Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2011 Volume 47 Number Praca oryginalna Original Article Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi Validation of the modified method for plasma iohexol concentration measurement Joanna Berska 1, Jolanta Bugajska 1, Anna Litwin 1, Katarzyna Zachwieja 2, Krystyna Sztefko 1 1 Zakład Biochemii Klinicznej, Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii CMUJ, Kraków, 2 Klinika Nefrologii Dziecięcej, Uniwersytecki Szpital Dziecięcy, Kraków Streszczenie Cel: Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi. Metoda: Iohexol oznaczono ilościowo na chromatografie cieczowym, wyposażonym w detektor absorpcyjny UV-VIS (Waters, USA). Wyniki: Liniowość metody mieściła się w zakresie od 5,06 do 647µg/ml. Wartość LOD (granica pomiaru) oraz LOQ (granica oznaczalności) wynosiły odpowiednio: 4,2µg/ml i 12,7µg/ml. Współczynnik korelacji (r) pomiędzy stężeniem iohexolu a polem powierzchni dla piku izomeru 2 iohexolu wyniósł 1,000. Współczynniki zmienności wewnątrz serii wynosiły poniżej 4,5%, natomiast między seriami poniżej 5,5%. Średni odzysk mieścił się w zakresie od 98,6 do 101,1%. Wniosek: Opracowana metoda oznaczania stężenia iohexolu z zastosowaniem standardu wewnętrznego przy użyciu kolumny XTerra (C18; 3,5 μm; 3,0 mm x 150 mm) i 4% roztworu acetonitrylu jako fazy ruchomej o m przepływie 0,4 ml/min nadaje się do ilościowego oznaczania iohexolu w osoczu krwi. Summary Aim: Validation of the modified method for plasma iohexol level measurement. Method: Iohexol have been determined on the liquid chromatograph with a UV-VIS detector (Waters, USA). Results: Linear working range of the method from 5,06 to 647µg/ml has been obtained. The value of LOD (limit of detection) and LOQ (limit of quantification) were respectively: 4,2µg/ml and 12,7µg/ml. The correlation coefficient (r) between the concentration of iohexol and area under the peak (isomer 2) was 1,000. Coefficients of variation within and between series were below 4,5% and below 5,5%, respectively. The mean value of recovery test was between 98.6 and 101.1%. Conclusion: Our new method for iohexol level measurement using the internal standard using a XTerra column (C18; 3,5 µm; 3,0 mm x 150 mm) and 4% solution of acetonitrile as mobile phase with isocratic flow of 0,4 ml/min is suitable for quantitative determination of iohexol in blood plasma. Słowa kluczowe: iohexol, HPLC, walidacja metody Key words: iohexol, HPLC, method validation Wstęp Ocena przesączania kłębuszkowego (GFR) jest niezbędnym elementem w diagnostyce chorób nerek. W celu oszacowania wielkości GFR stosuje się różne egzogenne i endogenne markery. Jednym z takich markerów jest iohexol, niejonowy polimer fruktozy o niskiej osmolalności, zawierający jod. Iohexol nie wiąże się z białkami osocza, nie ulega wydzielaniu, resorpcji i metabolizmowi w nerce, a usuwany jest z krwi tylko drogą filtracji kłębuszkowej. Wykazano zgodność oszacowania klirensu w oparciu o wielokrotne pomiary stężenia iohexolu z klirensem wyznaczonym w oparciu o inulinę (złoty standard) [2,7,15] i EDTA-Cr 51 [3,12]. Dzięki swoim właściwościom iohexol jest zalecany przez The National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (NKFDOQI) Guidelines [13]. Ilościowo stężenie iohexolu oznacza się za pomocą chromatografii cieczowej (HPLC) z zastosowaniem detektora absorpcyjnego [4,6,11,12,14] lub detektora masowego (MS) [1]. W dotychczas publikowanych pracach przedstawiających metody oznaczania iohexolu stosowano różne warunki rozdziału, m.in. różny skład, ph oraz przepływ fazy ruchomej oraz różny sposób elucji (gradientową lub izokratyczną), jak 269

