COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test HCMCAP

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test HCMCAP 48 Tests P/N: 03568547 190 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: 03587797 190 Wash Reagent PRZEZNACZENIE Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV jest testem in vitro, opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego do ilościowego oznaczania RNA wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV, Hepatitis C Virus) w ludzkim osoczu lub surowicy przy użyciu aparatu COBAS AmpliPrep do automatycznego przygotowywania próbek oraz analizatora COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 do automatycznej amplifikacji i detekcji. Test ten, łącznie z objawami klinicznymi i innymi markerami laboratoryjnymi zakażenia HCV, znajduje zastosowanie w opiece klinicznej nad chorymi z przewlekłym zakażeniem HCV. Może być stosowany do oceny prawdopodobieństwa długotrwałej odpowiedzi wirusowej we wczesnej fazie leczenia przeciwwirusowego, jak również do oceny odpowiedzi wirusowej na leczenie przeciwwirusowe, mierzonej zmianą poziomu RNA HCV w surowicy lub osoczu. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV nie jest przeznaczony do przesiewowego badania na obecność wirusa HCV we krwi lub produktach krwiopochodnych ani do stosowania jako test diagnostyczny, potwierdzający zakażenie wirusem HCV. PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIE TESTU Wirus zapalenia wątroby typu C 1 uważany jest za główny czynnik etiologiczny odpowiedzialny za 90 95% przypadków potransfuzyjnego wirusowego zapalenia wątroby nie-a i nie-b 2,3. HCV to wirus zawierający pojedynczy łańcuch sensowny RNA, którego genom zawiera około 10 000 nukleotydów kodujących 3000 aminokwasów. Jako wirus występujący we krwi, HCV może być przenoszony przez krew i produkty krwiopochodne. Powszechnie przyjęte badania przesiewowe krwi w kierunku obecności wirusa HCV doprowadziły do znacznego obniżenia ryzyka zapalenia wątroby związanego z transfuzjami. Największa częstość zakażeń wirusem HCV występuje w związku z nadużywaniem narkotyków dożylnych oraz, w mniejszym stopniu, z innymi rodzajami przezskórnej ekspozycji 3. Częstość występowania zakażenia HCV określana na drodze testów immunoserologicznych wynosi od 0,6% w Kanadzie do 1,5% w Japonii 2. Z uwagi na obecność przeciwciał anty-hcv u pacjentów zakażonych HCV opracowano testy immunoserologiczne swoiste dla tych przeciwciał. Obecność przeciwciał przeciwko HCV jest jednak miarą wcześniejszego narażenia na zakażenie i nie może być uważana za marker aktualnego zakażenia. Ponadto nie jest dostępny sposób bezpośredniej detekcji za pomocą metod hodowli wirusowej, choć możliwe jest wykrywanie antygenu rdzeniowego HCV. Pomiar aktywności aminotransferazy alaninowej (ALT) jest uważany za zastępczy wskaźnik zakażenia HCV. Nie jest jednak sposobem bezpośredniej oceny wiremii. Stopień zwiększenia aktywności ALT nie może być bezpośrednio skorelowany z poziomem zakażenia HCV. W rzeczywistości aktywność ALT może być zwiększona przez liczne przyczyny zapalenia wątroby. Należy do nich m.in. wirusowe zapalenie wątroby. Z drugiej strony, wykrycie i oznaczenie ilościowe RNA HCV za pomocą amplifikacji kwasu nukleinowego metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) pozwala na stwierdzenie aktywnej wiremii 4-6. Za pomocą PCR możliwe jest wykrycie wiremii HCV przed konwersją serologiczną 7,8 oraz wykrycie zmian w zawartości wirusa w organizmie w trakcie leczenia interferonem u chorych z przewlekłym zakażeniem HCV z obecnością przeciwciał 9. ZASADY PROCEDURY Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV jest testem amplifikacji kwasu nukleinowego służącym do ilościowego oznaczania RNA wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV, Hepatitis C Virus) w ludzkiej surowicy lub osoczu. Przygotowanie próbki odbywa się w sposób automatyczny w aparacie COBAS AmpliPrep, a zautomatyzowana amplifikacja i detekcja w analizatorze COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV oparty jest na trzech głównych procesach: (1) przygotowaniu próbki w celu wyizolowania RNA HCV; (2) odwrotnej transkrypcji docelowego RNA w celu wygenerowania komplementarnego DNA (cdna), (3) jednoczesnej amplifikacji PCR docelowego cdna i detekcji rozszczepionej podwójnie znakowanej sondy oligonukleotydowej, swoistej dla łańcucha docelowego. Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu. 05998212049-03PL 1 Doc Rev. 9.0

Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV umożliwia automatyczne przygotowanie próbki, a następnie automatyczną odwrotną transkrypcję, amplifikację PCR oraz detekcję docelowego RNA HCV i Armored RNA standardu oznaczania HCV (Quantitation Standard QS). Odczynnik Master Mix zawiera primery i sondy swoiste zarówno dla RNA HCV, jak i Armored RNA HCV QS. Odczynnik Master Mix został opracowany tak, aby zapewnić podobną ocenę ilościową genotypów HCV od 1 do 6. Detekcję amplifikowanego DNA przeprowadza się za pomocą podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych, swoistych dla łańcucha docelowego i dla standardu QS, co pozwala na niezależną identyfikację amplikonu HCV oraz amplikonu HCV QS. RNA wirusa HCV oznacza się ilościowo za pomocą standardu oznaczania HCV QS. Rekompensuje on wpływ hamowania oraz kontroluje proces przygotowywania i amplifikacji, pozwalając uzyskać dokładniejsze oznaczenie ilościowe RNA HCV w każdej próbce. Standard oznaczania HCV QS to niezakaźny konstrukt Armored RNA, zawierający sekwencje HCV o identycznych miejscach wiązania primerów jak docelowy RNA HCV oraz charakterystyczne miejsce wiązania sondy, co umożliwia zróżnicowanie amplikonu HCV QS od amplikonu HCV. Standard HCV QS jest dodawany do każdej próbki w znanej liczbie kopii i wraz z nią przechodzi przez proces przygotowania, odwrotnej transkrypcji, amplifikacji PCR oraz detekcji rozszczepionej podwójnie znakowanej sondy oligonukleotydowej. Analizator COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 oblicza stężenie RNA HCV w badanych próbkach przez porównywanie sygnału HCV z sygnałem HCV QS dla każdej próbki i kontroli. Wybór sekwencji docelowej Wybór docelowej sekwencji RNA dla HCV uzależniony jest od identyfikacji w obrębie genomu HCV regionów wykazujących maksymalny konserwatyzm spośród różnych genotypów HCV 10,11. Próbki HCV RNA oraz HCV QS RNA przygotowywane są techniką utrwalania na krzemionce, a jako primery w procesie amplifikacji RNA HCV i RNA HCV QS wykorzystywane są określone oligonukleotydy. Podwójnie znakowane sondy oligonukleotydowe, swoiste dla sekwencji docelowej oraz swoiste dla standardu QS, pozwalają na niezależną identyfikację amplikonów HCV oraz HCV QS. Dlatego też właściwy wybór odcinków primerowych oraz podwójnie znakowanej sondy oligonukleotydowej ma kluczowe znaczenie dla zdolności testu do amplifikacji i detekcji genotypów wirusa HCV. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV wykorzystuje w reakcjach odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR primery, które definiują sekwencję w obrębie wysoce konserwatywnego, nieulegającego translacji regionu 5' genomu HCV 12. Sekwencja nukleotydów odcinków primerowych została zoptymalizowana w taki sposób, aby zapewnić porównywalną amplifikację genotypów HCV. Przygotowanie próbki Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV wykorzystuje automatyczne przygotowywanie próbek w aparacie COBAS AmpliPrep techniką utrwalania na krzemionce. W procedurze używana jest objętość 850 µl osocza lub surowicy. Cząstki wirusa HCV poddawane są lizie poprzez inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do lizy/wiążącym, który uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony RNA HCV przed znajdującymi się w surowicy lub osoczu cząsteczkami RNazy. Do każdej próbki wraz z odczynnikiem lizującym i cząsteczkami szkła magnetycznego wprowadzana jest proteaza oraz znana liczba cząsteczek RNA HCV QS. Mieszanina poddawana jest następnie inkubacji, a RNA HCV oraz RNA HCV QS ulegają związaniu na powierzchni cząsteczek szkła magnetycznego. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, ulegają usunięciu na drodze przepłukiwania cząsteczek szkła magnetycznego. Po oddzieleniu cząsteczek szkła i zakończeniu procesu przepłukiwania adsorbowane kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu przy użyciu roztworu wodnego w podwyższonej temperaturze. Tak przygotowana próbka, zawierająca cząsteczki szkła magnetycznego oraz uwolnione RNA HCV i RNA HCV QS, dodawana jest do mieszaniny do amplifikacji i umieszczana w analizatorze COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48. Docelowe RNA HCV i RNA HCV QS są następnie poddawane odwrotnej transkrypcji, amplifikacji i jednoczesnej detekcji przez rozszczepienie podwójnie znakowanej sondy oligonukleotydowej swoistej dla docelowego RNA oraz dla standardu QS. Odwrotna transkrypcja oraz amplifikacja PCR Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR przeprowadza się z użyciem termostabilnego, rekombinowanego enzymu polimerazy DNA Thermus specie (Z05). W obecności manganu (Mn 2+ ) i w odpowiednich warunkach układu buforowego, Z05 wykazuje aktywność zarówno odwrotnej transkryptazy, jak i polimerazy DNA 13,14. Umożliwia to prowadzenie odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR równocześnie z detekcją amplikonu w czasie rzeczywistym. Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (K-tubes), gdzie zachodzi zarówno odwrotna transkrypcja, jak i amplifikacja PCR. Mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby primer antysensowny mógł wtopić się swoiście w docelowy RNA HCV oraz w RNA HCV QS. W obecności jonów Mn 2+ i nadmiarze trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dntp, deoxynucleoside triphosphate), do których należą trójfosforany dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny, polimeraza Z05 wydłuża primery związane z nicią RNA, tworząc nić DNA komplementarną do docelowego RNA. 05998212049-03PL 2 Doc Rev. 9.0

Amplifikacja sekwencji docelowej Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji docelowego RNA HCV oraz RNA HCVQS termocykler w analizatorze COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 podgrzewa mieszaninę reakcyjną, aby doprowadzić do denaturacji hybrydy RNA:cDNA i odsłonięcia docelowych sekwencji swoistych dla primera. Podczas schładzania mieszaniny primery hybrydyzują do DNA docelowego. Termostabilna polimeraza DNA Thermus specie Z05 (Z05) w obecności jonów Mn 2+ oraz nadmiaru trójfosforanów dezoksynukleotydów (dntp), w tym dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny (zamiast tymidyny), wydłuża przyłączone w wyniku hybrydyzacji primery wzdłuż docelowej matrycy, tworząc dwuniciową cząsteczkę DNA zwaną amplikonem. Analizator COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym cyklu zmierzając do podwojenia ilości amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana w analizatorze COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48. Amplifikacja zachodzi wyłącznie w regionie genomu wirusa HCV znajdującym się pomiędzy primerami; cały genom HCV nie ulega zwielokrotnieniu. Amplifikacja wybiórcza W teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV amplifikację wybiórczą docelowego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej osiąga się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę 15, lecz nie DNA zawierającego dezoksytymidynę. W DNA występującym w naturze nie stwierdza się dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie, ze względu na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród trójfosforanów dezoksynukleotydu w odczynniku Master Mix; dlatego też dezoksyurydynę zawiera wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Pod działaniem enzymu AmpErase zniszczeniu ulegają także wszelkie nieswoiste produkty reakcji powstałe po wstępnej aktywacji odczynnika Master Mix przez jony manganu. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, w którym znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase, gdy zostanie wystawiony na działanie temperatur powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, pozostaje nieaktywny przez dłuższy czas i dlatego też nie niszczy docelowego amplikonu, utworzonego w wyniku reakcji PCR. Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS TaqMan Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV wykorzystuje technologię reakcji PCR czasu rzeczywistego 16,17. Zastosowanie sond podwójnie znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym pozwala na detekcję w czasie rzeczywistym gromadzenia się produktu reakcji PCR przez monitorowanie intensywności emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych, uwalnianych w trakcie procesu amplifikacji. Sondy składają się z oligonukleotydów swoistych dla HCV i HCV QS, znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. W teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV sondy dla HCV i HCV QS są oznakowane różnymi fluorescencyjnymi barwnikami reporterowymi. Gdy sondy są nienaruszone, fluorescencja barwnika reporterowego jest tłumiona bliskością wygaszacza, na zasadzie efektu przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sonda ulega hybrydyzacji z sekwencją docelową, a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez termostabilną polimerazę DNA Z05 aktywności 5' 3' nukleazy. Od chwili uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza nie zachodzi dłużej zjawisko wygaszania i aktywność fluorescencyjna barwnika reporterowego nasila się. Amplifikację RNA HCV oraz RNA HCV QS mierzy się niezależnie od siebie, wykorzystując różne długości fal. Proces ten powtarza się przez określoną liczbę cykli, a w każdym cyklu następuje efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych barwników reporterowych, umożliwiając niezależną identyfikację RNA HCV oraz RNA HCV QS. Cykl PCR, w którym krzywa wzrostu rozpoczyna wzrost wykładniczy, zależny jest od ilości materiału startowego na początku reakcji PCR. Podstawy oceny ilościowej w teście COBAS TaqMan Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV zapewnia dokładność wyników ilościowych w bardzo szerokim przedziale dynamiki, ponieważ monitorowanie amplikonu przeprowadza się w trakcie fazy wykładniczej amplifikacji. Im wyższe jest miano HCV w badanej próbce, tym wcześniej fluorescencja barwnika reporterowego sondy HCV wzrasta powyżej wyjściowego poziomu fluorescencji (patrz rysunek 1). Ponieważ ilość RNA HCV QS jest stała we wszystkich próbkach, fluorescencja barwnika reporterowego sondy HCV QS powinna się pojawiać w każdej próbce w tym samym cyklu (patrz rysunek 2). W próbkach, w których fluorescencja QS jest nieprawidłowa, stężenie jest poddawane odpowiedniej modyfikacji. Pojawienie się swoistych sygnałów fluorescencyjnych jest rejestrowane jako krytyczna wartość progowa (Ct). Wartość Ct definiuje się jako liczbę cykli cząstkowych, po której fluorescencja barwnika reporterowego przekracza ustaloną wcześniej wartość progową (ustalony poziom fluorescencji) i zapoczątkowuje fazę wykładniczego wzrostu siły sygnału (patrz rysunek 3). Większa wartość Ct wskazuje na niższe miano początkowe docelowego RNA wirusa HCV. Dwukrotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem wartości Ct docelowego RNA HCV o 1, natomiast 10-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem Ct o 3,3. 05998212049-03PL 3 Doc Rev. 9.0

