Wielkość błędu systematycznego w ocenie GFR w zależności od stadium przewlekłej choroby nerek u dzieci Słowa kluczowe: ocena GFR, bias, standaryzacja, kreatynina, dzieci Key words: GFR estimation, bias, standardization, creatinine, children Wstęp Do rzeczywistej oceny przesączania kłębuszkowego (GFR) stosuje się egzogenne markery, takie jak inulina [1, 2, 3], EDTA-Cr 51 [4, 5] i iohexol [6]. Ten ostatni marker jest niejonowym polimerem fruktozy o niskiej osmolalności zawierającym jod. Iohexol nie wiąże się z białkami osocza, nie ulega wydzielaniu, resorpcji i metabolizmowi w nerce, a usuwany jest z krwi tylko drogą filtracji kłębuszkowej. Zgodność GFR wyznaczonego w oparciu o kilkukrotne pomiary stężenia iohexolu we krwi z klirensem inuliny i EDTA-Cr 51 dało podstawy zalecenia stosowania iohexolu do oceny GFR przez The National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (NKFDOQI) [6]. Nie każde laboratorium ma możliwość wyznaczania GFR w oparciu o pomiary stężenia iohexolu we krwi. Z tego powodu pomiar stężenia kreatyniny w surowicy pozostaje nadal podstawowym oznaczeniem w diagnostyce chorób nerek niezależnie od wieku pacjenta, natomiast oszacowanie GFR stanowi podstawę klasyfikacji przewlekłej choroby nerek [6, 7]. U dzieci szacowanie GFR jest szczególnie istotne w przypadku konieczności dokładnej oceny przebiegu choroby nerek lub gdy istnieje potrzeba stosowania leków silnie nefrotoksycznych [8]. Do szacowania GFR (estimated GFR, egfr) u dzieci stosuje się wzory Schwartza oraz Counahana-Barratta. Wzór Schwartza (z 1976 roku zmodyfikowany w 1985 roku) [9, 10] i Counahana-Barratta [11] opracowane były dla kreatyniny oznaczanej metodą Jaffego. Wzór Schwartza z 2009 roku uwzględnia natomiast stężenie kreatyniny oznaczane wystandaryzowaną metodą enzymatyczną [12]. U dorosłych stosuje się formułę MDRD (Modification of Diet in Renal Disease Study Group)[13]. Wiarygodność oznaczenia stężenie kreatyniny w surowicy krwi jest czynnikiem decydującym o użyteczności egfr. Metodą referencyjną do pomiaru stężenia kreatyniny jest metoda rozcieńczenia izotopowego i spektrometria masowa (isotope dilution mass spectrometry, ID-MS). Dokładność każdego oznaczenia laboratoryjnego zależy od standaryzacji metody i wykazania zgodności pomiarowej kalibratora ze wzorcem pierwszorzędowym [14]. Wprowadzona w ostatnich latach standaryzacja miała na celu wyeliminowanie międzylaboratoryjnych różnic w oznaczeniu stężenia tego parametru oraz poprawę dokładności w szacowaniu GFR [15], szczególnie w zakresie niskich i prawidłowych poziomów kreatyniny [16]. Dokładność oznaczenia stężenia kreatyniny jest najbardziej istotna w zakresie wartości 85-150 µmol/l, korespondujących (w zależności od wieku, płci, rasy i kalibratora bazującego na IDMS) z wartością egfr równą 60 ml/min/1,73m 2, która przyjmowana jest jako punkt odcięcia w diagnostyce przewlekłej choroby nerek. Z matematycznej zależności GFR od stężenia kreatyniny wynika, że im niższe stężenie kreatyniny, tym bardziej istotny jest wpływ błędu systematycznego i przypadkowego na egfr. Nawet niewielka zmiana stężenia kreatyniny może istotnie zmienić klasyfikację kliniczną pacjenta. Nie wiadomo jednak czy w związku z wprowadzeniem nowej standaryzacji metod oznaczania kreatyniny istnieje potrzeba przeliczania wartości egfr u pacjentów z przewlekłymi chorobami nerek, monitorowanych przez wiele lat. Celem podjętych badań była ocena błędu systematycznego oszacowania GFR przed i po standaryzacji metody oznaczania kreatyniny w zależności od stopnia