WRÓBEL, LIDIA STASIAK-RÓŻAŃSKA, MAREK KIELISZEK

WPŁYW STĘŻENIA GLICEROLU I ph PODŁOŻA HODOWLANEGO NA KINETYKĘ WZROSTU DROŻDŻY PASZOWYCH CANDIDA UTILIS ATCC 9950 W PODŁOŻACH Z ODBIAŁCZONĄ ZIEMNIACZANĄ WODĄ SOKOWĄ AGNIESZKA KURCZ, STANISŁAW BŁAŻEJAK, ANNA BZDUCHA- WRÓBEL, LIDIA STASIAK-RÓŻAŃSKA, MAREK KIELISZEK Streszczenie Produkcja biomasy komórkowej drożdży jest relatywnie tania, co w dużej mierze związane jest z możliwością zastosowania do ich hodowli surowców będących odpadami z różnych gałęzi przemysłu. W ten sposób osiąga się dodatkową korzyść, gdyż usuwanie wielu odpadów i produktów ubocznych z różnych procesów technologicznych stanowi zwykle poważny problem, zarówno dla zakładu produkcyjnego, jak i środowiska naturalnego. Jednocześnie można uzyskać biomasę drożdżową bogatą w białko, tłuszcz, witaminy, składniki mineralne oraz prebiotyczne polisacharydy. Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu różnego stężenia glicerolu w pożywce oraz kwasowości czynnej środowiska na wzrost drożdży paszowych Candida utilis ATCC 9950 w podłożach z odbiałczoną ziemniaczaną wodą sokową. Doświadczenie przeprowadzano w mikrohodowlach aparatu Bioscreen C, wykorzystując jako podłoża kontrolne YPD oraz ziemniaczaną wodę sokową, a jako doświadczalne ziemniaczaną wodę sokowa wzbogaconą różnym dodatkiem glicerolu. Kwasowość czynną (ph) ustalono na poziomie 4,0 lub 5,0. Najwyższy wzrost badanego szczepu drożdży uzyskano podczas hodowli w podłożu z 5% dodatkiem glicerolu o ph 5,0. Wskazuje na to zarówno wysoki przyrost gęstości optycznej podczas prowadzenia hodowli (1,442), jak i korzystne parametry kinetyki wzrostu (µ max =0,022 i g=31,11). Z kolei wyższe stężenia glicerolu (od 15%) działały hamująco na wzrost badanego szczepu drożdży. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że glicerol i odbiałczona ziemniaczana woda sokowa mogą być wykorzystywane jako źródło węgla i azotu do produkcji biomasy drożdży paszowych Candida utilis ATCC 9950. Słowa kluczowe: Bioscreen, Candida utilis, glicerol, ziemniaczana woda sokowa, SCP, utylizacja odpadów Wprowadzenie Koncepcja produkcji biomasy i wykorzystania mikroorganizmów jako źródła składników żywności dla ludzi i zwierząt powstała już na początku dwudziestego 121

wieku. Termin SCP (single-cell protein) został po raz pierwszy użyty w Massachusetts Institute of Technology w 1966 roku, aby przedstawić ideę zastosowania biomasy jednokomórkowców jako żywności [Jay, 1992]. Można wymienić szereg jego zalet, dzięki którym przewyższa białko pochodzenia roślinnego. Do najważniejszych należą krótki czas generacji drobnoustrojów oraz wysoka zawartość odpowiedniej jakości białka w komórkach. Istotny jest również fakt, że produkcja SCP może być prowadzona w procesie ciągłym i jest niezależna od zmian klimatycznych [Lipińska i in., 2010; Rywińska i in., 2013]. Spośród wszystkich grup mikroorganizmów największą popularnością cieszą się drożdże paszowe, na przykład Candida utilis. Gatunek ten został uznany przez FDA (Food and Drug Administraction - Agencja Żywności i Leków) za bezpieczny do spożycia przez ludzi i zwierzęta oraz wpisany na listę GRAS (Generally Recognised As Safe uważane za bezpieczne) [Internet 1]. Drożdże te charakteryzują się wysoką zawartością