Rysunek 1 przedstawia krzywe wzrostu docelowego DNA dla serii rozcieńczeń, obejmującej przedział 5-krotnej wartości log 10. W miarę wzrostu stężenia wirusów krzywe wzrostu przesuwają się w kierunku wcześniejszych cykli. Zatem krzywa wzrostu leżąca najdalej na lewo odzwierciedla najwyższy poziom miana wirusa, a krzywa wzrostu leżąca najdalej na prawo oznacza najniższy poziom miana wirusa. Rysunek 1 Normalizowana fluorescencja Miano najwyższe Miano najniższe Liczba cykli Rysunek 2 przedstawia krzywe wzrostu Quantitation Standard dla próbek z serią rozcieńczeń wirusa, obejmującą przedział 5-krotnej wartości log 10. Ilość preparatu Quantitation Standard dodanego do każdej próbki jest stała dla każdej reakcji. Wartość Ct dla preparatu Quantitation Standard jest podobna niezależnie od miana wirusa. Rysunek 2 Normalizowana fluorescencja Miano najniższe Miano najwyższe Liczba cykli 05998212049-03PL 4 Doc Rev. 9.0

Rysunek 3 przedstawia na przykładzie, w jaki sposób wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla każdej krzywej wzrostu. Liczbę cykli cząstkowych (Ct) oblicza się w chwili, gdy sygnał fluorescencyjny przekracza ustalony poziom fluorescencji. Rysunek 3 Normalizowana fluorescencja Ustalony poziom fluorescencji Wartość Ct = 16,8 Liczba cykli Ilościowe oznaczenie RNA HCV Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV ilościowo oznacza stężenie RNA wirusa HCV, wykorzystując drugą sekwencję docelową (HCV Quantitation Standard), którą w znanym stężeniu dodaje się do każdej próbki testowej. Preparat HCV QS jest niezakaźnym konstruktem Armored RNA, zawierającym fragmenty sekwencji HCV z obszarami wiązania primerów, które są identyczne z obszarami wiązania na docelowej sekwencji HCV. Preparat HCV QS wytwarza produkt amplifikacji o tej samej długości łańcucha i składzie zasad co docelowy RNA wirusa HCV. Obszar wiązania sondy detekcyjnej w obrębie HCV QS został zmodyfikowany, aby umożliwić odróżnienie amplikonu HCV QS od amplikonu docelowego HCV. Podczas fazy hybrydyzacji reakcji PCR w analizatorze COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 próbki zostają oświetlone i wzbudzone światłem przefiltrowanym, a następnie rejestruje się wyniki emisji przefiltrowanej fluorescencji każdej próbki. Odczyty dotyczące poszczególnych próbek poddaje się korekcji w celu wyeliminowania zmienności wywołanej działaniem instrumentów. Aparat wprowadza odczyty fluorescencji do programu AMPLILINK i zapisuje w bazie danych. Stosuje się metodę odczytów wstępnych dla określenia, czy RNA HCV oraz RNA HCV QS reprezentują zestawy, które można uznać za ważne; w sytuacji gdy dane nie mieszczą się w ustalonych granicach, aparat opatruje je odpowiednimi oznaczeniami. Po ukończeniu i pomyślnej ocenie odczytów wstępnych odczyty fluorescencji są następnie przetwarzane w celu obliczenia wartości Ct dla RNA HCV i dla RNA HCV QS. Dołączona do testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV tablica stałych, swoistych dla danej serii wartości kalibracji jest wykorzystywana do obliczania wartości miana próbek i kontroli na podstawie wartości Ct RNA HCV oraz RNA HCV QS. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV jest wystandaryzowany według pierwszego międzynarodowego standardu WHO dla RNA wirusa zapalenia wątroby typu C do oznaczeń opartych na technologii amplifikacji kwasów nukleinowych [First WHO International Standard for Hepatitis C Virus RNA for Nucleic Acid Amplification Technology Assays (NIBSC kod 96/790)] 18, a wartości miana wyrażane są w jednostkach międzynarodowych (IU/ml). 05998212049-03PL 5 Doc Rev. 9.0

ODCZYNNIKI COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test HCMCAP (P/N: 03568547 190) HCV CS1 (Kaseta odczynników z cząsteczkami szkła magnetycznego do oznaczeń HCV) Cząsteczki szkła magnetycznego 93% izopropanol Xi 93% (w/w) izopropanol + 48 testów 1 x 48 testów Produkt drażniący F h93% (w/w) izopropanol Produkt wysoce łatwopalny HCV CS2 (Kaseta odczynników lizujących do oznaczeń HCV) Cytrynian sodu dwuwodny 42,5% tiocyjanian guanidyny < 14% polidokanol 0,9% ditiotreitol Xn 42,5% (w/w) tiocyjanian guanidyny + 1 x 48 testów Produkt szkodliwy HCV CS3 Kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń HCV, zawierająca: Pase (roztwór proteinazy) Bufor Tris < 0,05% EDTA Chlorek wapnia Octan wapnia 7,8% proteinaza Glicerol Xn 7,8% (w/w) proteinaza + 1 x 48 testów 1 x 3,8 ml Produkt szkodliwy EB (Bufor do elucji) Bufor Tris-base 0,2% metyloparaben HCV CS4 Kaseta odczynników swoistych dla testu do oznaczeń HCV, zawierająca: HCV QS (Standard oznaczania HCV Quantitation Standard) Bufor Tris EDTA < 0,002% Poly ra RNA (syntetyczny) < 0,001% konstrukt Armored RNA, zawierający sekwencje wiążące primer HCV oraz niepowtarzalny region wiązania sondy (niezakaźny RNA obecny w bakteriofagu MS2) 0,05% azydek sodu 1 x 7,0 ml 1 x 48 testów 1 x 3,6 ml 05998212049-03PL 6 Doc Rev. 9.0

