ALEKSANDRA KOTKOWSKA, EWA WAWRZYNIAK, JERZY Z. BŁOŃSKI, TADEUSZ ROBAK, ANNA KORYCKA-WOŁOWIEC

PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2010, 41, Nr 1, str. 45 55 ALEKSANDRA KOTKOWSKA, EWA WAWRZYNIAK, JERZY Z. BŁOŃSKI, TADEUSZ ROBAK, ANNA KORYCKA-WOŁOWIEC Ocena przydatności cytogenetyki klasycznej z uŝyciem oligonukleotydu CpG (DSP30) do wykrywania aberracji chromosomowych o znaczeniu prognostycznym u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową wyniki wstępne Evaluation of the application of conventional cytogenetic using oligonucleotide CpG (DSP30) for detection of prognostic value chromosomal abnormalities in patients with chronic lymphocytic leukemia preliminary results Katedra i Klinika Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi oraz Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im M. Kopernika w Łodzi Kierownik Katedry i Kliniki: Prof. dr hab. n. med. Tadeusz Robak STRESZCZENIE Wykrywanie aberracji chromosomowych u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową (PBL) metodą cytogenetyki klasycznej (CC) jest często utrudnione lub nawet niemoŝliwe z powodu uzyskiwania zbyt małej liczby metafaz przydatnych do analizy. Metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) jest techniką czulszą, lecz pozwala jedynie na ujawnienie aberracji w regionach komplementarnych do zastosowanych sond, co nie daje pełnego wglądu w anomalie obecne w badanym kariotypie. Celem naszej pracy było porównanie skuteczności metody CC z uŝyciem oligonukleotydu DSP30 (CC-DSP30) z metodą FISH w wykrywaniu aberracji chromosomowych o znaczeniu prognostycznym w PBL, jak równieŝ odpowiedź na pytanie czy metoda CC-DSP30 pozwala na ujawnienie dodatkowych zaburzeń cytogenetycznych występujących w tej chorobie. Badania wykonano w grupie 45 wcześniej nie leczonych chorych na PBL. Stosując metodę CC-DSP30 metafazy do analizy uzyskano w 41/45 (91%) przypadkach, spośród których aberracje chromosomowe wykryto u 30/41 chorych (73%). Techniką FISH ujawniono aberracje u 39/45 chorych (87%). Del(11q) wykryto u 9 (20%) chorych zarówno metodą FISH, jak i CC-DSP30. Trisomię 12 wykryto metodą CC- DSP30 u 5 (12%) chorych, a del(13q) u 9 (22%) chorych, podczas gdy FISH ujawniła te anomalie odpowiednio w 7 (15%) i 32 (71%) przypadkach. Del(17p) ujawniono obydwiema metodami u jednego chorego, w jednym przypadku wykryto ją tylko metodą FISH i w jednym tylko metodą CC-DSP30. Ponadto, w kariotypie 3/9 (33%) chorych z del(11q) ujawnioną w badaniu FISH, metoda CC-DSP30 pozwoliła na wykrycie dodatkowych aberracji mających charakter translokacji. U 21/32 (66%) chorych, u których del(13)(q14) stwierdzona metodą FISH miała charakter zmiany izolowanej, w badaniu CC-DSP30 wykazano obecność dodatkowych aberracji. Podsumowując, zarówno metoda FISH, jak i CC-DSP30 wykazują podobną skuteczność w wykrywaniu del(11q) i trisomii 12 (p<0,0001). CC- DSP30 umoŝliwia ponadto wykrycie dodatkowych aberracji chromosomowych, nie wykrywanych metodą FISH z uŝyciem standardowego dla PBL panelu sond. SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka limfocytowa FISH Oligonukleotyd CpG DSP30 Aberracje chromosomowe SUMMARY Detection of chromosomal abnormalities by conventional cytogenetic (CC) method in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients is often difficult or even unfeasible, due to a too low number of metaphases applicable for analysis. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a more sensitive method, however it is suitable only for analysis of chromosomal regions with known specific DNA probes. The aim of our study was to compare the effectiveness of CC with DSP30 oligonucleotide stimulation (CC-DSP30) with FISH for detection of chromosomal aberrations of prognostic value and to answer the question if the former method allows the detection of other unknown chromosomal ab-

