JAK WYZNACZA SIĘ PARAMETRY WALIDACYJNE 1 Granica wykrywalności i granica oznaczalności Dr inż. Piotr KONIECZKA Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska ul. G. Narutowicza 11/12 80-952 GDAŃSK e-mail: kaczor@chem.pg.gda.pl Nazewnictwo 2 Limit detekcji Limit wykrywalności Wykrywalność Granica detekcji GRANICA WYKRYWALNOŚCI 1
Symbole 3 GW DL (detection limit) MDL (method detection limit) ML (minimum limit) L D DTC RDL (reliable detection limit) LOD Definicje 4 Określenie minimalnej zawartości analitu, dla której wartości sygnału można przypisać obecność analitu granica wykrywalności. Określenie minimalnej zawartości analitu, dla której wartości sygnału można przypisać ilość analitu granica oznaczalności. LOQ sygnał/szum = 10 LOD sygnał/szum = 3 sygnał szum 2
Definicje 5 Stosunek sygnału do szumu (ang. Signal to Noise Ratio S/N): wielkość bezwymiarowa, która określa stosunek sygnału analitycznego do średniego poziomu szumów tła dla określonej próbki. jego wartość może służyć do określania wpływu poziomu szumu na względny błąd pomiaru, najbardziej praktyczną metodą jego wyznaczenia jest stosunek średniej arytmetycznej serii pomiarów dla próbek ślepych (bądź zawierających analit na bardzo niskim poziomie) do wartości odchylenia standardowego uzyskanego dla tej serii pomiarów, Definicje 6 Granica wykrywalności (ang. Limit of Detection - LOD) najmniejsza ilość lub najmniejsze stężenie substancji (pierwiastka, jonu, związku) możliwe do wykrycia za pomocą danej procedury czy też techniki analitycznej z określonym prawdopodobieństwem. związana ściśle z określoną procedurą analityczną (wartość zależy zarówno od poziomu zawartości oznaczanego składnika, jak i obecności innych składników występujących w analizowanej próbce), najmniejsze stężenie analitu, przy którym istnieje pewność jego obecności w próbce, jej wartość charakteryzuje się wymiarem zawartości czy stężenia (takim jak oznaczany analit czyli np. µg/dm 3 ), ściśle związana z poziomem szumów stosowanego urządzenia pomiarowego (najczęściej to trzykrotność tego poziomu szumów), 3
Definicje 7 Granica oznaczalności (ang. Limit of Quantification - LOQ): najmniejsza ilość lub najmniejsze stężenie substancji, możliwe do ilościowego oznaczenia za pomocą danej procedury analitycznej z założoną dokładnością i precyzją. jej wartość jest zawsze wielokrotnością wyznaczonej wartości granicy wykrywalności najczęściej: LOQ = 3 LOD, chociaż znane są takie definicje granicy oznaczalności, w których jej wartość jest równa 2 LOD czy też 6 LOD, Granica wykrywalności a niepewność 8 poza zakresem liniowym 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0-1 -2-3 Zawartość analitu [wyrażona w krotności odchylenia standardowego s] wysoka pewność niska niepewność wysoka niepewność szumy LOQ LOD MB 4
Metody wyznaczania wartości granicy wykrywalności 9 Sposób wyznaczania wartości granicy wykrywalności zależy od następujących czynników: natury procedury analitycznej (procedura manualna bądź też procedura oparta na wykorzystaniu odpowiedniego przyrządu pomiarowego), charakterystyki procedury instrumentalnej, możliwości uzyskania (sporządzenia) tzw. ślepych próbek, Oszacowanie wzrokowe 10 W przypadku metody klasycznej (nieinstrumentalnej), dla której nie jest możliwe wyznaczenie poziomu szumów stosowanego urządzenia pomiarowego, stosuje się metodę szacowania poziomu granicy wykrywalności w oparciu o własne doświadczenia. W oparciu o wyniki analizy próbek o znanej zawartości analitu (roztwory wzorcowe) oszacowuje się ten poziom stężenia, przy którym możliwe jest jego wykrycie. Sposób ten można także stosować instrumentalnych. w przypadku metod 5
Obliczanie na podstawie wartości stosunku sygnał/szum (S/N) 11 Może być stosowana jedynie w przypadku, gdy istnieje możliwość uzyskania linii bazowej szumów otrzymanej gdy oznaczeniu końcowemu jest poddawana tzw. ślepa próbka, bądź też próbka zerowa. Sposób obliczania: wyznaczyć wartość stosunku sygnału do szumu dla próbki ślepej (jeśli to jest możliwe) lub dla próbki o bardzo niskiej zawartości analitu, zastosować wprost definicję granicy wykrywalności. Obliczanie na podstawie wartości stosunku sygnał/szum (S/N) 12 W przypadku np. metod chromatograficznych można wartość LOD wyznaczyć na podstawie uzyskanego chromatogramu dla próbki ślepej. W tym celu określa się poziom szumów mierząc na chromatogramie zakres zmiany sygnału w pobliżu czasu retencji dla analitu (można przyjąć np. wartość zakresu czasu retencji jako t R ±0,5 minuty). analitu Następnie tę wielkość mnoży się przez 3 i przelicza uzyskaną wartość sygnału na wartość stężenia. 6
Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych 13 Metoda bardziej pracochłonna jednak i zarazem metrologicznie bardziej poprawna. Sposób postępowania: przeprowadzić 10 niezależnych pomiarów dla 10 niezależnie przygotowanych ślepych próbek, obliczyć dla tak uzyskanych 10-ciu wyników wartość średnią oraz wartość odchylenia standardowego, wyznaczyć wartość granicy wykrywalności w oparciu o zależność: LOD = x śr + 3 s Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych 14 Uzyskanie wartości liczbowej dla wartości średniej w praktyce jest rzadko możliwe - paradoksalnym wydaje się uzyskanie wyniku dla wartości, która z definicji powinna być poniżej wartości granicy oznaczalności. Zastosowanie powyższego sposobu jest możliwe jedynie w przypadku, gdy poziom stężenia analitu jest mierzalny dla próby ślepej (poziom zawartości analitu w ślepej próbce jest co najmniej równy wartości granicy oznaczalności). 7
Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych 15 W przeciwnym przypadku stosować można modyfikację opisanej metody: wykonać 10 niezależnych oznaczeń dla próbek, w których poziom zawartości analitu jest bliski spodziewanej granicy wykrywalności (oczywiście próbki takie sporządzane są poprzez dodanie do próbek ślepych mierzalnych ilości analitu), obliczyć dla tak uzyskanych 10-ciu wyników wartość średnią oraz wartość odchylenia standardowego, wyznaczyć wartość granicy wykrywalności w oparciu o zależność: LOD= 0 + 3 s Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych Kolejną modyfikacją tej metody jest opisany poniżej sposób: sporządzić serię n próbek o zawartości analitu na poziomie zbliżonym do spodziewanej wartości granicy wykrywalności (najdogodniej wzorce, w których matryca odpowiada swoim składem matrycy próbek rzeczywistych), wykonać analizę tak przygotowanych próbek otrzymując serię n wyników, obliczyć dla nich wartość średnią i wartość odchylenia standardowego, wartość granicy wykrywalności obliczyć wg zależności: gdzie: t parametr testu t-studenta, f liczba stopni swobody f = n -1, n liczba niezależnych próbek, α przyjęty poziom istotności, LOD= t(α, f ) s 16 8
Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych 17 Jeżeli przygotowane roztwory wzorcowe poddawane są przed oznaczeniem końcowym całej procedurze analitycznej tak wyznaczona wartość granicy wykrywalności stanowi granicę wykrywalności procedury analitycznej MDL (method detection limit). Jeżeli natomiast oznaczenia wykonywane są bezpośrednio w przygotowanych roztworach wzorcowych to w ten sposób wyznaczana jest wartość granicy wykrywalności urządzenia pomiarowego IDL (instrument detection limit). Obliczanie w oparciu o metodę graficzną 18 Polega na wykonaniu oznaczeń dla 3 poziomów stężeń analitu (bliskim spodziewanej wartości granicy wykrywalności). Dla każdego poziomu zawartości analitu należy wykonać po co najmniej 6 oznaczeń, a następnie dla każdej z tak uzyskanych serii pomiarów obliczyć wartości odchyleń standardowych. Z kolei wyznacza się zależność liniową wiążącą obliczone wartości odchylenia standardowego z wartościami stężeń: s = f (c ) wyraz wolny tej zależności to wartość s o a wyznaczona na tej podstawie wartość granicy wykrywalności obliczana jest zgodnie ze wzorem: LOD = 3 s o 9
19 stężenie sygnał 0,2 14 0,2 12 0,2 12 0,2 11 0,2 13 0,2 12 0,3 15 0,3 16 0,3 15 0,3 17 0,3 16 0,3 18 0,4 23 0,4 24 0,4 22 0,4 25 0,4 23 0,4 24 20 10
21 22 11