HCV MMX (Odczynnik HCV Master Mix) Bufor Tricine Octan potasu Wodorotlenek potasu < 20% dimetylosulfotlenek Glicerol < 0,004% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,002% preparat primerów sensownych i antysensownych dla regionu 5' UTR wirusa HCV < 0,001% preparat znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi sond oligonukleotydowych, swoistych dla HCV oraz HCV Quantitation Standard < 0,001% aptamer oligonukleotydowy < 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna) < 0,1% enzym AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjny) 0,09% azydek sodu CAP/CTM Mn 2+ (Roztwór manganu CAP/CTM) < 0,5% octan manganu Kwas octowy lodowaty 0,09% azydek sodu HCV H(+)C (Próba kontrolna HCV silnie dodatnia) < 0,001% konstrukt Armored RNA HCV, zawierający sekwencje HCV (niezakaźny RNA obecny w bakteriofagu MS2) Ujemne osocze ludzkie, niereaktywne w testach na przeciwciała przeciwko HCV, przeciwciała przeciwko HIV-1/2, antygen HIV p24 oraz antygen HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV oraz DNA HBV niewykrywalnych przy użyciu metod PCR 0,1% Substancja konserwująca ProClin 300 Xi (3:1) mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu + 1 x 2,5 ml 1 x 19,8 ml 4 x 1,0 ml Produkt drażniący R36/38: Działa drażniąco na oczy i skórę. R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. HCV L(+)C (Próba kontrolna HCV słabo dodatnia) < 0,001% konstrukt Armored RNA HCV, zawierający sekwencje HCV (niezakaźny RNA obecny w bakteriofagu MS2) Ujemne osocze ludzkie, niereaktywne w testach na przeciwciała przeciwko HCV, przeciwciała przeciwko HIV-1/2, antygen HIV p24 oraz antygen HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV oraz DNA HBV niewykrywalnych przy użyciu metod PCR 0,1% Substancja konserwująca ProClin 300 Xi (3:1) mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu + 4 x 1,0 ml Produkt drażniący R36/38: Działa drażniąco na oczy i skórę. R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. 05998212049-03PL 7 Doc Rev. 9.0

CTM ( ) C [COBAS TaqMan ujemna próba kontrolna (osocze ludzkie)] Ujemne osocze ludzkie niereaktywne w testach na przeciwciała przeciwko HCV, przeciwciała przeciwko HIV-1/2, antygen HIV p24 oraz antygen HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV oraz DNA HBV niewykrywalne przy użyciu metod PCR 0,1% Substancja konserwująca ProClin 300 Xi (3:1) mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu + 4 x 1,0 ml Produkt drażniący R36/38: Działa drażniąco na oczy i skórę. R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. HCV H(+)C Clip (Klips z kodem kreskowym dla próby kontrolnej HCV silnie dodatniej) HCV L(+)C Clip (Klips z kodem kreskowym dla próby kontrolnej HCV słabo dodatniej) HCV ( ) C Clip (Klips z kodem kreskowym dla próby kontrolnej HCV ujemnej) 1 x 4 klipsy 1 x 4 klipsy 1 x 4 klipsy COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 03587797 190) PG WR (Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) Cytrynian sodu dwuwodny < 0,1% N-metyloizotiazolon-HCl PG WR 1 x 5,1 l OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. B. Test ten przeznaczony jest do stosowania z surowicą lub osoczem ludzkim pobranymi na antykoagulant EDTA. C. Nie pipetować za pomocą ust. D. Nie jeść, nie pić ani nie palić w laboratorium, w obszarach roboczych. Posługując się próbkami i odczynnikami z zestawów stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po posłużeniu próbkami i odczynnikami testowymi. E. Przy pobieraniu materiałów z fiolek kontroli unikać skażenia bakteryjnego odczynników lub ich rybonukleazą. F. Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet wolnych od RNazy. G. Nie mieszać kontroli pochodzących z różnych serii lub różnych fiolek tej samej serii. H. Nie mieszać ze sobą kaset odczynników lub kontroli pochodzących z różnych zestawów. I. Nie otwierać kaset COBAS AmpliPrep; nie wymieniać, nie mieszać, nie usuwać ani nie dodawać butelek do kasety. J. Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. K. Nie używać zestawu po upływie daty przydatności. L. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheets, MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym biurze firmy Roche. M. Z próbkami oraz kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne, przedstawione w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 19 oraz w CLSI Document M29-A3 20. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. UWAGA: Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu. N. PRZESTROGA: Odczynniki CTM ( ) C, HCV L(+)C oraz HCV H(+)C zawierają ludzkie osocze otrzymane z krwi ludzkiej. Materiał źródłowy został przebadany i uznany za niereaktywny pod względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg), przeciwciał przeciwko HIV-1/2 oraz HCV, a także antygenu HIV p24. Badanie ujemnego osocza ludzkiego (Negative Human Plasma) 05998212049-03PL 8 Doc Rev. 9.0