46 A. KOTKOWSKA i wsp. normalities. Both methods were tested in 45 previously untreated CLL patients. Using the CC method with DSP30, the metaphases for analysis were obtained in 41/45 (91%) cases, and chromosomal aberrations were detected in 30/41 (73%) patients. The FISH technique revealed aberrations in 39/45 (87%) patients. Del(11q) was detected in 9 (20%) patients using both CC-DSP30 and FISH methods. CC-DSP30 allowed to detect trisomy 12 in 5 (12%) and del(13q) in 9 (22%) patients, whereas by FISH those aberrations were detected in 7 (15%) and in 32 (71%) cases, respectively. Additionally, in the karyotype of 3/9 (33%) patients with del (11q) detected by FISH, CC-DSP30 allowed to detect other aberrations of translocation character. In 21/32 (66%) cases with isolated del(13)(q14) detected by FISH, the CC-DSP30 method showed some other additional aberrations. In conclusion, both methods FISH and CC-DSP30 have similar effectiveness in del(11q) and trisomy 12 detection (p<0,0001). However, CC-DSP30 allows detection of additional chromosomal aberration, undetected by FISH with standard panel of probes. KEY WORDS: Chronic lymphocytic leukemia FISH CpG-oligonucleotide DSP30 Chromosomal abnormalities WSTĘP Przewlekła białaczka limfocytowa (PBL) jest chorobą nowotworową układu krwiotwórczego, w której w wyniku zahamowania apoptozy, dochodzi do niekontrolowanej, klonalnej proliferacji limfocytów. Prowadzi to do ich akumulacji we krwi obwodowej, szpiku kostnym, węzłach chłonnych, śledzionie, wątrobie, a w zaawansowanych stadiach choroby takŝe w innych narządach wewnętrznych [1]. Najczęściej rozpoznawana jest postać B-komórkowa PBL, w której na powierzchni limfocytów stwierdza się ekspresję antygenów charakterystycznych dla linii B-komórkowej, takich jak CD19, CD20, CD21, CD23, ze współistniejącą koekspresją antygenu CD5, obecnego na prawidłowych limfocytach T. Klasyfikacje PBL zaproponowane przez Rai i wsp. [2] oraz Bineta i wsp. [3] oraz schemat postępowania diagnostycznego i leczniczego oparty na standardach przedstawionych przez National Cancer Institute Sponsored Working Group [4] w 1996 r. i uaktualniony w roku 2008 [5] stanowią podstawę podziału chorych na grupy róŝniące się stopniem klinicznego zaawansowania choroby, a takŝe rokowaniem. Choroba charakteryzuje się bowiem róŝnorodnym przebiegiem klinicznym, a rokowanie i sposób zastosowanego leczenia są zaleŝne od czynników prognostycznych określonych w chwili rozpoznania. Rozwój biologii molekularnej i cytogenetyki w ostatnich kilkunastu latach przyczynił się do istotnego postępu w zrozumieniu biologii PBL. Pozwolił równieŝ na wyodrębnienie szeregu czynników o istotnym znaczeniu prognostycznym. Oprócz uznanych od dawna czynników rokowniczych takich jak: aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH) i stęŝenie β 2 -mikroglobuliny, ustalono szereg nowych niezaleŝnych czynników prognostycznych. Wśród nich istotne miejsce zajmuje stęŝenie rozpuszczalnego antygenu CD23 (scd23), aktywność kinazy tymidynowej, ekspresja kinazy ZAP-70, antygenu błonowego CD38 oraz stan zmutowania genów dla części zmiennej łańcucha cięŝkiego immunoglobulin (IgV H ) [2, 6 8]. Dzięki wprowadzeniu metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) duŝą rolę przypisuje się równieŝ aberracjom cytogenetycznym [9, 10]. Zidentyfikowano cztery najczęściej wykrywane w PBL aberracje chromosomowe. NaleŜą do nich delecja fragmentu długiego ramienia chromosomu 13 [del(13)(q14)], trisomia chromosomu 12 (+12), delecja fragmentu długiego ramienia chromosomu 11 [del(11)(q22)] oraz delecja fragmentu krótkiego ramienia chromosomu 17 [del(17)(p13)]. Del(13q) jest wykrywana u ponad połowy chorych i jeśli nie jest skojarzona z innymi aberracjami, jest związana z najkorzystniejszym rokowaniem co do czasu przeŝycia. Del(17p) jest natomiast wykrywana rzadko, ale z powodu utraty genu supresorowego TP53 obarczona jest najgorszym rokowaniem, co pozwala na zakwalifikowanie chorych do grupy wysokiego ryzyka [5, 6, 9, 11]. Technika FISH umoŝliwia skuteczną ocenę aberracji w komórkach nie dzielących się, dzięki czemu moŝliwe jest wykrycie anomalii u ponad 80% chorych na PBL [9, 10, 12]. FISH interfazowy pozwala ponadto na uniknięcie stosowania mało skutecznych mitogenów. Wadą tej metody jest jednak wysoki koszt sond molekularnych oraz fakt, iŝ umoŝliwia ona identyfikację aberracji jedynie w regionach komplementarnych do zastosowanych sond, co nie daje pełnego wglądu w anomalie obecne w kariotypie [13, 14].

