białka ATGL w tkance tłuszczowej. Potwierdziliśmy uzyskany przez nas wcześniej wynik (opisany w 2005 roku w Biochemical Pharmacology), że DHEA zwiększa ilość mrna HSL w tkance tłuszczowej oraz wykazaliśmy, że DHEA zwiększa też stopień fosforylacji tego enzymu, co oznacza wzrost jego aktywności. Wzrost ekspresji genów i aktywności obu enzymów prowadzi do zwiększonej lipolizy, co potwierdziliśmy eksperymentalnie wykazując wzrost stężenia wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy i zwiększone uwalnianie glicerolu z tkanki tłuszczowej badanych zwierząt. Ponieważ transkrypcja genów kodujących ATGL i HSL w tkance tłuszczowej może być indukowana przez PPARγ, zbadaliśmy wpływ DHEA na ilość mrna PPARγ2 izoformy PPARγ występującej wyłącznie w adipocytach. Karmienie dietą z DHEA wywołało znaczny wzrost ilości mrna PPARγ2 oraz wzrost aktywności tego receptora w tkance tłuszczowej szczurów (mierzony zwiększoną ekspresją genu docelowego PPARγ kodującego FAT), zaproponowaliśmy zatem, że ekspresja ATGL i HSL jest w badanym układzie stymulowana przez PPARγ2. Potwierdzeniem słuszności tej tezy może być dodatnia korelacja ilości mrna ATGL i HSL z ilością mrna PPARγ2, obserwowana w tkance tłuszczowej badanych zwierząt. Zaproponowaliśmy ponadto, że DHEA może stymulować lipolizę w tkance tłuszczowej nie tylko bezpośrednio, ale również pośrednio przez powstające lokalnie metabolity, głównie androstendiol. Koncepcję tę przedstawia Ryc. 1, pochodząca z przyjętej do druku pracy przeglądowej dotyczącej wpływu DHEA na metabolizm i wydzielniczą funkcję tkanki 6
tłuszczowej (Karbowska J., Kochan Z. Effects of DHEA on metabolic and endocrine functions of adipose tissue. Horm. Mol. Biol. Clin. Investig. 2013, w druku). Stężenie DHEA we krwi z wiekiem ulega obniżeniu 3, z wiekiem obniża się również wydajność lipolizy w ludzkiej tkance tłuszczowej 8. W oparciu o uzyskane przez nas wyniki można założyć, że jedną z przyczyn obniżenia tempa lipolizy u osób starszych jest niższe stężenie DHEA. Ryc. 1. Proponowany mechanizm działania DHEA na lipolizę w tkance tłuszczowej (Karbowska J., Kochan Z. Effects of DHEA on metabolic and endocrine functions of adipose tissue. Horm. Mol. Biol. Clin. Investig. 2013, w druku) Opisane wyżej badania stanowią oryginalny wkład w zrozumienie przyczyn obniżania masy tkanki tłuszczowej pod wpływem DHEA. Najważniejszym osiągnięciem wynikającym z tych badań jest wykazanie, że DHEA może wpływać na tkankę tłuszczową poprzez zwiększanie ekspresji genów i aktywności receptorów jądrowych PPAR (głównie PPARγ i PPARα), a następnie za pośrednictwem tych receptorów regulować ekspresję wielu genów w adipocytach, co prowadzi do zwiększonego katabolizmu lipidów i zmian aktywności wydzielniczej tkanki tłuszczowej. Wyniki te dają podstawy do opracowania nowych terapii, które mogą znaleźć zastosowanie w leczeniu otyłości. 7