zaawansowania choroby nerek u dzieci. Materiały i metody Analizie poddano wyniki GFR i egfr 307 pacjentów w wieku od 2 do 18 lat, (średnia 11,92 ± 4,08 lat) leczonych w Klinice Nefrologii Dziecięcej Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Krakowie. Każdy z pacjentów miał obliczony GFR ze wzoru Bröchner-Mortensen [17] w oparciu o stężenia iohexolu w osoczu oznaczonego w drugiej, trzeciej i czwartej godzinie po dożylnym podaniu Omnipaque 300 (Amersham Health AS) [18]. Wartość GFR uzyskaną z wykorzystaniem stężenia iohexolu przyjęto jako wartość referencyjną. W oparciu o wartości GFR określono stadia przewlekłej choroby nerek (pchn). Stężenie kreatyniny w surowicy krwi oznaczano metodą enzymatyczną (aminohydrolaza/oksydaza sarkozyny) na aparacie VITROS FS (Ortho Clinical Diagnostics). Do 1 marca 2010r. była to metoda zwalidowana względem HPLC. Od 1 marca 2010r. wprowadzono oznaczanie stężenia kreatyniny stosując nową kalibrację, a walidacja metody przez producenta wykonana była przy użyciu standardowego materiału referencyjnego SRM 967, w którym stężenie kreatyniny wyznaczone było za pomocą IDMS. W celu porównania wyników kreatyniny uzyskanych po 1 marca 2010 roku (IDMS CREA) z wynikami uzyskanymi przed standaryzacją, wartości w zakresie stężeń 44,2 do 221 µmol/l przeliczono według wzoru: CREA = IDMS CREA x 1,0355 + 11,834 zgodnie z zaleceniami producenta. Osobno analizowano wyniki uzyskane do marca 2010 roku, przed standaryzacją kreatyniny (grupa I, n=160) i wyniki uzyskane po tym okresie, po wprowadzeniu standaryzacji kreatyniny (grupa II, n=147). Wyniki GFR w 112 próbkach pacjentów grupy I i w 113 próbkach pacjentów grupy II wskazywały na pierwsze stadium przewlekłej choroby nerek, na drugie stadium odpowiednio 22 i 16, na trzecie stadium odpowiednio 17 i 12, a na czwarte stadium odpowiednio 9 i 6 próbek pacjentów. W grupie I wyniki stężenia kreatyniny poniżej 44,2 µmol/l stwierdzono w 21 próbkach, w zakresie od 44,2 do 221 µmol/l w 131 próbkach, powyżej 221 µmol/l w 8 próbkach. W grupie II wyniki stężenia kreatyniny 390
poniżej 44,2 µmol/l stwierdzono w 36 próbkach, w zakresie od 44,2 do 221 µmol/l w 106 próbkach a powyżej 221mol/l w 5 próbkach. Obliczenia statystyczne Za pomocą wzoru Schwartza z 2009 roku oszacowano GFR w oparciu o stężenie kreatyniny (egfr) i kreatyniny po korekcji (egfr kor ). Dla każdej pary wyników GFR i egfr; GFR i egfr kor obliczono bias (%). Uzyskane wartości bias poddano analizie w zależności od stadium przewlekłej choroby nerek oraz GFR. Oceniano rozkład zmiennych ciągłych pod kątem jego zgodności z rozkładem normalnym, stosując test Kołmogorowa-Smirnowa. Różnice pomiędzy wartościami średnich określono przy użyciu analizy wariancji Anova. Dla porównania grup użyto testu t-studenta. Jako testu post-hoc użyto test Tukeya dla różnych N. Wartość p<0,05 przyjęto za statystycznie znamienną. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu programu Statistica wersja 8.0. Wyniki Zależność procentowej wartości bias od GFR przedstawiono na ryc. 1 i ryc. 2. Nie stwierdzono różnic w odsetkowych wartościach bias przed i po kalibracji metody oznaczania kreatyniny, pod warunkiem wykonania zalecanego przez producenta przeliczenia wartości kreatyniny w zakresie stężeń 44,2-221 µmol/l (ryc. 1). W przypadku przeliczenia stężenia kreatyniny oznaczonej po kalibracji metody, w całym zakresie stężeń, uzyskane odsetkowe wartości bias były niższe niż przed kalibracją (ryc. 2). Na podstawie wartości GFR podzielono wyniki bias w zależności od stadium przewlekłej