Ocena przydatności cytogenetyki klasycznej 47 Przed upowszechnieniem techniki FISH, u chorych na PBL przez wiele lat wykrywano aberracje chromosomowe metodą cytogenetyki klasycznej (conventional cytogenetic; CC). Metoda ta w odniesieniu do PBL jest jednak związana z licznymi ograniczeniami, spowodowanymi głównie niskim indeksem mitotycznym komórek białaczkowych, uzyskiwanym w warunkach hodowli in vitro. Wynika to z małej aktywności proliferacyjnej limfocytów białaczkowych, jak równieŝ ze słabej odpowiedzi na powszechnie stosowane mitogeny. Do stymulatorów limfocytów B standardowo wykorzystywanych w CC zalicza się mitogen szkarłatki (pokeweed mitogen, PWM) oraz estry forbolu (12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate, TPA) [15 17]. W ostatnich latach zsyntetyzowano i wprowadzono do badań in vitro nowy mitogen będący oligonukleotydem CpG i nazwany DSP30. Indukuje on proliferację zarówno prawidłowych, jak i białaczkowych limfocytów B, stymuluje produkcję cytokin (m.in. IL-2 i TNF-α) oraz reguluje ekspresję powierzchniowych cząstek CD25 i CD86 na limfocytach B. Pobudza on równieŝ komórki układu immunologicznego takie jak limfocyty, komórki NK, komórki dendrytyczne oraz monocyty do proliferacji, wydzielania, i/lub róŝnicowania [18 21]. Zastosowanie DSP30 w warunkach hodowli in vitro pozwala na wykrycie aberracji chromosomowych u około 90% chorych [22, 23]. Stwarza to szansę na zwiększenie wydajności metody cytogenetyki klasycznej i na dokładniejszą ocenę kariotypu chorych na PBL. Budzi równieŝ nadzieję na wyodrębnienie w przyszłości nowych nie znanych dotąd aberracji cytogenetycznych, których znaczenie moŝe okazać się istotne w diagnostyce i leczeniu PBL. Niewiele jednak dotychczas wiadomo na temat skuteczności metody CC z uŝyciem oligo CpG w wykrywaniu aberracji chromosomowych o uznanej wartości prognostycznej. Celem naszych badań było porównanie skuteczności wykrywania aberracji chromosomowych o uznanym znaczeniu prognostycznym u chorych na PBL za pomocą metody CC z uŝyciem oligonukleotydu DSP30 (CC-DSP30) z referencyjną metodą FISH. Podjęliśmy takŝe próbę odpowiedzi na pytanie czy metoda ta pozwala na ujawnienie dodatkowych zaburzeń cytogenetycznych występujących w tej chorobie, a nie wykrywanych za pomocą sond standardowo stosowanych w PBL. MATERIAŁ I METODY Pacjenci Badaniami objęto 45 uprzednio nie leczonych chorych z rozpoznaniem PBL (15 kobiet i 30 męŝczyzn), w wieku 46 86 lat (średnia 67,7 ±10,3; mediana 70,0), którzy w latach 2007 2008 znajdowali się pod opieką Kliniki Hematologii UM w Łodzi. Rozpoznanie oparto na aktualnie obowiązujących kryteriach klinicznych i laboratoryjnych [5]. Stopień zaawansowania klinicznego choroby był zróŝnicowany i ustalony wg klasyfikacji Rai: stadium 0 stwierdzono u 8 chorych, stadia I, II, III, IV odpowiednio u 16, 7, 3 i 11 chorych. W badanej grupie średnia wartość leukocytozy wynosiła 80,8 10 9 /l (mediana 81,8 10 9 /l), średnia wartość hemoglobiny wynosiła 12,6g/dl (mediana 12,7g/dl), natomiast średnia wartość płytek krwi wynosiła 158,2 10 9 /l (mediana 156 10 9 /l). Charakterystykę chorych przedstawiono w Tabeli 1. Tabela 1. Charakterystyka chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową Table 1. Characteristics of chronic lymphocytic leukemia patients Płeć K M (n) (n) 45 15 30 67,7±10,3 (46 86) Liczba chorych (n) N liczba chorych WBC, Hb, PLT wartości średnie ± SD; w nawiasach zakres Wiek Rai (lata) 0 1 2 3 4 8 16 7 3 11 WBC ( 10 9 /l) 80,8±131,8 (24,1 307,2) Hb (g/dl) 12,2±2,4 (4,3 15,7) PLT ( 10 9 /l) 158,2±70,7 (26 294)

48 A. KOTKOWSKA i wsp. Materiał do badań był uzyskiwany podczas rutynowych badań diagnostycznych. W przypadku metody FISH stanowiły go rozmazy krwi obwodowej z nakłucia opuszki palca lub krew Ŝylna pobierana do heparynizowanych probówek (Sarstedt, Niemcy), natomiast w przypadku metody CC była to wyłącznie krew Ŝylna pobierana do heparynizowanych probówek. Badanie uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym w Łodzi, a wszyscy chorzy wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu. Cytogenetyka klasyczna z uŝyciem oligonukleotydu CpG (DSP 30) Badanie cytogenetyczne metodą CC wykonano u wszystkich chorych. W tym celu zakładano 72 godzinne hodowle in vitro komórek krwi obwodowej, które w stęŝeniu 10 7 komórek/ml hodowli zawieszano w podłoŝu X-VIVO 15 (Lonza, Belgia) z 20% dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej (Invitrogen, Szkocja). Do hodowli dodawano oligonukleotyd CpG (DSP30) (TIBMolBiol, Berlin, Niemcy) w stęŝeniu końcowym 2 µm/ml, jako stymulator limfocytów B. Na 24h przed zakończeniem hodowli dodawano kolcemid (Invitrogen, Szkocja) w stęŝeniu końcowym 0,15 µg/ml. Chromosomy metafazowe barwiono techniką prąŝków G (GTG). Kariotyp opracowywano zgodnie z zasadami International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) 2009 [24]. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) U wszystkich chorych wykonano badanie metodą FISH w jądrach interfazowych przy uŝyciu następujących sond molekularnych: LSI D13S319 (13q14.3)/LSI 13q34/CEP 12 Probe (VYSIS, Niemcy). LSI p53 (17p13.1)/LSI ATM (11q22.3) Probe (VYSIS, Niemcy). Rozmazy krwi obwodowej utrwalano 10 15 min. w mieszaninie metanolu i kwasu octowego w stosunku 3:1, a następnie postępowano zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta sond. KaŜdorazowo oceniano 200 jąder interfazowych. Wynik był uznawany za nieprawidłowy, jeśli odsetek jader wykazujących nieprawidłowy wzór hybrydyzacyjny przekraczał wartość punktu odcięcia wyznaczonego dla określonej sondy na podstawie badań przeprowadzonych w grupie kontrolnej. Wynosił on odpowiednio 8,4% dla delecji 13q14.3, 8,8% dla delecji 11q22.1, 9,6% dla delecji 17p13.1 i 5% dla trisomii 12. Analiza statystyczna Analizę statystyczną wykonano z uŝyciem dokładnego testu Fishera, przyjmując za statystycznie istotne p<0,05. Siłę zaleŝności między badanymi cechami jakościowymi oceniano na podstawie stopnia zgodności testów z wykorzystaniem współczynnika kappa (κ), przyjmując κ< 0,2 jako bardzo niski stopień zgodności, κ w zakresie 0,21 0,4 jako niski stopień zgodności, κ pomiędzy 0,41-0,6 jako średni stopień zgodności, κ w zakresie 0,61-0,8 jako wysoki i κ powyŝej 0,81 jako bardzo wysoki stopień zgodności testów [25]. WYNIKI Stosując metodę CC-DSP30 metafazy nadające się do analizy uzyskano w 41/45 (91%) przypadkach, spośród których aberracje chromosomowe wykryto u 30/41 chorych (73%). U czterech chorych, u których nie uzyskano wyniku badania metodą CC-DSP30, liczba metafaz była niewystarczająca do oceny. Techniką FISH ujawniono natomiast aberracje u 39/45 chorych (87%). Anomalie chromosomowe wykryto ogółem u 41/45 (91%) chorych na PBL. Metodą CC-DSP30 wykryto aberracje u 2/6 chorych z prawidłowym wynikiem FISH, natomiast u 7/11 chorych z prawidłowym kariotypem, badanie

Ocena przydatności cytogenetyki klasycznej 49 FISH ujawniło zmiany chromosomowe. Częstość wykrywania czterech aberracji chromosomowych o istotnym znaczeniu rokowniczym za pomocą obydwu metod przedstawiono w Tabeli 2. Tabela 2. Częstość występowania aberracji cytogenetycznych u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową w zaleŝności od zastosowanej metody Table 2. Frequency of cytogenetic aberrations in chronic lymphocytic leukemia patients according to the method used Aberracja del (13)(q14) del (11)(q22) del (17)(p13) FISH(+) ogółem n=45 32 (71%) 11 (24%) 2 (4,4%) Trisomia 7 12 (15,5%) Nb nie badano n liczba analizowanych chorych CC(+) ogółem n=41 9 (22%) 8 delecja 1 monosomia 9 (22%) 2 (4,8%) 1 delecja 1 monosomia 5 (12%) Zastosowana metoda FISH(+) CC(+) p analiza statystyczna κ współczynnik kappa FISH(+) CC( ) FISH( ) CC(+) FISH( ) CC( ) p κ Stopień zgodności testów 9 23 0 13 0,042 0,18 bardzo niski 9 2 0 34 0,0001 0,87 bardzo wysoki 1 1 1 43 0,09 Nb Nb 5 2 0 38 0,0001 0,81 bardzo wysoki Metodą CC-DSP30 wykryto delecję 13q tylko w 9 (22%) przypadkach, podczas gdy analiza FISH ujawniła tę anomalię aŝ u 32/45 (71%) badanych. U trzech chorych z delecją 13q stwierdzoną metodą FISH nie uzyskano metafaz do analizy metodą prąŝkową, natomiast u 20 chorych delecja ta nie była widoczna w analizie CC-DSP30. U 21/32 (66%) chorych delecja 13q14 stwierdzona metodą FISH miała charakter zmiany izolowanej, gdyŝ nie towarzyszyły jej del(11q), del(17p) i +12. Badanie wykonane Tabela 3. Kariotyp chorych z izolowaną del(13)(q14), wykrytą metoda FISH Table 3. Karyotype of patients with isolated del(13)(q14) obtained by FISH FISH (% jąder z delecją) CC 96% 46,XX,del(22)(q12)[30] 93% 45,XY,+1,-5,-10,-13,-22,+mar1,+mar2[11]/ 46,XY,-13,t(14;17)(q32;q12),-22, +mar1,+mar2[2]/46,xy[3] 69% 46,X,del(X)(q22)[1]/46,sl,t(5;11)(q?15;q23)[3]/46,XX[11] 70% 46,XY, der(18)t(2;18)(p11;p11.2)[8]/46,xy[10] 90% 46,XY,add(3)(p26)[7]/45,XY,add(4)(p16),-15[6]/46,XY[2] 16% 46,XX,t(2;14)(p11;q32)[15] 78% 46,XY,del(6)(q13)[6]/46,XY[16] 70% 46,XY,add(3)(p26)[5]/46,XY,add(8)(p23)[3]/46,XY[9] 58% 46,XY,ins(2;?)(q35;?),del(13)(q14)[4]/ 46,sl,del(6)(q15~21),t(10;10)(p13;q26)[3]/ 46,XY[12] 13% 46,XY,del(6)(q23)[6]/46,XY,del(17)(p11)[3]/46,XY[12]