Nasze ostatnie badania dotyczą możliwości obniżania masy tkanki tłuszczowej poprzez manipulacje żywieniowe w postaci przerywanego głodzenia lub ciągłej diety redukcyjnej oraz związanych z tym zmian ekspresji genów kodujących adipocytarne białka otaczające krople lipidowe. W pracy opublikowanej w 2012 roku w Nutrition przedstawiliśmy wyniki badań nad niedawno poznanym specyficznym dla tkanki tłuszczowej białkiem o masie 27 kda (FSP27), związanym z powierzchnią kropli lipidowych w adipocytach. W naszych badaniach zastosowaliśmy model doświadczalny przerywanego głodzenia (ośmiokrotnego, naprzemiennego 3-dniowego głodzenia i 3-dniowego karmienia), który porównaliśmy z ciągłą dietą redukcyjną o tej samej kaloryczności, a także z 3-dniowym głodzeniem, głodzeniem (3 dni) i następującym po nim karmieniem (3 dni) oraz karmieniem ad libitum. Wykazaliśmy, że u szczurów poddanych przerywanemu głodzeniu masa tkanki tłuszczowej jest niższa niż u zwierząt z innych badanych grup. Ponadto u tak traktowanych szczurów dochodzi do: obniżenia stężenia triacylogliceroli i leptyny w surowicy, zwiększenia stężenia insuliny w surowicy, wzrostu ilości mrna FSP27, wzrostu ilości mrna PPARγ2 i C/EBPα, wzrostu ekspresji genu kodującego mięśniową izoformę palmitoilotransferazy karnitynowej 1 (MCPT-1), co oznacza zwiększoną aktywność PPARγ jako czynnika transkrypcyjnego, ponieważ gen kodujący MCPT-1 jest znanym genem docelowym PPARγ w tkance tłuszczowej. W izolowanych szczurzych adipocytach inkubowanych z agonistami receptora PPARγ, rosiglitazonem i pioglitazonem, wykazaliśmy: wzrost ilości mrna FSP27, wzrost ilości mrna MCPT-1 (jako pozytywna kontrola zwiększonej aktywności transkrypcyjnej PPARγ). Jako pierwsi wykazaliśmy, że przerywane głodzenie, w odróżnieniu od ciągłej diety redukcyjnej o tej samej kaloryczności, prowadzi do wzrostu ekspresji genu kodującego białko FSP27 w tkance tłuszczowej. Nasze wyniki wskazują, że w warunkach przerywanego głodzenia gen kodujący FSP27 może ulegać indukcji pod wpływem receptora jądrowego PPARγ2 oraz czynnika transkrypcyjnego C/EBPα, które w podobny sposób reagują na zmiany diety (ilość 8
mrna FSP27 w tkance tłuszczowej była dodatnio skorelowana z ilością mrna PPARγ2, a także dodatnio skorelowana z ilością mrna C/EBPα). Udział receptora PPARγ w regulacji ekspresji genu Fsp27 potwierdziliśmy in vitro w izolowanych z tkanki tłuszczowej adipocytach wywołana przez farmakologiczne ligandy wzmożona ekspresja i aktywność transkrypcyjna receptora PPARγ skutkowała wzrostem ilości mrna FSP27. Podczas przerywanego głodzenia w regulacji ekspresji genu Fsp27 w tkance tłuszczowej może brać również udział insulina. Białko FSP27 jest niezbędne do powstawania dużych kropli lipidowych w adipocytach 9, może też regulować aktywność występujących na powierzchni kropli lipidowych enzymów związanych z biosyntezą triacylogliceroli, jak również enzymów lipolitycznych. Wzrost ekspresji genu kodującego FSP27 zwiększa potencjał tkanki tłuszczowej do magazynowania lipidów 9, natomiast brak tego białka prowadzi do lipodystrofii i wzrostu oporności na insulinę 10. Nasze wyniki wskazują, że przerywane głodzenie poprzez wzrost ekspresji genu kodującego białko FSP27 w tkance tłuszczowej może prowadzić do bardziej wydajnego gromadzenia lipidów w adipocytach, a w konsekwencji do zwiększenia masy tkanki tłuszczowej i masy ciała, jednocześnie jednak może chronić organizm przed nadmiernym magazynowaniem lipidów poza tkanką tłuszczową (co zwykle towarzyszy chorobom metabolicznym, takim jak cukrzyca typu 2), zwiększając w ten sposób wrażliwość organizmu na insulinę. Wyjaśnienie tego zagadnienia wymaga dalszych badań. Piśmiennictwo: 1. Davis S.R., Panjari M., Stanczyk F.Z. (2011) Clinical review: DHEA replacement for postmenopausal women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 96: 1642-1653. 