choroby nerek. Dla wszystkich stopni zaawansowania przewlekłej choroby nerek uzyskane średnie wartości bias miały wartości ujemne (ryc. 3). Dla Rycina 2. Zależność bias od GFR określonych w oparciu o klirens iohexolu. grupa II b stężenie kreatyniny oznaczone po standaryzacji metody i nieprawidłowo przeliczone w całym zakresie stężeń próbek, których wyniki wskazywały na I stadium przewlekłej choroby nerek, stwierdzono statystycznie znamiennie wyższą średnią wartość bias po standaryzacji (grupa II) w stosunku do wartości uzyskanych przed standaryzacją, p<0,001 (grupa I) oraz do wartości uzyskanych po standaryzacji, gdzie zastosowano przeliczenie kreatyniny dla zakresu stężeń 44,2-221 µmol/l, p<0,001 (grupa IIa). W przypadku II, III, IV stadium pchn nie zaobserwowano istotnych statystycznie różnic średniej wartości bias pomiędzy grupami, większy rozrzut wartości bias stwierdzono dla próbek, których wyniki wskazywały na II i III stopień pchn w porównaniu do wartości bias uzyskanych w I stadium pchn, niezależnie od kalibracji. Rycina 1. Zależność bias od GFR określonych w oparciu o klirens iohexolu. grupa II a stężenie kreatyniny oznaczone po standaryzacji metody i przeliczone w zakresie stężeń 44,2 do 221 µmol/l Rycina 3. Średnie wartości bias±se w zależności od stadium przewlekłej choroby nerek. grupa IIa stężenie kreatyniny oznaczone po standaryzacji metody i przeliczone w zakresie stężeń 44,2 do 221 µmol/l 391
Wielkość błędu systematycznego w ocenie GFR w zależności od stadium przewlekłej choroby nerek u dzieci Przeanalizowano zakresy wartości egfr uzyskane dla GFR (wyznaczonego w oparciu o klirens iohexolu). Dla GFR [ml/min/1,73m 2 ]: powyżej 90 ml/min/1,73m 2, od 60 do 89 ml/min/1,73m 2, od 30 do 59 ml/min/1,73m 2, wartości egfr mieściły się w bardzo szerokim zakresie, natomiast dla GFR pomiędzy 15-29 ml/min/1,73m 2 różnice były nieznaczne. Nie stwierdzono różnic w uzyskanych zakresach egfr zarówno w grupie I (oznaczenie stężenia kreatyniny wykonane przed standaryzacją metody) jak i w grupie II (oznaczenie stężenia kreatyniny wykonane po standaryzacji metody) (tabela I). Tabela I. Rzeczywiste wartości egfr uzyskane dla GFR określonych w oparciu o klirens iohexolu. GFR [ml/min/1,73m 2 ] egfr [ml/min/1,73m 2 ] grupa I grupa II grupa II a >90 42 156 59 143 52 143 60 89 38 112 37 135 33 101 30 59 17 78 22 100 22 53 15 29 14 24 13 30 13 27 grupa II a stężenie kreatyniny oznaczone po standaryzacji metody i przeliczone w zakresie stężeń 44,2 do 221 µmol/l. Dyskusja Współpraca pomiędzy National Kidney Disease Education Program (NKDEP), College of American Pathologists (CAP) i National Institute of Standards and Technology (NIST) zaowocowała przygotowaniem materiału referencyjnego do oznaczania kreatyniny w surowicy (NIST SRM 967), komutabilnego z natywnymi próbkami biologicznymi oznaczanymi metodami rutynowymi [14]. Nowy międzynarodowy standard kreatyniny został wprowadzony w 2007 roku. Według NKDEP, po wprowadzeniu nowej standaryzacji kreatyniny, realny do osiągnięcia błąd całkowity pomiaru kreatyniny, to maksymalnie 10% wzrost relatywnego błędu oszacowania GFR. Dlatego też stosowane rutynowo metody muszą wykazywać współczynnik zmienności międzylaboratoryjnej CV<8% oraz bias<5% dla wartości stężeń kreatyniny większych lub równych 88,4 µmol/l [14]. Klinicznie maksymalny akceptowalny udział błędu całkowitego oznaczania kreatyniny w błędzie całkowitym szacowania GFR wynosi 15% [15]. Największy wpływ błędu systematycznego i przypadkowego oznaczenia kreatyniny na egfr stwierdza się dla