białka, w skład którego wchodzi duża ilość aminokwasów egzogennych, a w szczególności lizyny. Ponadto biomasa tych drożdży może stanowić źródło witamin z grupy B oraz składników mineralnych (w postaci biopleksów) [Błażejak i Duszkiewicz-Reinhard, 2004; Kieliszek i in., 2012]. Istotną rolę odgrywają również składniki ściany komórkowej drożdży, przede wszystkim oligomannany i β-glukany, wykazujące działanie prebiotyczne dla mikroflory przewodu pokarmowego orz immunoindukcyjne [Bzducha-Wróbel i in., 2013]. Drożdże z rodzaju Candida należą do tzw. drożdży dzikich, które w przeciwieństwie do szlachetnych (Saccharomyces) nie są wymagające pod względem wykorzystywanego źródła węgla oraz obecności induktorów wzrostu (witamin, aminokwasów) [Walker, 1998]. Optymalna temperatura ich wzrostu wynosi ok. 25-30 C, a ph mieści się w zakresie 4,0-6,0 [Błażejak, 2006; Juszczyk i in., 2005]. Drożdże Candida utilis posiadają złożony metabolizm, który umożliwia wzrost na różnorodnych źródłach węgla (cukry, alkohole, kwasy organiczne, węglowodory) oraz związkach azotowych (zarówno organicznych jak i nieorganicznych) [Walker, 1998; Lipińska i in., 2010]. Umożliwia to wykorzystywanie do ich produkcji surowców odpadowych, takich jak melasa, ługi posiarczynowe, hydrolizaty drewna, odpady skrobiowe i ligninocelulozowe, a także serwatka. Stanowią one tanie źródło węgla dla drożdży paszowych, a niekiedy również związków azotowych, fosforu i składników mineralnych [Juszczyk i in., 2005; Munawar i in., 2010]. W ostatnich latach poszukuje się nowych surowców odpadowych, które mogą być wykorzystywane w procesach biotechnologicznych, jednocześnie umożliwiając ich ekonomiczną utylizację. Należą do nich między innymi zmielone muszle krewetkowe, odpady z przemysłu mięsnego, wytłoki z pomarańczy oraz odpady tłuszczowe z procesów smażalniczych [Musiał i in., 2004; Juszczyk i in., 2005; Lipińska i in., 2010]. Jednym z takich surowców może być również glicerol, powstający jako produkt uboczny w procesie otrzymywania estrów metylowych 122

kwasów tłuszczowych (biodiesla). Najczęściej wykorzystywany jest on w przemyśle kosmetycznym. Ponadto może stanowić dobre źródło węgla dla niektórych drobnoustrojów i jest prekursorem do produkcji wielu cennych metabolitów [Amaral i in., 2009]. Liczne badania [Juszczyk i in., 2005; Komorowski i Błażejak, 2011; Taccari i in., 2012; Bzducha-Wróbel i in., 2013] dowodzą, że glicerol może być z powodzeniem wykorzystywany w produkcji biomasy drożdży paszowych, które są w stanie asymilować go jako jedyne źródło węgla. Jako źródło azotu i składników mineralnych dla drożdży mogą być wykorzystywane odpady z przetwórstwa ziemniaczanego i skrobiowego [Muniraj i in., 2013; Błażejak i in., 2014]. W procesie produkcji skrobi ziemniaczanej powstają duże ilości odpadów, w tym głównie ziemniaczanej wody sokowej (około 600 ton przy przerobie 1000 ton ziemniaków). W celu utylizacji poddaje się ją procesowi kwasowo-termicznej koagulacji (odbiałczania), a następnie stosuje do nawożenia pól i łąk. Ze względu na wysoki ładunek zanieczyszczeń odbiałczonej ziemniaczanej wody sokowej (wskaźnik ChZT ok. 30 000 mg O 2 L -1 ), metoda ta może budzić pewne obawy z punktu widzenia ochrony środowiska. Z tego powodu wskazane jest