23 Obliczanie na podstawie wartości odchylenia standardowego zbioru sygnałów i kąta nachylenia krzywej kalibracyjnej 24 Najczęściej jednak, wykorzystywana procedura analityczna oparta jest, na etapie oznaczenia końcowego, o zasadę pomiaru pośredniego, czyli takiego dla którego wymagany jest dodatkowy etap procedury analitycznej kalibracja. W takim przypadku także i ten etap będzie miał wpływ na wartość granicy wykrywalności. Obliczenie granicy wykrywalności oparte jest w tym przypadku o następującą zależność: gdzie: s LOD= 3, 3 b s wartość odchylenia standardowego, b współczynnik kierunkowy prostej kalibracyjnej, 12
Obliczanie na podstawie wartości odchylenia standardowego zbioru sygnałów i kąta nachylenia krzywej kalibracyjnej 25 Wartość odchylenia standardowego można w tym przypadku wyznaczyć w trojaki sposób: 1. odchylenie standardowe wyników uzyskanych dla serii próbek ślepych, 2. resztkowe odchylenie standardowe krzywej kalibracyjnej, 3. odchylenie standardowe wyrazu wolnego uzyskanej krzywej kalibracyjnej. Obliczanie na podstawie wartości odchylenia standardowego zbioru sygnałów i kąta nachylenia krzywej kalibracyjnej 26 Ważnym jest fakt odpowiedniego doboru stężeń roztworów wzorcowych w celu wyznaczenia krzywej kalibracyjnej (wiadomo jest, że krzywa kalibracyjna ma zakres prostoliniowy w ściśle określonym przedziale stężeń i z całą pewnością jej przebieg ma inną charakterystykę dla poziomu zawartości w pobliżu granicy wykrywalności). 13
stężenie sygnał 0,25 110 0,25 105 0,25 104 0,25 106 0,25 108 0,35 125 0,35 128 0,35 132 0,35 130 0,35 133 0,45 152 0,45 156 0,45 157 0,45 159 0,45 160 0,55 189 0,55 190 0,55 192 0,55 197 0,55 192 0,65 215 0,65 220 0,65 217 0,65 230 0,65 229 27 28 14
29 30 15
Obliczanie na podstawie wartości granicy oznaczalności Sposób postępowania: wykonać pomiary dla roztworów wzorcowych (wzorce matrycowe) na co najmniej 5 poziomach stężeń, wykonać po 6 równoległych pomiarów dla każdego z roztworów wzorcowych, dla każdego z poziomu stężeń obliczyć wartość współczynnika zmienności CV, wykreślić wykres zależności: CV = f(c), określić wartość wymaganej precyzji dla granicy oznaczalności (zwykle CV = 10%) i dla tej wartości odczytać z wykresu wartość stężenia równego granicy oznaczalności, granicę wykrywalności obliczyć jako: LOQ LOD= 3 31 Obliczanie na podstawie wartości granicy oznaczalności 32 CV [%] założona wartość precyzji np.: CV =10% odczytana wartość LOQ c [np.: mg/dm 3 ] 16
stężenie sygnał 0,25 45 0,25 51 0,25 53 0,25 42 0,25 44 0,5 87 0,5 82 0,5 92 0,5 95 0,5 98 0,85 124 0,85 134 0,85 126 0,85 127 0,85 130 1,25 189 1,25 190 1,25 192 1,25 197 1,25 192 2,1 313 2,1 324 2,1 323 2,1 320 2,1 317 33 34 17
35 36 18
Metody obliczania granicy wykrywalności wymagania, wady i zalety Metoda obliczania wartości granicy wykrywalności Oszacowanie wzrokowe Obliczanie na podstawie stosunku sygnał/szum Wymagania próbka o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy), próbka o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy), Wady/zalety metoda szybka, metoda szacunkowa, stosowana przeważnie w przypadku klasycznych (nieistrumentalnych) metod analitycznych, wymagane doświadczenie analityczne, metoda szybka, stosowana jedynie w przypadku pomiarów instrumentalnych istnieje możliwość wyznaczenia stosunku sygnał/szum, 37 Metody obliczania granicy wykrywalności wymagania, wady i zalety Metoda obliczania wartości granicy wykrywalności Obliczanie na podstawie wyników oznaczeń dla próbek ślepych Obliczanie w oparciu o metodę graficzną Wymagania seria próbek ślepych lub o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy), seria próbek wzorcowych 3 poziomy stężeń, wykonanie po co najmniej 6 pomiarów dla każdej z próbek wzorcowych, Wady/zalety metoda praco- i czasochłonna, nie uwzględnia wpływu kalibracji na wartość LOD, wykorzystuje się parametr prawdopodobieństwa w wyznaczeniu LOD, metoda dość szybka, uwzględnia się wpływ etapu kalibracji na wartość LOD, 38 19