2. Tamasi V., Miller K.K., Ripp S.L., Vila E., Geoghagen T.E., Prough R.A. (2008) Modulation of receptor phosphorylation contributes to activation of peroxisome proliferator activated receptor α by dehydroepiandrosterone and other peroxisome proliferators. Mol. Pharmacol. 73: 968-976. 3. Orentreich N., Brind J.L., Vogelman J.H., Andres R., Baldwin H. (1992) Long-term longitudinal measurements of plasma dehydroepiandrosterone sulfate in normal men. J. Clin. Endocrinol. Metab. 75: 1002-1004. 4. Yamaguchi Y., Tanaka S., Yamakawa T., Kimura M., Ukawa K., Yamada Y., Ishihara M., Sekihara H. (1998) Reduced serum dehydroepiandrosterone levels in diabetic patients with hyperinsulinaemia. Clin. Endocrinol. 49: 377-383. 5. MacKenzie S.M., Huda S.S., Sattar N., Fraser R., Connell J.M., Davies E. (2008) Depot-specific steroidogenic gene transcription in human adipose tissue. Clin Endocrinol. 69: 848-854. 6. Wang F., Koskela A., Hamalainen E., Turpeinen U., Savolainen-Peltonen H., Mikkola T.S., Vihma V., Adlercreutz H., Tikkanen M.J. (2011) Quantitative determination of dehydroepiandrosterone fatty acyl esters in human female adipose tissue and serum using mass spectrometric methods. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 124: 93-98. 7. Butenandt A., Dannenbaum H. (1934) Isolierung eines neuen, physiologisch unwirksamen Sterinderivates aus 9
Männerharn, seine Verknüpfung mit Dehydro-androsteron und Androsteron: ein Beitrag zur Konstitution des Androsterons. Z. Physiol. Chem. 229: 192-195. 8. Klein S., Young V.R., Blackburn G.L., Bistrian B.R., Wolfe R.R. (1986) Palmitate and glycerol kinetics during brief starvation in normal weight young adult and elderly subjects. J. Clin. Invest. 78: 928-933. 9. Keller P., Petrie J.T., De Rose P., Gerin I., Wright W.S., Chiang S.H., Nielsen A.R., Fischer C.P., Pedersen B.K., MacDougald O.A. (2008) Fat-specific protein 27 regulates storage of triacylglycerol. J. Biol. Chem. 283: 14355-14365. 10. Rubio-Cabezas O., Puri V., Murano I., Saudek V., Semple R.K., Dash S., Hyden C.S., Bottomley W., Vigouroux C., Magre J., Raymond-Barker P., Murgatroyd P.R., Chawla A., Skepper J.N., Chatterjee V.K., Suliman S., Patch A.M., Agarwal A.K., Garg A., Barroso I., Cinti S., Czech M.P., Argente J., O'Rahilly S., Savage D.B., LD Screening Consortium. (2009) Partial lipodystrophy and insulin resistant diabetes in a patient with a homozygous nonsense mutation in CIDEC. EMBO Mol. Med. 1: 280-287. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych Badania nad regulacją metabolizmu lipidów i biosyntezy adipokin w tkance tłuszczowej Tkanka tłuszczowa wykazuje dużą wrażliwość na manipulacje żywieniowe, w związku z tym głodzenie i następujące po nim karmienie stanowi klasyczny model doświadczalny w badaniach nad regulacją metabolizmu lipidów w tej tkance. W naszych badaniach stosowaliśmy ośmiokrotnie powtórzony cykl głodzenia (3 dni) i następującego po nim karmienia (3 dni), w porównaniu do jednokrotnego głodzenia (3 dni) - karmienia (3 dni) oraz do karmienia ad libitum. U szczurów poddanych wielokrotnemu głodzeniu-karmieniu zaobserwowaliśmy zahamowanie wzrostu masy ciała i obniżenie stężenia triacylogliceroli w surowicy krwi. Jednocześnie doszło do wzrostu