50 A. KOTKOWSKA i wsp. 1A kariotyp uzyskany metodą CC-DSP30 2A FISH metafazowy 3A FISH interfazowy Ryc. 1. Wynik analizy cytogenetycznej chorego nr 1, z delecją 11q22 ujawnioną w metodzie FISH i CC-DSP30 oraz z dodatkową translokacją wykrytą metodą CC-DSP30 Fig. 1. Result of the cytogenetic analysis of patient No1 with detected by FISH and DSP30 deletion 11q22 as well as with additional translocation detected by

Ocena przydatności cytogenetyki klasycznej 51 metodą CC-DSP30 pozwoliło ponadto na ujawnienie nieprawidłowego kariotypu u 10/21 (48%) chorych z izolowaną delecją 13q. Analiza statystyczna uzyskanych wyników wykazała istnienie zaleŝności pomiędzy wykrywalnością delecji 13q14 metodą FISH i CC-DSP30, jednakŝe zaleŝność ta była na granicy znamienności statystycznej (p=0,042). Stopień zgodności wyników uzyskanych obiema metodami był bardzo niski (κ=0,18) (Tabela 2). Dodatkowe aberracje wykryte metodą CC-DSP-30 u chorych z izolowana del(13q) ujawnioną w badaniu FISH, przedstawiono w Tabeli 3. Delecję 11q wykryto zarówno metodą FISH jak i CC-DSP30 u 9 chorych. U dwóch chorych, u których nie uzyskano podziałów komórkowych, aberrację tę wykryto tylko metodą FISH. W kariotypie 3/9 (33%) chorych z delecją 11q obecną w badaniu FISH, badanie wykonane metodą CC-DSP30 pozwoliło ponadto na ujawnienie dodatkowych aberracji mających charakter translokacji. Wykazano istotną zaleŝność pomiędzy wykrywalnością tej delecji obydwiema metodami (p=0,0001), przy bardzo wysokim stopniu zgodności wyników (κ= 0,87) (Tabela 2). Przykładowy wynik analizy cytogenetycznej uzyskany metodą CC oraz FISH przedstawiono na Rycinie 1. Zastosowanie metody CC-DSP30 umoŝliwiło wykrycie trisomii 12 u 5 (12%) chorych, podczas gdy FISH ujawnił tę anomalię w 7 (15%) przypadkach. U dwóch chorych z trisomią chromosomu 12 stwierdzoną metodą FISH nie uzyskano bowiem metafaz do analizy metodą CC-DSP30. Analiza statystyczna wykazała istotną zaleŝność pomiędzy wykrywalnością trisomii 12 metodą CC-DSP30 i FISH (p=0,0001). Ocena stopnia zgodności wyników w wykrywaniu tej aberracji potwierdziła duŝą siłę zaleŝności, gdyŝ współczynnik κ wynosił 0,81 (Tabela 2). Delecję 17p ujawniono obydwiema metodami u jednego chorego, w jednym przypadku wykryto ją tylko metodą FISH i w jednym tylko metodą CC-DSP30. Analiza statystyczna nie wykazała zaleŝności pomiędzy wynikami uzyskanymi za pomocą obu metod (p=0,09). Nie oceniano wiec stopnia zgodności wyników (Tabela 2). Metoda CC-DSP30 pozwoliła ponadto na ocenę anomalii chromosomowych nie wykrywanych techniką FISH z uŝyciem sond standardowych dla PBL. Aberracje te tylko w 6 przypadkach były zmianami izolowanymi. Aberracje liczbowe najczęściej dotyczyły chromosomów pary: 10 (monosomia, n=2) i 22 (monosomia, n=3), a strukturalne (addycje: n=11, translokacje: n=6) najczęściej dotyczyły złamań w regionie 8p23 (n=5), 3p26 (n=3), 18p11 (n=2). Translokacje, które udało się wykryć, to: t(14;17)(q32;q21), t(5;11)(q15;q23), t(2;8)(p21~23;q24), t(2;14)(p11;q32), t(3;20)(p21;q11) oraz t(6;11)(q21;p15). DYSKUSJA Ocena aberracji chromosomowych jako czynników prognostycznych nabiera w ostatnich latach coraz większego znaczenia. Zaproponowany przez Monserrat [26] podział populacji chorych na PBL uwzględnia ryzyko progresji choroby i oczekiwany całkowity czas przeŝycia. Wyodrębnia on grupę niskiego ryzyka, do której naleŝy zaliczyć chorych z prawidłowym kariotypem lub izolowaną del(13q) oraz grupę wysokiego ryzyka, do której naleŝą pacjenci z del(17p) lub del(11q). Chorzy z +12 pomimo, Ŝe istnieje u nich wysokie ryzyko szybkiej progresji choroby, w przeciwieństwie do chorych z wykrytą del(17p) lub del(11q) zwykle reagują na leczenie fludarabiną i mają dłuŝszy czas przeŝycia. Ograniczenia metody FISH i CC z zastosowaniem klasycznych stymulatorów uzasadniają poszukiwanie u chorych na PBL nowych metod umoŝliwiających wykrywanie aberracji cytogenetycznych zarówno tych o uznanym znaczeniu prognostycznym, jak i nie opisanych dotąd. Szansę taką stwarza oligonukleotyd CpG (DSP30) jako stymulator limfocytów B [22, 23]. Pozwala on na uzyskanie znacznie większej liczby metafaz niŝ klasyczne stymulatory np. TPA, a wykrywalność przynajmniej niektórych aberracji o znaczeniu prognostycznym dla PBL po jego zastosowaniu wydaje się porównywalna z metodą referencyjną jaką jest FISH. El-Taweel i wsp. [27] stosując TPA lub TPA w skojarzeniu z IL-2 do stymulacji limfocytów, wykryli aberracje chromosomowe u 24/46 (52%) badanych chorych. Quintero- Rivera i wsp. [28] uŝywając mitogenu szkarłatki i IL-2 uzyskali metafazy do analizy u 88,6% chorych,