2 Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi też kolumny chromatograficzne o zróżnicowanej długości i wypełnieniu, co sprawiało, że czasy trwania analiz znacznie się od siebie różniły. Ponadto, tylko nieliczni autorzy stosowali standard wewnętrzny wykorzystując pole powierzchni tego piku do obliczeń ilościowych [11,14]. Badania klirensowe, szczególnie prowadzone u dzieci, wymagają wiarygodnego oznaczenia stężenia odpowiedniego markera, dlatego ważne jest zawsze określenie takich parametrów metody jak: zakres liniowości, granica wykrywalności, granica oznaczalności, powtarzalność, dokładność i swoistość metody [5,9,10]. Cel pracy Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi i porównanie jej z metodami w piśmiennictwie. Materiał i metody badań Warunki rozdziału na chromatografie. Rozdziały próbek przeprowadzano na chromatografie cieczowym (Waters), wyposażonym w detektor absorpcyjny UV-VIS oraz dozownik automatyczny 717 Plus. Do rozdziału zastosowano kolumnę XTerra (C18; 3,5μm; 3,0mm x 150mm firmy Waters). Na kolumnę podawano 10μl próbki. Temperatura kolumny wynosiła 30 C, a długość fali detektora 254nm. Rozdział przeprowadzano w warunkach ch. Fazę mobilną stanowiła mieszanina woda-acetonitryl (96:4, v/v). Przy przepływie 0,4 ml/min całkowity czas rozdziału jednej próbki wynosił 15 minut. Zbieranie oraz opracowywanie danych przeprowadzono za pomocą programu Empower firmy Waters. Kalibracja metody. Stosując wzorzec Omnipaque 300 firmy Amersham Health AS (zawierający 647mg Iohexolu/ml) przygotowano serię ośmiu roztworów wzorcowych o następujących stężeniach iohexolu: 5,06µg/ml, 10,1µg/ml, 20,2µg/ml, 40,4µg/ml, 80,9µg/ml, 161,8µg/ml, 323,5µg/ml i 647µg/ml, które wykorzystano do przygotowania krzywej kalibracyjnej. Do 100µl każdego roztworu wzorcowego dodawano 25µl standardu wewnętrznego (IS - Iohexol Related Compound B firmy USP) oraz 800µl wody, próbki mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie wirowano przez 20 minut przy 5000 obrotów na minutę. Oznaczenia stężenia iohexolu w roztworach wzorcowych wykonano trzykrotnie a krzywą kalibracyjną ustalono w oparciu o wartości średnie uzyskane dla każdego stężenia wzorca. Piki iohexolu identyfikowano na podstawie czasów retencji. Analizę ilościową przeprowadzono w oparciu o zależność pomiędzy sygnałem z detektora, którego miarą jest powierzchnia piku iohexolu, a jego stężeniem. Ustalono zakres liniowości i współczynnik korelacji (r) pomiędzy stężeniem iohexolu a polem powierzchni pików w przygotowanych roztworach kalibracyjnych. Do oceny statystycznej wykorzystano średnie arytmetyczne, odchylenie standardowe i współczynniki zmienności. Stężenie iohexolu podano w µg/ml. Powtarzalności rozdziałów chromatograficznych W celu oceny powtarzalności rozdziałów wykonano 22-krotny pomiar jednej próbki osocza, obliczono średni czas retencji i współczynnik zmienności. Granica pomiaru i granica oznaczalności Granicę pomiaru dla iohexolu (LOD) wyznaczono z krzywej kalibracyjnej na podstawie wzoru: LOD=3,3 x s yx /α, gdzie: s yx odchylenie standardowe, α - współczynnik kierunkowy prostej (tangens kąta nachylenia). Granicę oznaczalności (LOQ) obliczono według wzoru: LOQ= 10 x s yx /α. Powtarzalność wewnątrz serii i między seriami Powtarzalność wewnątrz serii określono w oparciu o 21-krotne oznaczenie jednej próbki przeprowadzone w tych samych warunkach pomiarowych, natomiast powtarzalność między seriami określono w oparciu o 21 niezależnie przygotowanych próbek oznaczonych w ciągu 14 dni. Obliczono współczynniki zmienności oznaczeń (CV) wewnątrz serii i między seriami. Ocena odzysku Dla oceny odzysku, próbkę osocza, która nie zawierała iohexolu, obciążono iohexolem (Omnipaque) o następujących stężeniach: 16,18µg/ml, 32,35µgS/ml, 64,7µg/ml, 129,4µg/ ml, 647µg/ml. Każde obciążenie wykonano trzykrotnie. Oznaczanie stężenia iohexolu w osoczu Grupę badaną stanowiło 90 dzieci w wieku od 2 do 20 lat (średnia: 