szybkości lipogenezy w białej tkance tłuszczowej, który okazał się specyficzny dla tej tkanki, ponieważ ani w wątrobie ani w brunatnej tkance tłuszczowej nie zaobserwowaliśmy tak dużych zmian. Towarzyszył temu wielokrotny wzrost ilości mrna i aktywności enzymów lipogennych w białej tkance tłuszczowej. Zmiany te dotyczyły kluczowego enzymu lipogennego syntazy kwasów tłuszczowych (FAS), a także karboksylazy acetylo-coa (ACC), liazy ATPcytrynianowej (ACL), dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PDH) oraz enzymu jabłczanowego (ME). Wykazaliśmy, że u szczurów poddanych wielokrotnemu głodzeniu i karmieniu aktywność FAS i ME w tkance tłuszczowej jest istotnie wyższa niż w grupie kontrolnej nawet po 12 dniach karmienia ad libitum po ostatnim głodzeniu. U szczurów jednokrotnie głodzonych i karmionych aktywności wspomnianych enzymów w tkance 10
tłuszczowej wracają do poziomu obserwowanego u zwierząt kontrolnych już w szóstym dniu karmienia. Wskazuje to, że wywołane przez wielokrotne głodzenie-karmienie zmiany ekspresji i aktywności enzymów lipogennych w białej tkance tłuszczowej są długotrwałe. Ponadto w tkance tłuszczowej szczurów poddanych wielokrotnie powtarzanym cyklom głodzenia i karmienia dochodzi do znacznego obniżenia ekspresji genu kodującego leptynę i stężenia leptyny w surowicy. Reasumując, wykazaliśmy, że wielokrotne głodzenie-karmienie prowadzi do charakterystycznych dla białej tkanki tłuszczowej zmian ekspresji wielu genów związanych z jej funkcją wydzielniczą i metaboliczną. Z tego powodu opisany wyżej model doświadczalny może być przydatny w badaniach nad swoistymi dla tkanki tłuszczowej molekularnymi mechanizmami regulacyjnymi, uruchamianymi pod wpływem czynników dietetycznych. Leptyna jako hormon wskazujący między innymi na stan zasobów energetycznych organizmu od wielu lat budzi duże zainteresowanie również wśród ekofizjologów. W wyniku badań przeprowadzonych we współpracy z prof. dr hab. Włodzimierzem Meissnerem z Katedry Ekologii i Zoologii Kręgowców Uniwersytetu Gdańskiego jako pierwsi dostarczyliśmy dowodu eksperymentalnego na biosyntezę leptyny w tkance tłuszczowej i w wątrobie ptaków migrujących. W oparciu o uzyskane wyniki zaproponowaliśmy, że leptyna może być sygnałem informującym o ilości zasobów energetycznych zgromadzonych w tkance tłuszczowej, wpływającym na wybór odpowiedniej strategii wędrówki i żerowania ptaków w miejscach postojowych w czasie migracji. Jednak wyniki naszych ostatnich badań wskazują, że stężenie leptyny w krążeniu ptaków wędrownych w czasie migracji nie odzwierciedla stopnia otłuszczenia organizmu. Zaproponowaliśmy, że w czasie wędrówki może dochodzić do obniżenia wrażliwości na działanie leptyny, co umożliwia ptakom gromadzenie większych zapasów energetycznych w tkance tłuszczowej. Gogga P., Karbowska J., Kochan Z., Meissner W. (2013) Circulating leptin levels do not reflect the amount of body fat in the dunlin Calidris alpina during migration. Gen. Comp. Endocrinol. 187: 74-78. (IF = 3,267) Kochan Z., Karbowska J., Świerczyński J. (2006) The effects of weight cycling on serum leptin levels and lipogenic enzyme activities in adipose tissue. J. Physiol. Pharmacol. 57 (Suppl. 6): 115-127. (IF = 2,974) Kochan Z., Karbowska J., Meissner W. (2006) Leptin is synthesized in the liver and adipose tissue of the dunlin (Calidris alpina). Gen. Comp. Endocrinol. 