przy zastosowaniu metod PCR nie wykazało wykrywalnej obecności RNA wirusa HIV-1, RNA wirusa HCV lub DNA wirusa HBV. Nie ma znanych metod testowych mogących zapewnić całkowitą pewność, że produkty pochodzące krwi ludzkiej nie przenoszą czynników zakaźnych. Dlatego też każdy materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźny. Z odczynnikami CTM ( ) C, HCV L(+)C oraz HCV H(+)C należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, wymienione w wytycznych Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 19 oraz w dokumencie CLSI M29-A3 20. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. O. Odczynniki HCV QS, CAP/CTM Mn 2+ oraz HCV MMX zawierają azydek sodu. Azydek sodu może wchodzić w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. P. Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy, fartuchów laboratoryjnych oraz jednorazowych rękawic. Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą objętością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania powyższych odczynników, przed wytarciem plam należy rozcieńczyć je wodą. Q. Nie dopuszczać do kontaktu HCV CS2 i odpadów ciekłych z aparatu COBAS AmpliPrep, zawierających tiocyjanian guanidyny, z roztworem podchlorynu sodowego (wybielacz). Mieszaniny takie mogą spowodować powstanie silnie toksycznego gazu. R. Podczas utylizacji zestawów do przygotowywania próbek COBAS AmpliPrep Sample Processing Units (SPU), zawierających tiocyjanian guanidyny, unikać ich kontaktu z roztworem podchlorynu sodu (wybielacz). Mieszaniny takie mogą spowodować powstanie silnie toksycznego gazu. WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA A. Nie zamrażać odczynników ani kontroli. B. Odczynniki HCV CS1, HCV CS2, HCV CS3 oraz HCV CS4 przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nieużywane odczynniki zachowują stabilność do wskazanej daty ważności. Po otwarciu odczynniki zachowują stabilność przez 28 dni w temperaturze 2 8 C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. Odczynniki HCV CS1, HCV CS2, HCV CS3 i HCV CS4 mogą być stosowane przez maksymalnie 4 cykle urządzenia, łącznie przez okres 64 godzin pracy w aparacie COBAS AmpliPrep. Pomiędzy cyklami odczynniki należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. C. Odczynniki HCV H(+)C, HCV L(+)C oraz CTM ( ) C przechowywać w temperaturze 2 8 C. Kontrole te zachowują stabilność do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić. D. Klipsy z kodem paskowym [HCV H(+)C Clip, HCV L(+)C Clip i HCV ( ) C Clip] przechowywać w temperaturze 2 30 C. E. Odczynnik PG WR przechowywać w temperaturze 2 30 C. PG WR zachowuje stabilność do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu odczynnik zachowuje stabilność przez 28 dni w temperaturze 2 30 C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. DOSTARCZONE MATERIAŁY A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test HCMCAP (P/N: 03568547 190) HCV CS1 (kaseta odczynników z cząsteczkami szkła magnetycznego do oznaczeń HCV) HCV CS2 (kaseta odczynników lizujących do oznaczeń HCV) HCV CS3 (kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń HCV) HCV CS4 (kaseta odczynników swoistych dla testu do oznaczeń HCV) HCV H(+)C (próba kontrolna HCV silnie dodatnia) HCV L(+)C (próba kontrolna HCV słabo dodatnia) CTM ( ) C [COBAS TaqMan ujemna próba kontrolna (osocze ludzkie)] 05998212049-03PL 9 Doc Rev. 9.0

HCV H(+)C Clip (klips z kodem kreskowym dla próby kontrolnej HCV silnie dodatniej) HCV L(+)C Clip (klips z kodem kreskowym dla próby kontrolnej HCV słabo dodatniej) HCV ( ) C Clip (klips z kodem kreskowym dla próby kontrolnej HCV ujemnej) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 03587797 190) PG WR (Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) PG WR MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Przyrządy i oprogramowanie Aparat COBAS AmpliPrep Analizator COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 Opcjonalnie: Stacja dokująca Opcjonalnie: Aparat cobas p 630 Program AMPLILINK w wersji serii 3.2 lub serii 3.3 Stacja robocza z drukarką dla programu AMPLILINK Jeżeli w stacji danych z oprogramowaniem AMPLILINK zostało zainstalowane oprogramowanie AMPLILINK w wersji serii 3.2 lub 3.3, należy korzystać z następujących podręczników: Instrukcja obługi aparatu COBAS AmpliPrep, współpracującego z analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR lub aparatem cobas p 630 oraz oprogramowaniem AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3 Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan (z opcjonalną stacją dokującą) do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3 Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3 Instrukcja obsługi programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 oraz analizatorem COBAS AMPLICOR lub Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR i aparatem cobas p 630 Opcjonalnie: Podręcznik użytkownika aparatu cobas p 630, oprogramowanie w wersji 2.2 Materiały jednorazowe Zestawy do przygotowywania próbek: SPU Probówki wejściowe próbki (S-tubes) z klipsami z kodem kreskowym (P/N: 03137040001) Statywy z końcówkami K-tips (P/N: 03287343001) Pudło zawierające probówki K-tube 12 x 96 (P/N: 03137082001) INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZONE Statyw na próbki (statyw SK 24) (P/N: 28122172001) Statyw na odczynniki (P/N: 28122199001) Statyw na zestawy SPU (P/N: 28122806001) Urządzenie do mocowania korka w probówkach K-tube, z silnikiem (P/N: 03516539001) Urządzenie do mocowania korka w probówkach K-tube (P/N: 03339874001) Zasobnik K-carrier (P/N: 28150397001) Transporter do zasobników K-carrier (P/N: 03517519001) Statyw na zasobniki K-carrier (P/N: 03286436001) 05998212049-03PL 10 Doc Rev. 9.0

Pipetory z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnymi od RNazy (pojemność 1000 µl)* Rękawice jednorazowe bezpudrowe Mieszadło wibracyjne * Dokładność pipetorów musi wahać się w zakresie 3% podanej objętości. We wskazanych przypadkach używać należy pozbawionych RNazy końcówek do pipet z barierą dla aerozoli lub dodatnim wypieraniem w celu zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem. POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK UWAGA: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. A. Pobieranie próbek Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV jest przeznaczony do stosowania z próbkami surowicy lub osocza. Krew powinna być zbierana w probówkach do separacji surowicy SST lub w sterylnych probówkach z EDTA (lawendowa nakrętka) jako antykoagulantem. Krew pełną należy przechowywać w temperaturze 2 25 C nie dłużej niż 6 godzin. Oddzielić surowicę lub osocze od pełnej krwi w ciągu 6 godzin od pobrania, odwirowując (800 1600 x g przez 20 minut) w temperaturze pokojowej. Przenieść surowicę lub osocze do jałowej probówki polipropylenowej. Rysunki 4 i 5 przedstawiają dane dotyczące stabilności próbki uzyskane w badaniach dotyczących pobierania próbek. Badania przeprowadzono przy użyciu testu COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, wersja 2.0 (v2.0). Rysunek 4 Stabilność HCV w krwi pełnej (surowica) Średni wynik RNA HCV Log RNA HCV (UI/ml) 10 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 Numer próbki < 1 godzina 2-8 C 6 godziny 2-8 C 24 godziny 2-8 C 48 godziny 2-8 C 72 godziny 2-8 C < 1 godzina 20-25 C 6 godziny 20-25 C 24 godziny 20-25 C 48 godziny 20-25 C 72 godziny 20-25 C Rysunek 5 Stabilność HCV w krwi pełnej (osocze z dodatkiem EDTA) Średni wynik RNA HCV Log RNA HCV (UI/ml) 10 7 6 5 4 3 2 1 0 11 12 13 14 15 Numer próbki < 1 godzina 2-8 C 6 godziny 2-8 C 24 godziny 2-8 C 48 godziny 2-8 C 72 godziny 2-8 C < 1 godzina 20-25 C 6 godziny 20-25 C 24 godziny 20-25 C 48 godziny 20-25 C 72 godziny 20-25 C 05998212049-03PL 11 Doc Rev. 9.0