52 A. KOTKOWSKA i wsp. ale tylko w 29% przypadkaów kariotyp był nieprawidłowy. Stymulacja limfocytów białaczkowych za pomocą DSP30 i IL-2 pozwoliła natomiast na uzyskanie metafaz nadających się do analizy aŝ w 95% przypadków, a aberracje wykryto u ponad 80% chorych, a więc w odsetku porównywalnym z wynikami uzyskiwanymi w analizie FISH [22]. W przedstawionej pracy w grupie 45 wcześniej nie leczonych chorych na PBL dokonaliśmy porównania wyników analizy aberracji chromosomowych wykrywanych za pomocą metody CC-DSP30 i referencyjnej metody FISH. Zastosowanie DSP30 jako stymulatora w klasycznej cytogenetyce pozwoliło uzyskać metafazy do analizy u 41/45 (91%) badanych chorych, a więc w odsetku znacznie wyŝszym w porównaniu z dotychczas stosowanymi mitogenami. Aberracje chromosomowe w analizowanej grupie wykryto u 30 (73%) chorych. Uzyskane przez nas wyniki są zgodne z wynikami przedstawionymi przez Dickera i wsp. [22], którzy metafazy do analizy uzyskali u 95% badanych chorych, wśród których 81% miało kariotyp nieprawidłowy. Częstość występowania aberracji chromosomowych wykryta metodą FISH w badanej przez nas grupie chorych wynosiła 87% i nie odbiegała znacząco od wyników przedstawionych przez innych autorów [9, 22, 29]. Niewielkie odchylenia mogą wynikać z róŝnic w wartościach punktów odcięcia dla określonych sond przyjętych przez róŝnych badaczy. Porównując metodę CC-DSP30 i FISH największe rozbieŝności stwierdziliśmy w wykrywaniu delecji 13q14. Aberracje tę wykryto metodą CC-DSP30 tylko w 22% przypadków, podczas gdy metodą FISH została ona ujawniona u 71% chorych. U 20/32 chorych z delecją 13q14 stwierdzoną metodą FISH zmiana ta nie została uwidoczniona w analizie prąŝkowej, poniewaŝ miała charakter delecji interstycjalnej i obejmowała zbyt mały region ramienia q. Rozdzielczość obrazu prąŝkowego uzyskiwana w badaniu GTG zazwyczaj nie była wysoka i wynosiła nie więcej niŝ 400 prąŝków. Submikroskopowy charakter delecji 13q u badanych chorych potwierdziliśmy metodą FISH na płytkach metafazowych. Uzyskane przez nas wyniki są zgodne z doniesieniami innych autorów, którzy uwaŝają, Ŝe 5 10% delecji regionu 13q14 stanowią delecje submikroskopowe tzw. mikrodelecje, których wykrycie jest moŝliwe jedynie za pomocą metody FISH [22, 23]. Stockero i wsp. [30] w grupie 12 chorych z prawidłowym kariotypem i jednoczesną delecją 13q ujawnioną w jądrach interfazowych, w 66% przypadków potwierdzili submikroskopowy charakter badanej zmiany wykonując FISH metafazowy. W pozostałych przypadkach autorzy ci nie uzyskali podziałów komórek nieprawidłowych. Obecnie uwaŝa się, Ŝe obecność izolowanej delecji 13q wiąŝe się z lepszym rokowaniem i łagodniejszym przebiegiem choroby oraz dłuŝszym czasem od rozpoznania do wdroŝenia leczenia (Treatment Free Survival; TFS) [9, 10]. W badanej przez nas grupie u 66% chorych z delecją 13q14 stwierdzoną metodą FISH, aberracja ta miała charakter zmiany izolowanej tzn. nie towarzyszyły jej del(11q), del(17p) oraz +12. Metoda CC-DSP30 pozwoliła natomiast na ujawnienie nieprawidłowego kariotypu u 48% chorych z izolowaną delecją 13q. Niewiele dotychczas wiadomo na temat znaczenia zmian obecnych w badaniu GTG u chorych z izolowaną del 13q ujawnioną w badaniu FISH. Pojedyncze doniesienia wskazują, Ŝe współistnienie delecji 13q z dodatkowymi translokacjami znacznie pogarsza rokowanie w tej grupie chorych [29]. Niezbędne wydaje się więc podjęcie dalszych badań w celu stwierdzenia, czy dodatkowe anomalie mogą zmieniać korzystne rokowanie związane z izolowaną delecją 13q, ocenianą metodą FISH. W przedstawionych przez nas badaniach metody CC-DSP30 i FISH wykazały podobną skuteczność w wykrywaniu delecji 11q oraz trisomii 12. U 9 chorych (20%) delecję 11q wykryto zarówno metodą FISH, jak i CC, a u dwóch chorych, u których nie uzyskano podziałów komórkowych ujawniono ją tylko metodą FISH. Ponadto, metoda CC-DSP30 pozwoliła na ujawnienie dodatkowych aberracji o charakterze translokacji w kariotypie 33% chorych z delecją 11q obecną w badaniu FISH. Obserwacja ta moŝe mieć istotne znaczenie, gdyŝ Mayr i wsp. [29] stwierdzili krótszy czas wolny od leczenia w grupie chorych z del(11q) i współistniejącymi translokacjami w porównaniu z grupą chorych z ujawnioną del(11q) bez translokacji.