12,7 ± 4,5 lat), u których wykonano oznaczenie klirensu iohexolu. W tym celu, pacjentom podawano dożylnie Omnipaque 300 firmy Amersham Health AS w dawce 5ml dla pacjentów o masie poniżej 40kg oraz 10ml dla pacjentów o masie powyżej 40kg (1ml preparatu Omnipaque 300 zawiera 647mg iohexolu). Następnie pacjentom pobierano krew włośniczkową na EDTA w drugiej, trzeciej i czwartej godzinie po podaniu preparatu. Po odwirowaniu próbek, uzyskane osocze (100µl) odbiałczano stosując 800µl 5% kwasu nadchlorowego. Następnie, do każdej próbki dodawano 25μl standardu wewnętrznego, próbki mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 minut a następnie wirowano przez 20 minut przy 5000 obrotów na minutę. Nadsącz rozdzielano na chromatografie. Porównano parametry prezentowanej metody z metodami oznaczania iohexolu opisanymi w literaturze (tabela I). Zestawiono rodzaje stosowanych kolumn chromatograficznych, skład i przepływ fazy ruchomej oraz uzyskane przez autorów danych metod współczynniki zmienności wewnątrz serii i między seriami, liniowość, odzysk i granice wykrywalności oraz oznaczalności. Wyniki Na rycinie 1. przedstawiono przykładowy rozdział chromatograficzny roztworu wzorcowego, uzyskany za pomocą opracowanej metody. Na chromatogramie obecne są piki dwóch izomerów iohexolu i pik standardu wewnętrznego. Średni procentowy udział pola powierzchni piku dla izomeru 1 wynosił: 19,7 ± 0,3% a dla izomeru 2: 80,3 ± 0,3% niezależnie od stężenia iohexolu w próbce i rodzaju próbki (wzorzec, 270

3 J. Berska i inni Tabela I. Porównanie parametrów metody oznaczania stężenia iohexolu z metodami opisanymi w literaturze. Krutzen i wsp Soman i wsp Farthing i wsp Klenner i wsp Cavalier i wsp Annesley i wsp. Opisywana metoda 2009 Model aparatu długość fali detektora ALC/GPC 204 HPLC 440 UV 254nm Hitachi D-7000 HPLC-UV HP 1090 HPLC HPLC-UV 264 nm Hewlett-Packard 1100 UPLC-MS/MS Waters UV Kolumna Nucleosil 5 200x4,6 mm μbondapak 10μm 150x3,9 mm Supleco 5μm 250x4,0 mm RP-8,RP-18, RP-30 Lichrospher Merck 5μm 250x4,0 mm Watres Oasis HLB 5μm 21x20 mm XTerra 3,5μm 150x3 mm Faza ruchoma ph przepływ 5% ACN 2,5 1,5 ml/min 4%ACN 14%ACN 0,8 1,2 ml/min 0,1% TFA, MeOH 2,2 1 ml/min buf. fosf.:meoh brak danych brak danych 5% ACN 3 1 ml/min ACN/HCOOH 0,4 ml/min 4% ACN 0,4 ml/min Czas rozdziału 8 min 12 min 20 min 45 min 6 min 1,5 min 15 min Standard wewnętrzny (IS) bez + bez + bez + + Temperatura kolumny brak danych 30 C 40 C brak danych 40 C 50 C 30 C CV wewnątrz serii [%] dla niskich stężeń dla wysokich stężeń 1,5 0,5 3,7 0,5 7,8 4,8 brak danych 15 2,4 5,0 2,1 4,5 2,3 CV między seriami [%] dla niskich stężeń dla wysokich stężeń 7,5 3,2 3,2 1,6 7,8 4,8 brak danych 17 2,7 6,3 4,0 5,5 3,7 Liniowość [μg/ml] brak danych , , LOD [μg/ml] brak danych 6 ~1 brak danych 3,08 brak danych 4,2 LOQ [μg/ml] brak danych brak danych 10,76 2,5 12,7 Odzysk [%] ,9 96,9 99,2 73,6 82,6 brak danych ,6 101,1 271

4 Walidacja zmodyfikowanej metody oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi Tabela II. Powtarzalność wewnątrz serii i między seriami dla próbek o niskim i wysokim stężeniu iohexolu. Powtarzalność - wewnątrz serii CV [%] - między seriami CV [%] stężenie iohexolu 29,7 µg/ml 129,5 µg/ml 4,5 2,3 5,5 3,7 Rycina 1. Rozdział chromatograficzny roztworu wzorcowego o stężeniu iohexolu 161,8 µg/ml. osocze pacjenta). Ze względu na znacznie większe pole powierzchni izomeru 2 iohexolu, w porównaniu do izomeru 1, do kalibracji i ilościowego oznaczania iohexolu w próbkach pacjentów wykorzystano pole powierzchni izomeru 2. Średni czas retencji izomeru 2 iohexolu wynosił 4,52 ± 0,02min (CV= 0,46%). Zależność pola powierzchni piku izomeru 2 iohexolu od stężenia iohexolu dla krzywej kalibracyjnej opisuje równanie prostej: y = 4192,5x 9470,1 a współczynnik korelacji wynosi r = 1,000 (ryc.2). Zakres liniowości dla opracowanej metody mieści się w granicach od 5,06 do 647μg/ml, zaś granica pomiaru i granica oznaczalności wynoszą odpowiednio: 4,2μg/ml i 12,7μg/ml. Rycina 2. Krzywa kalibracyjna iohexolu. W tabeli II przedstawiono wyniki oznaczeń powtarzalności wewnątrz serii i między seriami dla próbek o niskim i wysokim stężeniu iohexolu. Odzysk dla próbki obciążonej kolejno iohexolem o stężeniu od 16,18μg/ml do 647μg/ml wynosi 98,6 101,1%. Dyskusja Ilościowo stężenie iohexolu w osoczu krwi można oznaczyć za pomocą HPLC z detektorem absorpcyjnym lub stosując chromatografię cieczową sprzężoną ze spektrometrią masową (LC/MS-MS), która daje najkrótszy czas analizy i najniższe CV, najlepsze odzyski oraz zakresy wykrywalności iohexolu [1], jednak wiąże się z bardzo dużymi kosztami aparaturowymi. Przedstawiona metoda ilościowego oznaczania stężenia iohexolu, z wykorzystaniem HPLC z UV-VIS, jest modyfikacją izokratycznej metody opisanej przez Krutzen i wsp. [12], polegającą na zastosowaniu wzorca wewnętrznego, podobnie jak stosowali to Soman i wsp. [14]. Autorzy Ci, przeprowadzali jednak elucję gradientową zmieniając zarówno skład fazy ruchomej jak i jej przepływ podczas trwania analizy. Każdy rozdział chromatograficzny wykonywany z zastosowaniem elucji gradientowej wymaga, nie tylko większego nakładu pracy diagnosty laboratoryjnego (przygotowywanie dodatkowych roztworów do elucji), ale także dodatkowej pompy. Za pomocą opisanej metody oba izomery iohexolu są wykrywalne i dobrze rozdzielone (ryc.1). Powierzchnia każdego z nich może być używana do ilościowego wyliczania stężenia iohexolu, jednak Soman i wsp. [14] oraz Krutzen i wsp. [12] zalecają stosowanie do obliczeń ilościowych pik iohexolu (izomer 2) o większej powierzchni. Porównanie powierzchni obydwu pików izomerów iohexolu, wykonane dla różnych stężeń iohexolu potwierdza także, że stosunek tych izomerów jest stały i nie zależy od początkowego stężenia iohexolu w próbce. Powierzchnia izomeru 2 stanowiła 80% powierzchni całkowitej. Skład fazy ruchomej oraz jej ph, długość i wypełnienie kolumny, wielkość przepływu i sposób eucji, wpływają na czasy retencji oznaczanych analitów. W metodach oznaczania iohexolu opisywanych przez różnych badaczy stosowano kolumny chromatograficzne o różnej długości i wypełnieniu (najczęściej kolumna C18 o wielkości ziaren od 5-10μm), które wymagały zastosowania różnego przepływu fazy ruchomej i różnego sposobu elucji (gradientowa, izokratyczna). W związku z tym całkowite czasy rozdziału znacznie się od siebie różniły i wahały się w zakresie od 8 do 45 minut. Najczęściej stosowaną fazą ruchomą był roztwór acetonitrylu, który też został zastosowany w naszej metodzie. Niektórzy autorzy [4,12] dodatkowo zakwaszali fazę ruchomą do ph 2,5 lub 3, co w prezentowanej metodzie nie było stosowane. W przedstawionej przez nas metodzie zastosowano elucję izokratyczną, czas rozdziału wynosił 15 minut a przepływ fazy ruchomej 0,4ml/min i był najniższy wśród opisanych w literaturze. 272

5 J. Berska i inni Otrzymany zakres liniowości krzywej kalibracyjnej 5,06 647μg/ml jest szerszy od uzyskanego przez Klenner i wsp. [11] oraz Farthing i wsp. [6] natomiast węższy od uzyskanego przez Cavalier i wsp. [4], lecz wystarczający w rutynowej praktyce. Stężenie iohexolu po podaniu 5ml preparatu Omnipaque pacjentom, przeciętnie znajduje się w zakresie μg/ml w zależności od aktualnego stanu nerek i czasu jaki upłynął między podaniem preparatu a pobraniem krwi do badania (2, 3 lub 4 godziny). Wartości LOD i LOQ które wynosiły odpowiednio 4,2μg/ml i 12,7μg/ml, istotne dla oceny niskich stężeń iohexolu są porównywalne z tymi jakie otrzymali Cavalier [4] i Soman [14]. CV wewnątrz serii oraz między seriami są niskie (<5,5%) i porównywalne do otrzymanych przez Soman i wsp.