B. Transport próbek Transport krwi pełnej, surowicy lub osocza musi przebiegać zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, państwowymi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych 21. Krew pełną należy transportować w temperaturze 2 25 C i odwirować w ciągu 6 godzin od pobrania. Osocze lub surowica mogą być transportowane w temperaturze 2 8 C lub zamrożone w temperaturze 70 C lub niższej. C. Przechowywanie próbek Surowica i osocze mogą być przechowywane w temperaturze 2 8 C do 3 dni lub zamrożone do temperatury 70 C lub niższej. Zaleca się przechowywać próbki w porcjach 1100 1200 µl w 2,0 ml sterylnych polipropylenowych zakręcanych probówkach (np. Sarstedt 72.694.006). Rysunki 6 i 7 przedstawiają dane na temat stabilności próbki, uzyskane w badaniach dotyczących przechowywania próbek. Badania przeprowadzono przy użyciu testu COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, v2.0. Rysunek 6 Stabilność HCV w surowicy Średni wynik RNA HCV Log RNA HCV (UI/ml) 10 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 Numer próbki < 1 godzina 2-8 C 72 godziny 2-8 C 120 godziny 2-8 C 168 godziny 2-8 C 240 godziny 2-8 C < 1 godzina 20-25 C 72 godziny 20-25 C 120 godziny 20-25 C 168 godziny 20-25 C 240 godziny 20-25 C Rysunek 7 Stabilność HCV w osoczu z dodatkiem EDTA Średni wynik RNA HCV Log RNA HCV (UI/ml) 10 7 6 5 4 3 2 1 0 11 12 13 14 15 Numer próbki < 1 godzina 2-8 C 72 godziny 2-8 C 120 godziny 2-8 C 168 godziny 2-8 C 240 godziny 2-8 C < 1 godzina 20-25 C 72 godziny 20-25 C 120 godziny 20-25 C 168 godziny 20-25 C 240 godziny 20-25 C Próbki surowicy i osocza można zamrażać i rozmrażać do 2 razy bez utraty RNA HCV. Tabela 1 przedstawia dane pochodzące z badań dotyczących zamrażania i rozmrażania, przeprowadzonych z użyciem testu COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, v2.0. 05998212049-03PL 12 Doc Rev. 9.0

Tabela 1 Log 10 różnic w stężeniu HCV w surowicy i osoczu z dodatkiem EDTA pomiędzy stężeniem w cyklu 0 a stężeniem po 5-krotnym zamrożeniu i rozmrożeniu Macierz Stabilność Cykle zamrażania/rozmrażania Próbka Nr Cykl 0 Cykl 1 Cykl 2 Cykl 3 Cykl 4 Cykl 5 Surowica 1 0,000-0,052 0,238 0,179-0,670-0,277 2 0,000 0,293 0,228-0,206-0,338 0,175 3 0,000-0,270-0,023-0,430 0,008-0,229 4 0,000 0,071-0,516-0,295-0,564-0,670 5 0,000 0,342-0,031-0,344-0,436-0,277 Średnia dla surowicy 0,000 0,077-0,021-0,239-0,400-0,246 Osocze 1 0,000-0,006 0,043-0,143-0,159-0,140 z EDTA 2 0,000-0,329-0,375-0,234-0,642-0,265 3 0,000-0,056-0,248-0,371-0,395-0,142 4 0,000 0,186-0,066-0,034-0,241-0,084 5 0,000-0,120-0,111-0,055 0,250-0,217 Średnia dla osocza z EDTA 0,000-0,065-0,151-0,167-0,237-0,170 INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA UWAGA: Bardziej szczegółowe informacje dotyczące obsługi, szczegółowy opis możliwych konfiguracji, drukowania wyników i interpretacji sygnałów, komentarzy oraz komunikatów błędów można znaleźć w (1) Instrukcji obsługi aparatu COBAS AmpliPrep współpracującego z analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR lub aparatem cobas p 630 oraz oprogramowaniem AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3; (2) Instrukcji obsługi analizatora COBAS TaqMan (z opcjonalną stacją dokującą) do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3; (3) Instrukcji obsłgi analizatora COBAS TaqMan 48 do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3; (4) Instrukcji obsługi programu AMPLILINKw wersji serii 3.2 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 i analizatorem COBAS AMPLICOR lub Podręczniku programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48, analizatorem COBAS AMPLICOR oraz aparatem cobas p 630; (5) Opcjonalnie: Podręcznik użytkownika aparatu cobas p 630, oprogramowanie w wersji 2.2. Wielkość serii: Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające do 48 testów, które można przeprowadzać w seriach po 12 do 24 testów. Każda seria musi obejmować co najmniej jedną kontrolę [CTM ( ) C, HCV L(+)C oraz HCV H(+)C] (patrz rozdział Kontrola jakości ). Przebieg pracy: Przebieg testowy analizatora COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 należy rozpocząć w ciągu 120 minut od zakończenia przygotowywania próbki i kontroli. UWAGA: Próbek i kontroli po obróbce NIE ZAMRAŻAĆ ani NIE PRZECHOWYWAĆ w temperaturze 2 8 C. 05998212049-03PL 13 Doc Rev. 9.0