poszukiwanie alternatywnych metod utylizacji tego odpadu [Miedzianka i in., 2010; Bzducha-Wróbel i in., 2014], na przykład wykorzystując go w procesach biotechnologicznych [Nowak i in., 2013; Liu i in., 2013; Błażejak i in., 2014]. Celem niniejszej pracy było określenie wpływu różnego stężenia glicerolu w pożywce oraz kwasowości czynnej środowiska na wzrost drożdży paszowych Candida utilis ATCC 9950 w podłożach z odbiałczoną ziemniaczaną wodą sokową. Materiał i metody badań Do badań wykorzystywano szczep drożdży paszowych Candida utilis ATCC 9950 pochodzący z Amerykańskiej Kolekcji Czystych Kultur. Do przygotowania inokulum oraz jako podłoże kontrolne zastosowano standardowe podłoże YPD [Błażejak i in., 2014]. Jako drugie podłoże kontrolne wykorzystano odbiałczoną ziemniaczaną wodę sokową. Podłoża doświadczalne stanowiła woda sokowa wzbogacona glicerolem w stężeniu 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 i 25% (w/v). Podłoża przygotowano w dwóch wariantach, ustalając kwasowość czynną (ph) środowiska na poziomie 4,0 lub 5,0. Odbiałczona ziemniaczana woda sokowa została przygotowana w skali laboratoryjnej z ziemniaków odmiany Irga. Procedura pozyskiwania wody sokowej była podobna do tej stosowanej w zakładach produkujących skrobię ziemniaczaną. Ziemniaki były mechanicznie rozdrabniane, w wyniku czego wydzielał się sok, który następnie oddzielano od wycierki. Tak uzyskany sok ziemniaczany wirowano w celu usunięcia skrobi (3200xg/20 min, Eppendorf Centrifuge 5810, Niemcy), a następnie poddawano procesowi kwasowo-termicznej koagulacji (ph 5,0, 117 C, 123

10 minut). Wytrącone białko oddzielano poprzez sączenie przez watę, a przesącz, czyli odbiałczoną ziemniaczaną wodę sokową, wykorzystywano do przygotowania podłoży hodowlanych [Bzducha-Wróbel i in., 2014]. W tak otrzymanej wodzie sokowej stwierdzono zawartość suchej substancji na poziomie 3,55% (g s.s. /100 cm 3 wody sokowej). W jej skład wchodziło około 1,34% substancji bezpośrednio redukujących stanowiących źródło węgla dla drożdży oraz 1,29% białka ogółem będącego źródłem azotu. Inokulum drożdży przygotowano w 100 cm 3 płynnego podłoża YPD o ph 5,0, prowadząc hodowlę przez 24 godziny w temperaturze 28 C na wytrząsarce posuwisto-zwrotnej (Edmund Bühler SM-30 Control, Niemcy) przy amplitudzie drgań 200 cykli/min. Po okresie inkubacji zawiesinę drożdży wirowano (2500xg/10 min, Mini Spin Plus, Eppendorf, Niemcy), przemywano jałowym roztworem soli fizjologicznej (0,85% NaCl), a następnie zawieszano w odpowiednim podłożu tak, aby liczba komórek w każdej hodowli wynosiła ok. 1x10 5 jtk/cm 3. Następnie pobierano po 300 µl tak zaszczepionych podłoży i wprowadzano do mikrostudzienek kasety aparatu Bioscreen C. Mikrohodowle prowadzono w temperaturze 28 C przez 120 godzin z ciągłym wytrząsaniem na poziomie średnim. Wzrost badanych drożdży podczas hodowli oceniano poprzez pomiar zmian gęstości optycznej (OD), który wykonywany był automatycznie co 2 godziny przy długości fali 420-580 nm (filtr szerokopasmowy). Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczono krzywe wzrostu drożdży Candida utilis ATCC 9950, czas trwania fazy adaptacyjnej (t lag ) i logarytmicznej (t log ) oraz wartości minimalne i maksymalne OD w fazie wzrostu logarytmicznego (OD min log i OD max log ) oraz podczas całkowitego trwania hodowli (OD min i OD max ). Ponadto określono również maksymalną szybkość właściwą wzrostu drożdży w fazie logarytmicznej na podstawie wzoru: µ max = (lnod max log lnod min log )/t log, czas generacji (g = ln2/µ max ) oraz całkowity przyrost gęstości optycznej (ΔOD = OD max OD min ) [Bzducha-Wróbel i in., 2014]. Wyniki i dyskusja Analizę zmian gęstości optycznej (OD) w mikrohodowlach aparatu Bioscreen C przeprowadzono w celu szybkiego porównania wzrostu badanego szczepu drożdży paszowych Candida utilis ATCC 9950 w podłożach ze różnicowanym dodatkiem glicerolu i ph środowiska. Uzyskane wyniki pozwoliły wykreślić krzywe wzrostu w poszczególnych podłożach, a następnie umożliwiły wyznaczenie takich parametrów charakteryzujących wzrost drobnoustrojów jak długość fazy adaptacyjnej i logarytmicznej, maksymalna szybkość właściwa wzrostu oraz czas generacji komórek. Uzyskane wyniki zamieszczono w Tabeli 1. Z kolei na Rysunku 1 przedstawiono wykresy słupkowe obrazujące całkowity przyrost gęstości optycznej w podłożach po 120-godzinnej hodowli w aparacie Bioscreen C. 124

Tab. 1. Parametry charakteryzujące wzrost drożdży Candida utilis ATCC 9950 w mikrohodowlach aparatu Bioscreen C (WS - woda sokowa; 2-25% - stężenia glicerolu) Podłoże ph t lag [h] t log [h] µ max [h -1 ] Czas generacji [h] YPD 4,0 12 12 0,069 10,07 5,0 10 20 0,039 17,58 WS 4,0 22 30 0,025 27,86 5,0 20 18 0,034 20,22 WS + 2% 4,0 24 36 0,022 31,49 5,0 18 36 0,021 33,62 WS + 3% 4,0 24 40 0,020 34,79 5,0 24 16 0,029 24,28 WS + 4% 4,0 22 42 0,013 51,93 5,0 22 36 0,014 51,24 WS + 5% 4,0 28 36 0,017 39,85 5,0 28 24 0,022 31,11 WS + 10% 4,0 30 32 0,014 47,90 5,0 44 22 0,025 28,17 WS + 15% 4,0 46 30 0,017 41,02 5,0 26 60 0,012 58,87 WS + 20% 4,0 42 - - - 5,0 38 - - - WS + 25% 4,0 26 - - - 5,0 22 - - - Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że badany szczep drożdży wykazywał wzrost we wszystkich wariantach podłoży hodowlanych. Najwyższe wartości przyrostu OD uzyskano w podłożach z 4% (1,436 przy ph 4,0 i 1,341 przy ph 5,0) i 5% (1,441 i 1,442) dodatkiem glicerolu. Nieznacznie mniejszy przyrost można zaobserwować w podłożach z 2% (1,357 i 1,306) i 3% (1,353 i 1,375) stężeniem tego związku, a także w przypadku 10% dodatku (1,323 i 1,237). Wzrost w tych podłożach był wyższy lub porównywalny do hodowli kontrolnej YPD, gdzie uzyskano przyrost gęstości optycznej wynoszący odpowiednio 1,308 (ph 4,0) oraz 1,227 (ph 5,0). W przypadku podłoża składającego się wyłącznie z ziemniaczanej wody sokowej uzyskano przyrost gęstości optycznej na poziomie 1,199-1,183. Słabszy wzrost drożdży C. utilis w porównaniu do podłoża YPD mógł być spowodowany niższą zawartością cukrów redukujących (1,3%, a w YPD 2%) stanowiących jedyne źródło węgla dla badanego szczepu. 125