stężeń kreatyniny w zakresie wartości prawidłowych, jednak prawidłowe stężenie kreatyniny niekoniecznie jest równoznaczne z prawidłową funkcją nerek. Analizowane próbki pochodziły od pacjentów z przewlekłą chorobą nerek. W materiale biologicznym pacjentów w różnych stanach patologicznych mogą pojawiać się substancje interferujące w oznaczeniach biochemicznych (efekt matrycowy). Metody enzymatyczne oznaczania kreatyniny są uznawane za bardziej swoiste w porównaniu z reakcją Jaf- fego, ale również nie są wolne od interferencji. W literaturze opisano m.in. możliwość interferencji od bilirubiny [19], przeciwciał monoklonalnych IgM [20]. W obecnej pracy, niezależnie od zastosowanego kalibratora, uzyskano większy rozrzut wartości bias dla próbek, dla których GFR wskazywał na wyższe stadium przewlekłej choroby nerek (stadium II, III pchn) w stosunku do próbek z GFR wskazującym na stadium I pchn. Może to być spowodowane, związaną z zaawansowaniem choroby nerek, inną matrycą próbek. Termin matryca próbki określa wszystkie składniki znajdujące się w próbce z wyjątkiem oznaczanego analitu. Nie stwierdzono takiej zależności dla próbek z GFR wskazującym na IV stadium pchn, lecz była to grupa o najmniejszej liczebności. U pacjentów z przewlekłą chorobą nerek monitorowanych przez wiele lat istnieje konieczność przeliczania wartości egfr obliczonych w oparciu o stężenie kreatyniny zmierzone przed i po standaryzacji metody jej oznaczania. Jest to konieczne w zakresie stężeń kreatyniny od 44,2 do 221 µmol/l, natomiast nie powinno przeliczać się wartości egfr uzyskanych dla stężeń kreatyniny poniżej 44,2 µmol/l i powyżej 221 µmol/l (metoda enzymatyczna, aminohydrolaza/oksydaza sarkozyny, aparat VITROS FS). Po standaryzacji kreatyniny stwierdzono istotnie statystycznie wyższe średnie wartości bias (-21,6±1,2%) w stadium I pchn w stosunku do wartości uzyskanych przed standaryzacją kreatyniny (-30,2±1,4%), co może polepszyć diagnozowanie nowych pacjentów, u których uszkodzenie nerek przebiega z prawidłowym lub zwiększonym GFR. Referencyjnymi metodami oceny przesączania kłębuszkowego, jest wyznaczenie GFR w oparciu o inulinę, użycie znacznika izotopowego (EDTA-Cr 51 ) lub też w oparciu o wielokrotne pomiary stężenia iohexolu. Metody te nie są dostępne w pracowniach rutynowych, są to metody pracochłonne, czasochłonne a także kosztowne. Najczęściej w praktyce klinicznej ocenia się GFR w oparciu o wyniki oznaczenia stężeniu kreatyniny w surowicy z powodu stosunkowo niskiego kosztu jej oznaczenia. Jednak ocena egfr przy pomocy tego wskaźnika może być obarczona dużym błędem. Standaryzacja metody oznaczania kreatyniny nie polepszyła dokładności szacowania GFR, a co za tym idzie klasyfikacji pacjentów do stadium przewlekłej choroby nerek. Wniosek Standaryzacja metody oznaczania kreatyniny nie miała wpływu na dokładność szacowania GFR i nie wpłynęła na klasyfikację pacjentów do stadium pchn. U pacjentów z przewlekłą chorobą nerek monitorowanych przez wiele lat konieczne jest przeliczanie stężenia kreatyniny zgodnie z zaleceniami producenta. Piśmiennictwo 1. Berg UB, Back R, Celsi G, et al. Comparison of plasma clearance of iohexol and urinary clearance of inulin for measurement of GFR in children. Am J Kidney Dis 2011; 57: 55-61. 2. Gaspari F, Perico N, Ruggenenti P, et al. Plasma clearance of nonradioactive iohexol as a measure of glomerular filtration 392