148: 336-339. (IF = 2,487) Karbowska J., Kochan Z., Świerczyński J. (2001) Increase of lipogenic enzyme mrna levels in rat white adipose tissue after multiple cycles of starvation-refeeding. Metabolism 50: 734-738. (IF = 1,931) Kochan Z., Goyke E., Karbowska J., Słomińska E., Świerczyński J. (2001) The decrease of rat postprandial plasma triacylglycerol concentration after multiple cycles of starvation-refeeding. Horm. Metab. Res. 33: 26-29. (IF = 1,910) 11
Karbowska J. (2000) Wpływ cyklicznego głodzenia i karmienia na poziom mrna syntazy kwasów tłuszczowych i leptyny w tkance tłuszczowej szczura. Rozprawa doktorska, Wydział Lekarski, Akademia Medyczna w Gdańsku. Kochan Z., Karbowska J., Świerczyński J. (1997) Unusual increase of lipogenesis in rat white adipose tissue after multiple cycles of starvation-refeeding. Metabolism 46: 10-17. (IF = 1,681) Regulacja metabolizmu energetycznego w mięśniu sercowym rola receptorów jądrowych PPARα W 2002 r. Fundacja na rzecz Nauki Polskiej przyznała mi roczne stypendium na staż naukowy w National Heart & Lung Institute, Imperial College School of Medicine, Londyn, Wielka Brytania (od 2003 r. działającego jako Heart Science Centre), w celu realizacji projektu badawczego pt. "Regulacja metabolizmu energetycznego w mięśniu sercowym człowieka podczas niewydolności serca (rola receptorów aktywowanych przez proliferatory peroksysomalne)". Podczas pobytu w Heart Science Centre zebrałam bioptaty z dostarczonych do transplantacji serc dawców (grupa kontrolna) oraz bioptaty z serc biorców (eksplanty) z przewlekłą zastoinową niewydolnością serca, pobierane po zabiegu transplantacji serca. W zebranym materiale oznaczyłam ilość receptora jądrowego PPARα, izoformy PPAR dominującej w mięśniu sercowym. Wykazałam, że w niewydolnym mięśniu sercowym ilość tego receptora jest obniżona. Wyniki zostały zaprezentowane między innymi na 75th American Heart Association's Scientific Sessions, Chicago, USA. Był to pierwszy udokumentowany wynik wskazujący, że obniżenie ilości PPARα jest najbardziej prawdopodobną przyczyną zmiany preferencji substratów energetycznych w niewydolnym mięśniu sercowym z kwasów tłuszczowych na węglowodany. W 2003 r. dołączyłam do kierowanego przez Prof. Yacouba i dr Bartona interdyscyplinarnego zespołu badającego zmiany metaboliczne zachodzące w mięśniu sercowym pod wpływem klenbuterolu, agonisty receptorów β2-adrenergicznych wywołującego przerost mięśnia sercowego. Z pierwszych badań klinicznych przeprowadzonych przez zespół Prof. Yacouba wynikało, że u pacjentów z przewlekłą niewydolnością serca, którym wszczepiono urządzenie wspomagające pracę lewej komory (LVAD) nastąpiła zdecydowana poprawa, gdy wśród podawanych leków znajdował się klenbuterol. Molekularny mechanizm działania klenbuterolu w mięśniu sercowym nie jest jeszcze dobrze poznany. Uczestniczyłam w badaniach dotyczących wpływu klenbuterolu na przemiany metaboliczne zachodzące w przerośniętym sercu szczura. 12