1,6 1,4 1,2 1 Przyrost OD 0,8 0,6 0,4 0,2 1,308 1,199 1,227 1,183 1,357 1,306 1,375 1,353 1,436 1,441 1,341 1,442 1,323 1,237 1,227 1,157 0,776 0,626 0,862 0,792 0 YPD WS WS+2 WS+3 WS+4 WS+5 WS+10 WS+15 WS+20 WS+25 Rodzaj podłoża ph 4,0 ph 5,0 Rys. 1. Przyrost gęstości optycznej po 120 godzinach prowadzenia hodowli drożdży paszowych Candida utilis ATCC 9950 w aparacie Bioscreen C (WS - woda sokowa; 2-25 - stężenia glicerolu) Podobny wzrost stwierdzono w podczas hodowli w podłożu z wodą sokową i 15% dodatkiem glicerolu - 1,157 w ph 4,0 oraz 1,227 w ph 5,0. Można zatem przypuszczać, że przy wyższym stężeniu glicerolu (od 15%) w pożywce drożdże nie były zdolne do jego asymilacji i wykorzystywały wyłącznie składniki odbiałczonej ziemniaczanej wody sokowej. Jednocześnie w podłożach z 20 i 25% glicerolem stwierdzono znacznie słabszy wzrost badanych drożdży. Przyrost gęstości optycznej po 120-godzinnej hodowli wyniósł odpowiednio 0,626 i 0,776 w podłożu z 20% dodatkiem oraz 0,792 i 0,862 w 25%. Uzyskane wyniki mogą świadczyć o tym, że glicerol w stężeniach 20 i 25% nie tylko nie był wykorzystywany przez drożdże, ale również znacząco zahamował ich wzrost. Przyczyną tego zjawiska było prawdopodobnie zbyt wysokie ciśnienie osmotyczne środowiska hodowlanego, powodujące zamykanie kanałów w błonie komórkowej drożdży, niezbędnych do prawidłowego pobierania składników odżywczych z podłoża [Bzducha-Wróbel i in., 2014]. Błażejak i in. [2014] wykorzystywali glicerol i ziemniaczaną wodę sokową jako podłoża do hodowli olejogennych drożdży Rhodotorula gracilis. Najwyższy plon biomasy badanych drożdży autorzy uzyskali w podłożu z 5% dodatkiem glicerolu, a wraz ze wzrostem jego stężenia przyrost biomasy drożdży ulegał zmniejszeniu. Badania przeprowadzone przez autorów potwierdzają hamujące działanie wyższych stężeń glicerolu w podłożu hodowlanym na wzrost drożdży. Z kolei Komorowski i Błażejak [2011] prowadzili mikrohodowle drożdzy Candida utilis 126

ATCC 9950 w podłożach mineralnych z glicerolem. Autorzy uzyskali niższe wartości OD przy tym samym stężeniu glicerolu niż w niniejszej pracy. Można zatem stwierdzić, że zastosowanie wyłącznie nieorganicznego źródła azotu, jakim jest siarczan amonu, było niewystarczające dla intensywnego rozwoju drożdży i ograniczało ich wzrost. Związki azotowe obecne w ziemniaczanej wodzie sokowej, jak i występujące w niej substancje wzrostowe oraz składniki mineralne, stanowiły pożądane induktory wzrostu dla badanych drożdży Candida utilis ATCC 9950. Należy również zwrócić uwagę, że kwasowość czynna środowiska nie miała znaczącego wpływu na wzrost badanego szczepu. W podłożu kontrolnym YPD oraz w podłożach z niższym dodatkiem glicerolu zaobserwowano nieznacznie wyższy przyrost w hodowli o ph 4,0 w porównaniu do 5,0. Z kolei w podłożach z wyższym dodatkiem glicerolu (od 15%) wyższy przyrost stwierdzono podczas hodowli o ph 5,0 niż 4,0. Juszczyk i in. [2005] prowadzili hodowlę drożdży Candida utilis ATCC 60 558 w aparacie Bioscreen w podłożach o różnym ph zawierającym 3% glicerolu, 1% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego oraz sole nieorganiczne. Przeprowadzone badania wykazały nieznacznie wyższy wzrost badanego szczepu w podłożach o niższym ph (w zakresie 3,5-4,5) niż wyższym (5,0-6,0). Oprócz przyrostu OD istotne znacznie do scharakteryzowania wzrostu drobnoustrojów w podłożach hodowlanych mają również wybrane parametry kinetyki wzrostu (Tabela 1). Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że najkorzystniejsze warunki do wzrostu drożdże C. utilis miały w podłożach kontrolnych, o czym świadczą najkrótszy czas generacji oraz najwyższa szybkość właściwa wzrostu. Dodatek glicerolu do podłoża spowodował znaczące wydłużenie czasu trwania fazy logarytmicznej, co związane było ze zmniejszeniem szybkości właściwej wzrostu drożdży w tych podłożach oraz wydłużeniem czasu generacji. Na taką sytuację mogła mieć wpływ konieczność dostosowania metabolizmu badanych drożdży do dodatkowego źródła węgla, jakim był glicerol. Jednocześnie stwierdzono wydłużanie się czasu trwania zarówno fazy adaptacyjnej jak i logarytmicznej wraz ze wzrostem stężenia glicerolu. W przypadku podłoży doświadczalnych z 20 i 25% glicerolem faza logarytmiczna w dalszym ciągu trwała, aż do końca prowadzenia hodowli (powyżej 120 godzin), co uniemożliwiło określenie czasu generacji i maksymalnej szybkości właściwej wzrostu drożdży. Zarówno w podłożu z 4 jak i 5% dodatkiem glicerolu stwierdzono podobny wzrost pod względem całkowitego przyrostu OD. Jednocześnie były to najwyższe wartości uzyskane spośród wszystkich wariantów hodowli. Należy jednak zwrócić uwagę, że kinetyka wzrostu drożdży Candida utilis ATCC 9950 w tym podłożach różni się pod względem pozostałych parametrów. Czas generacji w podłożu z 4% glicerolem i ph 5,0 wyniósł aż 51 godzin, z kolei w podłożu z 5% dodatkiem tego związku (przy tym samym ph) zaledwie 31 godzin. Również maksymalna szybkość właściwa wzrostu drożdży w podłożu z 5% stężeniem glicerolu była 127

wyższa (0,022 h -1 ) niż w hodowli z 4% jego dodatkiem (0,014 h -1 ). Ponadto w podłożu 5% korzystniejsze parametry uzyskano podczas hodowli przy ph 5,0 niż 4,0. Można zatem uznać, że najlepsze warunki do hodowli badanego szczepu drożdży C. utilis stanowiło podłoże o ph 5,0, z ziemniaczaną wodą sokową suplementowaną 5% dodatkiem glicerolu. Wnioski 1. Odbiałczona ziemniaczana woda sokowa i glicerol mogą być wykorzystywane jako źródło węgla i azotu do produkcji biomasy drożdży paszowych Candida utilis ATCC 9950. 2. Najkorzystniejsze warunki do wzrostu badanych drożdży stwierdzono w przypadku podłoża składającego się z ziemniaczanej wody sokowej wzbogaconej 5% dodatkiem glicerolu o ph 5,0. 3. Badania pokazały, że wyższe stężenia glicerolu (powyżej 15%) działają hamująco na wzrost drożdży Candida utilis. Jednocześnie stwierdzono, że wartość ph środowiska (4,0 i 5,0) nie miała znaczącego wpływu na wzrost tego szczepu. Literatura [1] Amaral P.F.F., Ferreira T.F., Fontes G.C., Coelho M.A.Z.: Glycerol valorization: New biotechnological routes. Food and Bioproducts Processing, 2009, 87, 179-186. [2] Błażejak S.: Studia nad pozyskiwaniem biopleksów z biomasy drożdży Candida utilis wzbogaconych magnezem. Wydawnictwo SGGW, Warszawa 2006. [3] Błażejak S., Duszkiewicz-Reinhard W.: Yeast cell biomass as a potential source of magnesium bioplexes a review. Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 2004, 13(54), 223-232. [4] Błażejak S., Gientka I., Bzducha-Wróbel A., Stasiak-Różańska L., Maszewska M.: Ocena zdolności biosyntezy tłuszczu przez drożdże Rhodotorula gracilis w podłożach zawierających ziemniaczaną odpadową wodę sokową wzbogaconą glicerolem. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 2014, 576, 3-12. [5] Bzducha-Wróbel A., Kieliszek M., Błażejak S.: Chemical composition of the cell wall of probiotic and brewer s yeast in response to cultivation medium with glycerol as a carbon source. European Food Research and Technology, 2013, 237, 489 499. [6] Bzducha-Wróbel A., Błażejak S., Molenda M., Reczek L.: Biosynthesis of β(1,3)/(1,6)-glucans of cell Wall of the yeast Candida utilis ATCC 9950 strains in the culture media supplemented with deproteinated potato juice 128