[14] co świadczy o bardzo dobrej powtarzalności i odtwarzalności opisywanej metody rozdziału iohexolu. Dla stosowanej przez nas metody oznaczania iohexolu uzyskano podobnie jak Soman i wsp. [14] i Farthing i wsp. [6] wysokie wartości odzysku: 98,6 101,1%, które są wyższe od otrzymanych przez Klenner i wsp. [11]. Świadczą one o dobrej dokładności metody. Dla oceny stabilności aparatury oraz powtarzalności systemu konieczne jest wyznaczenie dla minimum 5 próbek średniego czasu retencji oraz CV. Wartości czasów retencji powinny być stałe a dopuszczalne CV czasów retencji powinno wynosić <1% [8]. Otrzymana przez nas wartość CV dla czasów retencji 0,46% spełnia to założenie i świadczy o doskonałej stabilności i powtarzalności stosowanego systemu pomiarowego. Wniosek Opracowana metoda oznaczania stężenia iohexolu z zastosowaniem standardu wewnętrznego przy użyciu kolumny XTerra (C18; 3,5μm; 3,0mm x 150mm) i 4% roztworu acetonitrylu jako fazy ruchomej o m przepływie 0,4ml/min, nadaje się do ilościowego oznaczania stężenia iohexolu w osoczu krwi. rate. J Am Soc Nephrol 1995; 6: Ghulam AS. Validation of high-performance liquid chromatography methods for pharmaceutical analysis Understanding the differences and similarities between validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the International Conference on Harmonization J Chromatogr A Feb 14; 987 (1-2): International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use: Text on Validation of Analytical Procedures, ICH-Q2A, Geneva International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use: Validation of Analytical Procedures: Methodology, ICH-Q2B, Geneva Klenner S, Bergmann C, Strube K i wsp. SPE for Endo- and Exo-Iohexol Analysis with HPLC in Canine Serum and Rat Urine. Chromatogr 2007; 65, June. 12. Krutzen E, Bäck S, Nilsson-Ehle I i wsp. Plasma clearance of new contrast agent, iohexol: A method for the assessment of glomerular filtration rate. J Lab Clin Med 1984; 104: NKF DOQI Guideslines: Estimation of GFR. Am J Kidney Dis 2002; 39: Soman R, Zahir H, Akhlaghi F Development and validation of an HPLC-UV method for determination of iohexol in human plasma. J Chromatogr B 2005; 816: Sterner G, Frennby B, Mansson S i wsp. Determining true glomerular filtration rate in healthy adults using infusion of inulin and comparing it with values obtained using other clearance techniques or prediction equation Scand. J Urol Nephrol 2008; 42, 278. Adres do korespondencji: Joanna Berska Zakład Biochemii Klinicznej Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii CMUJ ul. Wielicka 265, Kraków joanna.berska@uj.edu.pl Zaakceptowano do publikacji: Piśmiennictwo 1. Annesley T, Clayton L Ultraperformance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Assay for Iohexol in Human Serum. Clin Chem 2009, 55: Berg UB, Back R, Celsi G i wsp. Comparison of Plasma Clearance of Iohexol and Urinary Clearance of Inulin for Measurement of GFR in Children. Am J Kidney Dis Sep Bird N, Peters C, Michell A i wsp. Comparison of GFR Measurements Assessed From Single Versus Multiple Samples. Am J Kidney Dis 2009 Aug No 2 Vol Cavalier E, Rozet E, Dubois N i wsp. Performance of iohexol determination in serum and urine by HPLC: Validation, risk and uncertainly assessment. Clin Chim Act 2008; 396: EURACHEM Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Method, First Internet Version, Farthing D, Sica D, Fakhry I i wsp. Simple HPLC-UV method for determination of iohexol, iothalamate, p-aminohippuric acid and n-acetyl-p-aminohippuric acid in human plasma and urine with ERPF, GFR and ERPF/GFR ratio determination using colorimetric analysis. J Chromatogr B 2005; 826: Gaspari F, Perico N, Ruggenenti P i wsp. Plasma clearance of nonradioactive iohexol as a measure of glomerular filtration 273