Mój udział w badaniach polegał na określeniu zmian ekspresji genu PPARα i regulowanych przez ten receptor genów związanych z przemianami energetycznymi, jakie zachodzą w przerastającym pod wpływem klenbuterolu mięśniu sercowym. Wykorzystując szczurzy model przerostu mięśnia sercowego wykazałam, że podobnie jak u pacjentów z przewlekłą niewydolnością serca, ilość mrna PPARα w przerośniętym sercu ulega obniżeniu, czemu towarzyszy zmniejszona ekspresja genów kodujących kluczowe enzymy szlaku utleniania kwasów tłuszczowych (głównie MCPT-1). Soppa G.K., Smoleński R.T., Latif N., Yuen A.H., Malik A.H., Karbowska J., Kochan Z., Terracciano C.M., Yacoub M.H. (2005) Effects of chronic administration of clenbuterol on function and metabolism of adult rat cardiac muscle. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288: H1468-H1476. (IF = 3,560) Karbowska J., Kochan Z., Smoleński RT. (2003) Peroxisome proliferator-activated receptor α is downregulated in the failing human heart. Cell. Mol. Biol. Lett. 8: 49-53. (IF = 0,455) Karbowska J., Kochan Z., Murtuza B., Smoleński R.T. (2002) Decrease expression of peroxisome proliferator activated receptor alpha a possible mechanism for substrate switch in the failing human heart. Circulation 106 (S19): II98-II99. Udział zewnątrzkomórkowej degradacji nukleotydów w odrzucie międzygatunkowego przeszczepu serca W 2001 r. otrzymałam stypendium Fundacji im. Stefana Batorego, pokrywające koszty mojego 4-miesięcznego pobytu w National Heart & Lung Institute, Imperial College School of Medicine, Londyn, Wielka Brytania. W trakcie tego stypendium realizowałam projekt badawczy pt. "Udział zewnątrzkomórkowej degradacji nukleotydów w odrzucie międzygatunkowego przeszczepu serca": w ramach współpracy z zespołem prof. Yacouba prowadziłam hodowle komórek śródbłonka aorty człowieka i świni, a także brałam udział w badaniach aktywności enzymów odpowiedzialnych za zewnątrzkomórkową degradację nukleotydów purynowych i wewnątrzkomórkowy metabolizm adenozyny w komórkach śródbłonka ekto-5'-nukleotydazy (E5'N), deaminazy adenozyny (ADA) i kinazy adenozyny (AK). Przeprowadziliśmy również badania zmian aktywności enzymów katalizujących przemiany nukleotydów i nukleozydów purynowych w komórkach śródbłonka naczyń oraz w ekstraktach z serc pochodzących od transgenicznych świń z ludzkim czynnikiem DAF, jednym z białek układu dopełniacza. Wykazaliśmy, że w porównaniu z ludzkim mięsień sercowy świni charakteryzuje się przede wszystkim znacznie niższą aktywnością E5'N. Ponadto zaobserwowaliśmy, że kontakt z ludzką 13
krwią prowadzi do obniżenia aktywności E5'N zlokalizowanej na powierzchni komórek śródbłonka naczyń świni. Niska aktywność tego enzymu, odpowiedzialnego za zewnątrzkomórkową degradację nukleotydów purynowych ADP i AMP (działających prozapalnie i proagregacyjnie) do adenozyny (wykazującej działanie przeciwzapalne, antyagregacyjne i immunosupresyjne), może być przyczyną rozwoju procesu zapalnego i odrzutu przeszczepu międzygatunkowego. Khalpey Z., Yuen A.H., Kalsi K.K., Kochan Z., Karbowska J., Słomińska E.M., Forni M., Macherini M., Bacci M.L., Batten P., Lavitrano M., Yacoub M.H., Smoleński R.T. (2005) Loss of ecto-5' nucleotidase from porcine endothelial cells after exposure to human blood: implications for xenotransplantation. Biochim. Biophys. Acta 1741: 191-198. (IF = 2,382) Khalpey Z., Kalsi K., Yuen A., Karbowska J., Kochan Z., Słomińska E.M., Forni M., Bacci M., Macherini M., Batten P., Lavitrano M., Yacoub M.H., Smoleński R.T. (2005) Exposure to human blood inactivates swine endothelial ecto-5'-nucleotidase. Nucleos. Nucleot. Nucl. 