water and glycerol. European Food Research and Technology, 2014, doi: 10.1007/s00217-014-2406-6. [7] Internet 1: Microorganisms & Microbial-Derived Ingredients Used in Food (Partial List). Food and Drug Administration, http://www.fda.gov/ Food/IngredientsPackagingLabeling/GRAS/MicroorganismsMicrobialDerived Ingredients/default.htm (22 lutego 2015 roku). [8] Jay J.M.: Modern food microbiology. Chapman & Hall, London 1992. [9] Juszczyk P., Musiał I., Rymowicz W.: Dobór szczepów drożdży do produkcji biomasy z glicerolu odpadowego. Acta Scientiarum Polonorum, Biotechnologia, 2005, 4 (1-2), 65-76. [10] Kieliszek M., Błażejak S., Jędrzejczak R.: Wiązanie selenu przez drożdże paszowe Candida utilis ATCC 9950. Bromatologia i Chemia Toksykologiczna, 2012, 3, 628-633. [11] Komorowski K., Blażejak S.: Ocena zdolności biosyntezy tłuszczu przez wybrane drożdże. Przemysł Spożywczy, 2011, 65 (9), 48-51. [12] Lipińska E., Błażejak S., Markowski K.: Koncepcja wykorzystania gliceryny odpadowej z produkcji biodiesla jako źródła węgla dla drożdży Candida utilis w kulturze mieszanej z bakteriami octowymi. Acta Scientiarum Polonorum, Biotechnologia, 2010, 9(3), 3-14. [13] Liu B., Song J., Li Y., Niu J., Wang Z., Yang Q.: Towards Industrially Feasible Treatment of Potato Starch Processing Waste by Mixed Cultures. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 171, 1001-1010. [14] Miedzianka J., Pęksa A., Smolarczyk E.: Zastosowanie przemysłowego soku ziemniaczanego do otrzymywania preparatów białka arylowanego. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 2010, 557, 261-273. [15] Munawar R.A., Irfan M., Nadeem M., Syed Q.A., Siddique Z.H.: Biosynthesis of single cel biomass of Candida utilis by submerged fermentation. Pakistan Journal of Science, 2010, 1(62), 1-5. [16] Muniraj I.K., Xiao L., Hu Z., Zhan X., Shi J.: Microbial lipid production from potato processing wastewater using oleaginous filamentous fungi Aspergillus oryzae. Water Research, 2013, 47, 3477-3483. [17] Musiał I., Rymowicz W., Kita A.: Produkcja biomasy drożdży Yarrowia lipolytica z tłuszczów odpadowych po smażeniu produktów przekąskowych. Acta Scientiarum Polonorum, Biotechnologia, 2004, 3 (1-2), 75-83. [18] Nowak J., Górna B., Nowak W.: Wykorzystanie grzybów strzępkowych do biodegradacji ścieków z przemysłu ziemniaczanego z jednoczesną produkcją biomasy pleśniowej na cele paszowe. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 2013, 6 (91), 191-203. [19] Rywińska A., Juszczyk P., Wojtatowicz M., Robak M., Lazar Z., Tomaszewska L., Rymowicz W.: Glycerol as a promising substrate for Yarrowia lipolytica biotechnological applications. Biomass and Bioenergy, 2013, 48, 148-166. 129

[20] Taccari M., Canonico L., Comitini F., Mannazzu I., Ciani M.: Screening of yeasts for growth on crude glycerol and optimization of biomass production. Bioresource Technology, 2012, 110, 488-495. [21] Walker G.M.: Yeast - Physiology and Biotechnology. Wiley, New York, 1998. 130