Metody obliczania granicy wykrywalności wymagania, wady i zalety Metoda obliczania wartości granicy wykrywalności Obliczanie na podstawie wartości odchylenia standardowego sygnałów i kąta nachylenia krzywej kalibracyjnej Obliczanie na podstawie wartości granicy oznaczalności Wymagania seria próbek ślepych lub o znanej zawartości analitu (roztwór wzorcowy lub wzorzec matrycowy), roztwory wzorcowe do sporządzenia krzywej kalibracyjnej, seria roztworów wzorcowych, założona wartość współczynnika zmienności dla granicy oznaczalności, Wady/zalety metoda praco- i czasochłonna, uwzględnia się wpływ etapu kalibracji na wartość LOD, umotywowana metrologicznie, metoda pośrednia LOD obliczone na podstawie wyznaczonej LOQ, wartość LOD (LOQ) powiązana z założoną precyzją pomiarów, 39 Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności 40 Do obliczania wartości granicy wykrywalności stosuje się roztwory wzorcowe. Powinny one charakteryzować się, w przypadku obliczania granicy wykrywalności dla procedury analitycznej (MDL), dwiema podstawowymi cechami: jak najbardziej zbliżony skład matrycy do składu matrycy dla próbek rzeczywistych, stężenie analitu na poziomie zbliżonym do spodziewanej wartości granicy wykrywalności, Wartość odchylenia standardowego ściśle zależy od poziomu zawartości oznaczanego składnika. Może się zdarzyć, iż stosowane stężenia dla próbek wzorcowych znacznie przewyższają obliczoną wartość granicy wykrywalności. 20
Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności W celu sprawdzenia poprawności wyliczonej wartości granicy wykrywalności należy sprawdzić następujące zależności: 41 10 MDL > c min MDL < c min gdzie: c min stężenie analitu w próbkach roztworu wzorcowego o najniższym stężeniu, Nie spełnienie pierwszej z zależności oznacza, iż stężenie w przygotowanych roztworach wzorcowych jest za wysokie i należy przeprowadzić obliczenia wartości granicy wykrywalności dla nowo przygotowanych roztworów wzorcowych o niższym stężeniu. Odwrotnie, nie spełnienie drugiej zależności oznacza, że stężenie analitu w przygotowanych roztworach wzorcowych jest za niskie, należy przeprowadzić ponowne pomiary i obliczenia stosując roztwory wzorcowe o wyższej zawartości analitu. Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności 42 Sprawdzenie poprawności wartości stężenia w oparciu, o które wyznaczano wartość granicy wykrywalności można także przeprowadzić szacując wartość stosunku sygnału do szumu na podstawie zależności: S N xśr = s Zgodnie z definicją granicy wykrywalności wartość tego stosunku powinna mieścić się w przedziale 3 do 10. W przypadku gdy obliczona wartość jest wyższa, wartość stężenia roztworu wzorcowego jest zbyt wysoka i należałoby przeprowadzić ponowne pomiary dla niższych stężeń zawartości analitu w próbkach roztworów wzorcowych. 21
Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności 43 Należy również zwrócić uwagę, w trakcie pomiarów dla roztworów wzorcowych, na wartość tzw. odzysku metody analitycznej. Obliczyć ją można na podstawie zależności: x R = c śr 100% Zbyt niska wartość tego parametru wpływa na niedoszacowanie obliczonej wartości granicy wykrywalności. R powinno zawierać się w przedziale 80-120% Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności 44 Opisane metody sprawdzania poprawności wyliczonej wartości granicy wykrywalności mogą być stosowane jedynie w przypadku, gdy pomiary są wykonywane z wykorzystaniem sporządzonych roztworów wzorcowych. 22
Sposoby sprawdzania poprawności wyznaczonej wartości granicy wykrywalności 45 Podstawowym kryterium sprawdzającym wartość wyznaczonej granicy wykrywalności jest spełnienie wymogów stawianych danej procedurze analitycznej. Poprawne podawanie wartości wyników pomiarów w pobliżu granicy wykrywalności i oznaczalności 46 Wartość wyniku x x < LOD LOD x < LOQ x LOQ Zapisanie wyniku Nie wykryto Wykryto, nie oznaczono Wartość stężenia 23
PODSUMOWANIE 47 Wybór odpowiedniej metody wyznaczania granicy wykrywalności zależy od celu jakiemu ma ona służyć jak i wymogów danej procedury analitycznej. W przypadku walidacji procedury analitycznej zalecanym jest wykorzystanie metody, która w swych założeniach opiera się o metrologię chemiczną wartość wyznaczonej granicy wykrywalności jest związana z parametrami statystycznymi takimi jak poziom prawdopodobieństwa, liczba stopni swobody. W przypadku pomiarów jednostkowych, gdy wymagane jest jedynie oszacowanie wartości LOD wskazanym jest stosowanie metod mniej czasochłonnych. PODSUMOWANIE 48 Przy podawaniu wartości LOD należy podać również opis i parametry metody jaka została wykorzystana przy jej obliczaniu. 24
49 25