Ocena przydatności cytogenetyki klasycznej 53 Trisomię 12 stwierdzono metodą FISH u 7 chorych, spośród których tylko u dwóch nie uzyskano metafaz do analizy metodą CC-DSP30. U 5 pozostałych chorych, u których stymulacja za pomocą DSP30 była skuteczna, trisomia 12 była widoczna równieŝ w klasycznej analizie cytogenetycznej. Delecja 17p13 jest aberracją o niekorzystnym znaczeniu rokowniczym i jest kojarzona z wysokim stadium zaawansowania klinicznego, istotnie krótszym czasem przeŝycia oraz opornością na leki alkilujące oraz na analogi puryn [7, 9, 10]. W badaniach naszych delecję 17p ujawniono obydwiema metodami u jednego chorego, w jednym przypadku wykryto ją tylko metodą FISH i w jednym tylko metodą CC-DSP30. Analiza statystyczna nie wykazała zaleŝności pomiędzy wynikami uzyskanymi za pomocą obu metod. MoŜe to wynikać z małej siły uŝytego testu statystycznego w sytuacji małej liczebności chorych, u których del(17p) wykazano przynajmniej jedną z badanych metod. Na uwagę zasługuje ponadto fakt, iŝ u obu chorych z del(17p) wykrytą metodą FISH, w badaniu metodą CC stwierdzono dodatkowe aberracje. U jednego chorego stwierdzono złoŝony kariotyp z licznymi aberracjami liczbowymi, m.in. monosomią chromosomu 17 oraz z aberracjami strukturalnymi. U drugiego chorego stwierdzono translokację zrównowaŝoną t(3;20) (p21;q11), natomiast del 17p nie była widoczna w analizie prąŝkowej, poniewaŝ obejmowała zbyt mały region chromosomu. U trzeciego pacjenta po wykonaniu badania FISH na chromosomach metafazowych, pomimo delecji w obrębie krótkiego ramienia chromosomu 17, nie stwierdzono utraty regionu 17p13.1. Haferlach i wsp. [23] wykazali statystycznie istotną korelację pomiędzy złoŝonym kariotypem, a występowaniem delecji 17p. Wśród 82 chorych ze złoŝonym kariotypem (3 lub więcej aberracji) u 28% stwierdzono del(17p), podczas gdy w grupie 384 chorych z niezło- Ŝonym kariotypem aberracje tę wykryto tylko u 1,3% badanych. Mayr i wsp. [29] u wszystkich pacjentów z del(17p) w badaniu metodą CC stwierdzili występowanie translokacji zrównowaŝonych i niezrównowaŝonych. Czas TFS był podobny u pacjentów z translokacjami i del(17p) w porównaniu z pacjentami, u których wykryto tylko translokacje. W badanej grupie chorych metoda CC-DSP30 pozwoliła na ocenę anomalii cytogenetycznych nie wykrywanych techniką FISH z uŝyciem standardowego panelu sond dla PBL. Aberracje te rzadko występowały jako zmiany izolowane (n=6). Aberracje liczbowe najczęściej dotyczyły chromosomów pary: 10 (monosomia, n=2) i 22 (monosomia, n=3), a strukturalne (addycje: n=11, translokacje: n=6), najczęściej dotyczyły złamań w regionie 8p23 (n=5), 3p26 (n=3), 18p11 (n=2). Fink i wsp. [31] opublikowali wyniki badań, w których u czterech chorych opisali monosomię chromosomu 22, a u jednego monosomię chromosomu 10. Dicker i wsp. [22] w badaniu metodą CC wykryli aberracje, w których w 5 przypadkach zaangaŝowany był region 18p11, a w dwóch przypadkach region 8q21-23. Zagadnienie to wymaga jednak dalszych badań. PODSUMOWANIE Metoda FISH w porównaniu z metodą CC-DSP30 jest czulszą techniką w wykrywaniu delecji 13q14, które niemal w 100% przypadków mają charakter interstycjalny i dotyczą niewielkiego regionu ramienia q. Obydwie metody wykazują podobną skuteczność w wykrywaniu delecji 11q i trisomii 12. Ponadto, delecji 11q oraz izolowanej delecji 13q14 wykrytej metodą FISH towarzyszyły inne aberracje chromosomowe ujawnione techniką CC-DSP30. Niezbędne wydaje się podjęcie dalszych badań, aby ocenić czy dodatkowe anomalie mogą zmieniać korzystne rokowanie związane z izolowaną delecją 13q ocenianą metodą FISH. Celowe wydaje się takŝe dokonanie oceny nie znanych dotąd i nie wykrywanych metodą FISH z uŝyciem standardowego dla PBL panelu sond, aberracji chromosomowych, które mogą w przyszłości przyczynić się do lepszego poznania biologii B-PBL i pełniejszego jej diagnozowania, jak równieŝ wpłynąć na wybór odpowiedniej strategii leczenia. Praca finansowana z Grantu KBN Nr 2553/B/PO1/2008/34

54 A. KOTKOWSKA i wsp. PIŚMIENNICTWO 1. Dighiero G, Hamblin TJ. Chronic lymphocytic leukemia. Lancet 2008; 371: 1017-1029. 2. Rai KR, Savitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RP, Pasternack BS. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975; 46: 219-234. 3. Binet JL, Auquire A, Digiero G, Chastang C, Piguet H, Goasguen J, et al. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer 1981; 48: 198-206. 4. Cheson BD, Bennett JM, Grever M et al. National Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 1996; 87: 4990-4997. 5. Hallek M, Cheson BD, Catovsky D et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute- Working Group 1996 guidelines. Blood 2008; 111: 5446-5456. 6. Inamdar KV, Bueso-Ramos CE. Pathology of chronic lymphocytic leukemia: an update. Ann Diagn Pathol. 2007; 11: 363-389. 7. Van Bockstaele F, Verhasselt B, Philippe J. Prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia: A comprehensive review. Blood Rev. 2009; 23: 25-47. 