rate. J Am Soc Nephrol 1995; 6: 257-63. 3. Sterner G, Frennby B, Mansson S, et al. Determining true glomerular filtration rate in healthy adults using infusion of inulin and comparing it with values obtained using other clearance techniques or prediction equations. Scand J Urol Nephrol 2008; 42: 278-85. 4. Bird NJ, Peters C, Michell AR, et al. Comparison of GFR measurements assessed from single versus multiple samples. Am J Kidney Dis 2009; 54: 278-88. 5. Krutzen E, Back SE, Nilsson-Ehle I, et al. Plasma clearance of a new contrast agent, iohexol: a method for the assessment of glomerular filtration rate. J Lab Clin Med 1984;104: 955-61. 6. National Kidney Foundation. K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease: evaluation, classification, and stratification. Am J Kidney Dis 2002; 39: S1-266. 7. Hogg RJ, Furth S, Lemley KV, et al. National Kidney Foundation s Kidney Disease Outcomes Quality Initiative clinical practice guidelines for chronic kidney disease in children and adolescents: evaluation, classification, and stratification. Pediatrics 2003; 111: 1416-21. 8. Leger F, Seronie-Vivien S, Makdessi J, et al. Impact of the biochemical assay for serum creatinine measurement on the individual carboplatin dosing: a prospective study. Eur J Cancer 2002; 38: 52-6. 9. Schwartz GJ, Haycock GB, Edelmann CM, et al. A simple estimate of glomerular filtration rate in children derived from body length and plasma creatinine. Pediatrics 1976; 58: 259-63. 10. Schwartz GJ, Gauthier B. A simple estimate of glomerular filtration rate in adolescent boys. J Pediatr 1985; 106: 522-6. 11. Counahan R, Chantler C, Ghazali S, et al. Estimation of glomerular filtration rate from plasma creatinine concentration in children. Arch Dis Child 1976; 51: 875-8. 12. Schwartz GJ, Munoz A, Schneider MF, et al. New equations to estimate GFR in children with CKD. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 629-37. 13. Levey AS, Bosch JP, Lewis JB, et al. A more accurate method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: a new prediction equation. Modification of Diet in Renal Disease Study Group. Ann Intern Med 1999; 130: 461-70. 14. Myers GL, Miller WG, Coresh J, et al. Recommendations for improving serum creatinine measurement: a report from the Laboratory Working Group of the National Kidney Disease Education Program. Clin Chem 2006; 52: 5-18. 15. Miller WG, Myers GL, Ashwood ER, et al. Creatinine measurement: state of the art in accuracy and interlaboratory harmonization. Arch Pathol Lab Med 2005; 129: 297-304. 16. Seronie-Vivien S, Galteau MM, Carlier MC, et al. Impact of standardized calibration on the inter-assay variation of 14 automated assays for the measurement of creatinine in human serum. Clin Chem Lab Med 2005; 43: 1227-33. 17. Brochner-Mortensen J. A simple method for the determination of glomerular filtration rate. Scand J Clin Lab Invest 1972; 30: 271-4. 18. Berska J, Bugajska J, Litwin A, et al. Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi. Diagn Lab 2011; 47(3): 269-273. 19. Peake M, Whiting M. Measurement of serum creatinine--current status and future goals. Clin Biochem Rev 2006; 27: 173-84. 20. Hummel KM, von Ahsen N, Kuhn RB, et al. Pseudohypercreatininemia due to positive interference in enzymatic creatinine measurements caused by monoclonal IgM in patients with Waldenstrom s macroglobulinemia. Nephron 2000; 86: 188-9. Adres do korespondencji: dr n. med. Jolanta Bugajska Zakład Biochemii Klinicznej Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii CMUJ 30-663 Kraków, ul. Wielicka 265 tel. +48 12 6582011 w. 1451 E-mail: jola.bugajska@uj.edu.pl Zaakceptowano do publikacji: 10.12.2013 393