24: 271-274. (IF = 0,565) Smoleński R.T., Khalpey Z., Yuen A., Dziewit H., Słomińska E.M., Borkowski T., Zdunek M., Kochan Z., Karbowska J., Lavitrano M., Yacoub M.H. (2005) Purine metabolism in pigs and humans and its implications for xenotransplantation. Nucleos. Nucleot. Nucl. 24: 263-266. (IF = 0,565) Badania nad molekularnym mechanizmem działania fibratów Badania zostały przeprowadzone w celu sprawdzenia, czy hipolipemizujące działanie fibratów jest związane z ich wpływem na ekspresję genów i aktywność enzymów szlaku lipogenezy w tkankach lipogennych: wątrobie oraz białej i brunatnej tkance tłuszczowej. Po dwutygodniowym podawaniu szczurom klofibratu, leku z grupy fibratów, zaobserwowaliśmy obniżenie stężenia triacylogliceroli i cholesterolu w osoczu badanych zwierząt. Niemniej jednak, badając lipogenezę in vivo zauważyliśmy u szczurów traktowanych klofibratem trend wzrostowy biosyntezy kwasów tłuszczowych w wątrobie, brak zmian w białej tkance tłuszczowej i obniżoną lipogenezę w brunatnej tkance tłuszczowej. Ekspresja genu kodującego kluczowy enzym lipogenny, syntazę kwasów tłuszczowych (FAS), pozostała bez zmian w wątrobie i w białej tkance tłuszczowej, uległa natomiast obniżeniu w brunatnej tkance tłuszczowej. Wykazaliśmy ponadto, że podawany szczurom klofibrat zwiększa ekspresję genu i aktywność enzymu jabłczanowego w wątrobie i w białej tkance tłuszczowej, natomiast obniża ekspresję genu i aktywność tego enzymu w brunatnej tkance tłuszczowej. Podobny profil zmian zaobserwowaliśmy w przypadku ekspresji genów kodujących karboksylazę acetylo-coa (ACC), 14
liazę ATP-cytrynianową (ACL) i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową (G6PDH) ekspresja tych genów wzrosła w białej tkance tłuszczowej i uległa obniżeniu w brunatnej tkance tłuszczowej szczurów traktowanych klofibratem. Podawanie klofibratu nie miało wpływu na ekspresję genu kodującego jedną z głównych adipokin, leptynę, w badanych tkankach tłuszczowych, białej i brunatnej. Wyniki tych badań wskazują, że mimo działania hipolipemizującego klofibrat wywołuje zwiększenie ekspresji genów enzymów lipogennych w białej tkance tłuszczowej, co przy długotrwałym podawaniu może prowadzić do przyrostu masy tej tkanki. Karbowska J., Kochan Z., Świerczyński J. (2000) Differential effect of clofibrate on acetyl-coa carboxylase mrna level in rat white and brown adipose tissue. Life Sci. 66: 545-552. (IF = 1,808) Karbowska J., Kochan Z., Żelewski L., Świerczyński J. (1999) Tissue-specific effect of clofibrate on rat lipogenic enzyme gene expression. Eur. J. Pharmacol. 370: 329-336. (IF = 2,047) Kochan Z., Karbowska J., Świerczyński J. (1999) Effect of clofibrate on malic enzyme and leptin mrnas level in rat brown and white adipose tissue. Horm. Metab. Res. 31: 538-542. (IF = 1,465) Badania nad patogenezą zaburzeń apetytu w eksperymentalnej przewlekłej niewydolności nerek Przewlekłej niewydolności nerek (CRF) często towarzyszy anoreksja i obniżenie masy ciała. W badaniach prowadzonych we współpracy z Katedrą i Kliniką Nefrologii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej w Gdańsku (obecnie Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego) na szczurzym modelu CRF podjęliśmy próbę określenia wpływu przewlekłej niewydolności nerek na ekspresję genów kodujących