8. Moreno C, Montserrat E. New prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia. Blood Rev. 2008; 22: 211-219. 9. Dohner H, Stilgenbauer S, Benner A et al. Genomic aberration and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2000; 26: 1910-1916. 10. Dewald GW, Brockman SR, Paternoster SF, Bone ND, O`Fallon JR, Allmer C. Chromosome anomalies detected by interphase fluorescence in situ hybridization: correlation with significant biological features of B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol 2003; 121: 287-295. 11. Robak T, Blonski JZ, Wawrzyniak E et al. Activity of cladribine combined with cyclophosphamide (CC regimen) in frontline therapy of chronic lymphocytic leukemia with 17p13.1/TP53 deletion; report from the Polish Adult Leukemia Group (PALG). Cancer 2009; 1: 94-100. 12. Aoun P, Blair HE, Smith LM et al. Fluorescence in situ hybridization detection of cytogenetic abnormalities in B-cell chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma. Leuk Lymphoma 2004; 45: 1595-1603. 13. Gozzetti A., Le Beau M.M.: Fluorescence in situ hybridization: Uses and limitation. Semin Hematol 2000; 37 : 320-333. 14. Glassman AB, Hayes KJ. The value of fluorescence in situ hybridization in the diagnosis of chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2005; 158: 88-91. 15. Juliusson G, Oscier D, Gahrton G, for the International Working Party On Chromosomes in CLL (IWCCLL). Cytogenetic findings and survival in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Second IWCCLL compilation of date on 662 patients. Leukemia Lymph 1991; 5: 21-25. 16. Carlson M, Totterman TH, Matsson P&Nilsson K. Cell cycle progression of B-chronic lymphocytic leukemia cells induced to differentiate by TPA. Blood 1988; 71: 415-421. 17. Gahrton G, Robert KH, Friberg K, Zech L, Bird AG. Nonrandom chromosomal aberrations in chronic lymphocytic leukemia revaled by polyclonal B-cell mitogen stimulation. Blood 1980; 56: 640-647. 18. Decker T, Schneller F, Sparwasser T, Tretter T, Lipford GB, Wagner H. Immunostimulatory CpG-oligonucleotides cause proliferation proliferation, cytokine production, and an immunogenic phenotype in chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood 2000; 95: 999-1006. 19. Sparwasser T, Koch ES, Vabulas RM et al. Bacterial DANN and immunostimulatory CpG oligonucleotides tigger maturation and activation of murine dendritic cells. Eur J Immunol. 1998; 28: 2045-2054. 20. Klinman D, Takeshita F, Gursel I et al. CpG DNA: recogniyion by and activation of monocytes. Microbes Infection 2002; 4: 897-901. 21. Decker T, Schneller F, Hipp S, Miething S, Jahn T, Duyster J and Pesche C. Cell cycle progression of chronic lymphocytic leukemia cells is controlled by cyclin D2, cyclin D3, cyclin-dependent kinase (cdk) 4 and the cdk inhibitor p27. Leukemia 2002; 16: 327-334. 22. Dicker F, Schnittger S, Haferlach T, Kern W, Schoch C. Immunostimulatory oligonucleotide-induced metaphase cytogenetics detect chromosomal aberrations in 80% of CLL patients: a study of 132 CLL cases with correlation to FISH, IgV H status, and CD38 expression. Blood 2006; 108: 3152-3160. 23. Haferlach C, Dicker F, Schnittger S, Kern W, Haferlach T. Comprehensive genetic characterization of CLL: a study on 506 cases analysed with chromosome banding analysis, interphase FISH, IgV H, status and immunophenotyping. Leukemia 2007; 21: 2442-51. 24. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Shaffer LG, Slovak ML, Campbell LJ (eds); S Karger, Basel 2009. 25. Altman DG. Practical statistics for medical research. Champan&Hall/CRC (eds), London, 1999, 403-9. 26. Montserrat E. New prognostic markers in CLL. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2006: 279-284.

Ocena przydatności cytogenetyki klasycznej 55 27. el-taweel M, Barin C, Cymbalista F, Eclache V. Detection of chromosomal abnormalities associated with chronic lymphocytic leukemia: what is the best method? Cancer Genet Cytogenet 2009; 195: 37-42. 28. Quintero-Rivera F, Nooraie F, Rao PN. Frequency of 5`IGH deletion in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2009; 190: 33-39. 29. Mayr Ch, Speicher MR, Kofler DM, Buhmann R, Strehl J, Busch R. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukaemia. Blood 2006; 107: 742-751. 30. Stockero KJ, Fink SR, Smoley SA et al. Metaphase cells with normal G-bands have cryptic interstial deletions in 13q14 detectable by fluorescence in situ hybridization in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2006; 166: 152-156. 31. Fink SR, Smoley SA, Stockero KJ et al. Loss of TP53 is due to rearrangements involving chromosome region 17p10~p12 in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2006; 167: 177-181. Praca wpłynęła do Redakcji 5.01.2010 r. i została zakwalifikowana do druku 8.03.2010 r. Adres Autorów: Klinika Hematologii UM w Łodzi ul. Ciołkowskiego 2 93-510 Łódź