Przygotowanie próbki i kontroli UWAGA: W przypadku stosowania próbek zamrożonych należy je pozostawić w temperaturze pokojowej do całkowitego rozmrożenia i przed użyciem wymieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3 5 sekund. Kontrole przed użyciem należy wyciągnąć z miejsca przechowywania o temperaturze 2 8 C i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej. Ustawianie aparatu COBAS AmpliPrep Część A. Konserwacja i zalewanie A1. Aparat COBAS AmpliPrep w trybie oczekiwania jest gotowy do pracy. A2. Włącz stację roboczą programu AMPLILINK przyciskiem ON. Przygotuj stację roboczą do pracy w następujący sposób: a. Zaloguj się do systemu Windows XP. b. Dwukrotnie kliknij ikonę programu AMPLILINK. c. Zaloguj się do programu AMPLILINK, wprowadzając przydzielony identyfikator użytkownika i hasło. A3. Skontroluj zapas odczynnika PG WR na ekranie Status i w razie potrzeby wymień go. A4. Wykonaj wszystkie czynności konserwacyjne wyszczególnione w zakładce Due. Aparat COBAS AmpliPrep automatycznie zaleje system. Część B. Ładowanie kaset odczynników UWAGA: Wszystkie kasety odczynników należy wyjąć z miejsca przechowywania o temperaturze 2 8 C, natychmiast załadować do aparatu COBAS AmpliPrep i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej wewnątrz aparatu na co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem przygotowywania pierwszej próbki. Nie dopuszczać do ogrzania kaset odczynników do temperatury pokojowej poza aparatem ze względu na możliwość skraplania pary na etykietach z kodem kreskowym. W przypadku pojawienia się skroplonej pary nie ścierać jej z etykiet z kodem kreskowym. B1. Umieść kasetę HCV CS1 w statywie na odczynniki. Umieść kasety HCV CS2, HCV CS3 oraz HCV CS4 na osobnych statywach na odczynniki. B2. Załaduj statyw z odczynnikami zawierający HCV CS1 na pozycję A w aparacie COBAS AmpliPrep. B3. Załaduj statyw z odczynnikami zawierający HCV CS2, HCV CS3 oraz HCV CS4 na pozycje B, C, D lub E w aparacie COBAS AmpliPrep (dodatkowe informacje przedstawiono w tabeli 2). Część C. Ładowanie materiałów jednorazowego użytku UWAGA: Określ liczbę potrzebnych kaset odczynników COBAS AmpliPrep, zestawów Sample Processing Units (SPU), probówek wejściowych próbki (S-tubes), końcówek K-tips oraz probówek K-tubes. Każda próbka lub kontrola wymaga użycia jednego zestawu SPU, jednej probówki wejściowej S-tube, jednej końcówki K-tip i jednej probówki K-tube. Aparat COBAS AmpliPrep, współpracujący z analizatorem COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48, charakteryzuje się możliwością wielu konfiguracji. Szczegółowe informacje patrz tabela 2, poniżej. W zależności od wybranej konfiguracji załaduj odpowiednią liczbę statywów z kasetami odczynników, statywów próbek z probówkami wejściowymi S-tubes, statywów z zestawami SPU, końcówek K-tips, statywów probówek K-tube oraz zasobników K-carrier w statywach na odpowiednie pozycje w aparacie COBAS AmpliPrep (dodatkowe informacje przedstawiono w tabeli 2). C1. Umieść zestawy SPU na statywie(-ach) SPU i załaduj statyw(y) na pozycje J, K lub L w aparacie COBAS AmpliPrep. C2. W zależności od wybranej konfiguracji załaduj pełny(-ne) statyw(y) probówek K-tube na pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS AmpliPrep. C3. Załaduj pełny(-ne) statyw(y) końcówek K-tip na pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS AmpliPrep. C4. Dla konfiguracji 3 do 5 w analizatorze COBAS TaqMan 48 zasobniki K-carrier na statywie(-ach) załaduj na pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS AmpliPrep. 05998212049-03PL 14 Doc Rev. 9.0

Tabela 2 Możliwe konfiguracje dla aparatu COBAS AmpliPrep w zestawie z analizatorem COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 Konfiguracja Sposób przeniesienia do analizatora COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 Stojaki, zasobniki i materiały jednorazowego użytku Pozycja w aparacie COBAS AmpliPrep 1. Aparat COBAS AmpliPrep plus stacja dokująca plus analizator COBAS TaqMan Automatyczne przenoszenie zasobnika K-carrier Probówki K-tube w pełnych statywach na probówki Końcówki K-tip w pełnych statywach na końcówki Probówki wejściowe S-tube zawierające próbki i kontrole w statywach na próbki Zestawy SPU w statywach na zestawy SPU Kaseta CS1 w statywie na kasety Kasety CS2, CS3, CS4 w statywie na kasety M-P M-P F-H J-L A B-E 2. Aparat COBAS AmpliPrep plus analizator COBAS TaqMan Ręczne przenoszenie probówek K-tube w statywie(-ach) na próbki do analizatora COBAS TaqMan Probówki K-tube w pełnych statywach na probówki Końcówki K-tip w pełnych statywach na końcówki Probówki wejściowe S-tube w statywach na próbki Zestawy SPU w statywach na zestawy SPU Kaseta CS1 w statywie na kasety Kasety CS2, CS3, CS4 w statywie na kasety Po zakończeniu przygotowywania próbki: Probówki K-tube w statywach na próbki (gotowe do transferu ręcznego) M-P M-P F-H J-L A B-E Jak powyżej (F-H) 3. i 4. Aparat COBAS AmpliPrep plus 1-2 analizator(y) COBAS TaqMan 48 Ręczne przenoszenie zasobnika K- carrier za pomocą statywu(-ów) zasobników do analizatora COBAS TaqMan 48 Probówki K-tube w statywach na próbki Końcówki K-tip w pełnych statywach na końcówki Probówki wejściowe S-tube w statywach na próbki Zestawy SPU w statywach na zestawy SPU Kaseta CS1 w statywie na kasety Kasety CS2, CS3, CS4 w statywie na kasety Pusty zasobnik K-carrier oznaczony kodem paskowym w statywie na zasobniki Po zakończeniu przygotowywania próbki: Probówki K-tube w zasobniku K-carrier na statywie zasobników F-H M-P F-H J-L A B-E M-P Jak powyżej (M-P) 5. Aparat COBAS AmpliPrep plus analizator COBAS TaqMan plus analizator COBAS TaqMan 48 Ręczne przenoszenie probówek K-tube w statywie na próbki do analizatora COBAS TaqMan. Ręczne przenoszenie transfer zasobnika K-carrier za pomocą statywu zasobników do analizatora COBAS TaqMan 48 Takie same jak konfiguracje 2 i 3 Takie same jak konfiguracje 2 i 3 05998212049-03PL 15 Doc Rev. 9.0