leptynę w tkance tłuszczowej i neuropeptyd Y (NPY) w podwzgórzu. Leptyna białko wydzielane głównie przez tkankę tłuszczową, którego stężenie we krwi jest ściśle związane z ilością zapasów energetycznych zgromadzonych w adipocytach odgrywa ważną rolę w regulacji metabolizmu energetycznego organizmu. Między innymi jako białkowy czynnik anoreksygenny obniżając apetyt bierze udział w długoterminowej regulacji pobierania pokarmu. Z kolei główną funkcją powstającego w podwzgórzu NPY jest zwiększanie apetytu i związana z tym regulacja masy ciała. Wykazaliśmy, że u szczurów z przewlekłą niewydolnością nerek ekspresja genu kodującego leptynę w tkance tłuszczowej ulega obniżeniu, jednak z powodu mniej wydajnego usuwania leptyny z krwi stężenie tej adipokiny mierzone w surowicy szczurów z CRF nie różni się znacząco od tego u szczurów kontrolnych. U szczurów z CRF zaobserwowaliśmy również wzrost ilości mrna NPY 15
w podwzgórzu, stężenia NPY w surowicy krwi oraz ilości mrna NPY w wątrobie. Wyniki tych badań wskazują, że osłabienie apetytu obserwowane w przewlekłej niewydolności nerek nie jest związane ze wzrostem stężenia leptyny we krwi ani z obniżeniem ekspresji genu kodującego NPY w podwzgórzu. Sucajtys-Szulc E., Karbowska J., Kochan Z., Wołyniec W., Chmielewski M., Rutkowski B., Świerczyński J. (2007) Up-regulation of NPY gene expression in hypothalamus of rats with experimental chronic renal failure. Biochim. Biophys. Acta 1772: 26-31. (IF = 4,041) Świerczyński J., Korczyńska J., Szołkiewicz M., Karbowska J., Kochan Z., Niewęgłowski T., Kusiak E., Rutkowski B. (2001) Low leptin mrna level in adipose tissue and normoleptinemia in experimental chronic renal failure. Exp. Nephrol. 9: 54-59. (IF = 1,881) Badanie właściwości enzymu jabłczanowego W latach 1994-1995 brałam udział w badaniach dotyczących właściwości enzymu jabłczanowego z mózgu w pomiarach aktywności enzymatycznej oraz w oczyszczaniu jego izoform. Po zmierzeniu aktywności tego enzymu w mózgach różnych gatunków kręgowców w tym człowieka, ptaków, gadów, płazów i ryb wykazaliśmy, że aktywność enzymu jabłczanowego w mózgu zwierząt stałocieplnych jest wielokrotnie wyższa (15-30 razy) niż u zwierząt zmiennocieplnych; jednak lokalizacja subkomórkowa tego enzymu była taka sama u wszystkich badanych gatunków dominowała aktywność izoformy mitochondrialnej, która stanowiła około 80% całkowitej aktywności enzymu jabłczanowego w mózgu. Wyniki tych badań sugerują, że mitochondrialna izoforma enzymu jabłczanowego katalizująca oksydacyjną dekarboksylację jabłczanu do pirogronianu zapewnia utrzymanie mitochondrialnej puli NADP + w formie zredukowanej, co z kolei pozwala na utrzymanie odpowiedniego poziomu zredukowanego glutationu, by chronić neurony przed toksycznym działaniem reaktywnych form tlenu. Ponadto badając obie izoformy enzymu jabłczanowego oczyszczone z mózgu człowieka cytosolową i mitochondrialną udowodniliśmy, że pomimo dużych różnic we właściwościach kinetycznych, katalitycznych i regulacyjnych, te izoenzymy prawie nie różnią się budową. Cząsteczki obu izoenzymów mają podobną strukturę drugorzędową, w której przeważa struktura uporządkowana α-helisa i β-harmonijka stanowią w sumie prawie 80% tej struktury. Enzym cytosolowy ma bardziej zwartą strukturę trzeciorzędową, a wiązanie jonów Mg 2+, aktywatora obu 16