Część D. Przygotowywanie zleceń i ładowanie próbek D1. Przygotuj statywy na próbki w następujący sposób: Do każdej pozycji statywu próbek, gdzie zostanie umieszczony materiał próbki (probówka S-tube), przymocuj klips opatrzony etykietą z kodem kreskowym. Do każdej pozycji statywu próbek, gdzie zostanie umieszczony materiał kontroli (probówka S-tube), przymocuj odpowiedni klips opatrzony etykietą z kodem kreskowym dla danej kontroli [CTM ( ) C, HCV L(+)C i HCV H(+)C]. Klipsy z kodami kreskowymi dla kontroli powinny mieć takie same numery serii jak numery serii fiolek kontroli w zestawie. Zwróć uwagę, aby odpowiednie kontrole umieścić na pozycjach z odpowiednim klipsem z kodem kreskowym kontroli. Na każdej pozycji oznaczonej klipsem z kodem kreskowym umieść jedną probówkę wejściową S-tube. D2. Przygotuj zlecenia dla poszczególnych próbek i kontroli za pomocą programu AMPLILINK w oknie Orders w katalogu Sample. Wybierz odpowiedni plik testu i zakończ procedurę zapisem. D3. W oknie Orders w katalogu Sample Rack przypisz zlecenia dla próbek i kontroli do pozycji statywów próbek. Należy wprowadzić numer statywu próbek dla statywu przygotowanego w punkcie D1. D4. Wydrukuj raport Sample Rack Order do użytku jako arkusz roboczy. D5. Przygotuj statywy próbek i kontroli w miejscu pracy wyznaczonym do dodawania próbek i kontroli w następujący sposób: Umieść każdą próbkę i kontrolę [CTM ( ) C, HCV L(+)C oraz HCV H(+)C] na mieszadle wibracyjnym na 3 5 sekund. Unikaj zanieczyszczenia rękawic przy posługiwaniu się próbkami i kontrolami. D6. Przenieś 1000 do 1050 µl każdej próbki i kontroli [CTM ( ) C, HCV L(+)C oraz HCV H(+)C] do odpowiedniej, oznaczonej kodem kreskowym probówki wejściowej S-tube za pomocą mikropipetora z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnymi od RNazy. Unikaj przenoszenia cząstek stałych i/lub skrzeplin fibrynowych z oryginalnej próbki do probówki wejściowej S-tube. Próbki i kontrole należy przenieść na pozycje probówek zgodnie z przygotowanym i zapisanym w punkcie D4 arkuszem pracy. Klipsy z kodami kreskowymi dla kontroli powinny mieć takie same numery serii jak numery serii fiolek kontroli w zestawie. Przypisz odpowiednie kontrole do właściwych pozycji z odpowiednim klipsem z kodem kreskowym kontroli. Unikaj zanieczyszczenia górnej części probówek S-tube materiałem próbki lub kontrole. D7. W przypadku używania aparatu cobas p 630 do przygotowywania próbek należy odnieść się do Podręcznika użytkownika aparatu cobas p 630. D8. W przypadku konfiguracji 1 i 2 statyw(y) próbek, wypełnione probówkami wejściowymi S-tube, umieść na pozycjach F, G lub H w aparacie COBAS AmpliPrep. D9. Dla konfiguracji 3 do 5 dla analizatora COBAS TaqMan 48 statyw(y) próbek wypełnione probówkami wejściowymi S-tube i probówkami K-tube (po jednej dla każdej z probówek wejściowych S, umieszczonej w prawym położeniu i sąsiadującej z probówką wejściową) umieść na pozycjach F, G lub H w aparacie COBAS AmpliPrep. Część E. Rozpoczęcie przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep E1. Uruchom aparat COBAS AmpliPrep za pomoca oprogramowania AMPLILINK. Część F. Zakończenie przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep i transfer do analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 (dotyczy wyłącznie konfiguracji 2-5) F1. Sprawdź obecność oznaczeń lub komunikatów błędu. F2. Usuń próbki i kontrole po obróbce z aparatu COBAS AmpliPrep w zależności od wybranej konfiguracji na statywach próbek (w przypadku analizatora COBAS TaqMan bez stacji dokującej) lub statywach zasobników K-carrier (w przypadku analizatora COBAS TaqMan 48) (szczegółowe informacje przedstawiono w części G). F3. Usuń odpady z aparatu COBAS AmpliPrep. UWAGA: Przygotowanych próbek i kontroli nie należy wystawiać na działanie światła. 05998212049-03PL 16 Doc Rev. 9.0

Amplifikacja i detekcja Przygotowanie analizatora COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 Przebieg testowy analizatora COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 należy rozpocząć w ciągu 120 minut od zakończenia przygotowywania próbki i kontroli. UWAGA: Próbek i kontroli po obróbce NIE ZAMRAŻAĆ ani NIE PRZECHOWYWAĆ w temperaturze 2 8 C. Część G. Ładowanie przygotowanych próbek G1. Zależnie od wybranej konfiguracji aparatu, wykonaj odpowiednie czynności w celu przeniesienia probówek K-tube do analizatora COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48: Konfiguracja 1: Konfiguracja 2 i 5: Automatyczne przenoszenie zasobnika K-carrier przez stację dokującą do analizatora COBAS TaqMan. Interwencja ręczna nie jest wymagana. Ręczne przenoszenie probówek K-tube w statywie(-ach) na próbki do analizatora COBAS TaqMan. Konfiguracja 3, 4 i 5: Ręczne przenoszenie zasobnika K-carrier na statywie(-ach) zasobników K-carrier do analizatora COBAS TaqMan 48. Ręczny transfer zasobników K-carrier do analizatora COBAS TaqMan 48 przy użyciu transportera K-carrier. Część H. Rozpoczęcie pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 H1. Uruchom analizator COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 przy użyciu jednej z poniższych opcji, zależnie od wybranej konfiguracji: Konfiguracja 1: Nie jest wymagana żadna interwencja. Konfiguracja 2 i 5: Automatyczny start pracy analizatora COBAS TaqMan po załadowaniu statywu(-wów) próbek. Konfiguracja 3, 4 i 5: Jeśli w zasobniku K-carrier jest mniej niż 6 probówek K-tube, wypełnij zasobnik pustymi probówkami K-tube. Wypełnianiem steruje oprogramowanie AMPLILINK. Otwórz pokrywę termocyklera, załaduj zasobnik K-carrier i zamknij pokrywę. Rozpocznij cykl pracy analizatora COBAS TaqMan 48. Część I. Zakończenie pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 I1. Po zakończeniu cyklu pracy analizatora COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 wydrukuj raport wyników. Sprawdź obecność znaczników lub komunikatów błędu na raporcie wyników. Próbki posiadające oznaczenia (flagi) i komentarze należy interpretować zgodnie z opisem w części Wyniki. Po zatwierdzeniu zapisz dane w archiwum. I2. Usuń zużyte probówki K-tube z analizatora COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48. WYNIKI Analizatory COBAS TaqMan i COBAS TaqMan 48 oznaczają stężenie RNA HCV w próbkach i kontrolach w sposób automatyczny. Stężenie RNA HCV jest wyrażane w jednostkach międzynarodowych IU (International Units)/ml. Oprogramowanie AMPLILINK: Określa wartość progową liczby cykli (Ct) dla RNA HCV oraz RNA HCV QS. Określa stężenie RNA HCV na podstawie wartości Ct dla RNA HCV i RNA HCV QS oraz swoistych dla danej serii współczynników kalibracji, zapisanych w kodach kreskowych kasety. Określa, czy obliczone liczby IU/ml dla kontroli HCV L(+)C i HCV H(+)C mieszczą się w przypisanych im przedziałach. Ocena ważności serii testowej program AMPLILINK w wersji serii 3.2 Sprawdź okno wyników programu AMPLILINK lub wydruk w poszukiwaniu oznaczeń i komentarzy, aby upewnić się, że dana seria testowa jest ważna. W przypadku zleceń dla próbek kontroli przeprowadzana jest kontrola w celu określenia, czy wartość IU/ml mieści się w określonym przedziale. Jeśli wartość IU/ml dla próbki kontroli nie mieści się w odpowiednim przedziale, generowany jest ZNACZNIK sygnalizujący błąd dla kontroli. Seria testowa jest uważana za ważną, jeśli żadna z kontroli [HCV L(+)C, HCV H(+)C i CTM ( ) C] nie została opatrzona znacznikiem błędu. Seria testowa jest nieważna, jeżeli kontrole dla testu HCV zostały opatrzone którymkolwiek z poniższych oznaczeń: 05998212049-03PL 17 Doc Rev. 9.0