KATEDRA BIOCHEMII Wydział Biologii i Ochrony Środowiska ANALIZA TŁUSZCZÓW WŁAŚCIWYCH CZ I ĆWICZENIE 7 ZADANIE 1 Ze względu na różnorodność kwasów tłuszczowych oraz zmienny procentowy udział w budowie cząsteczki, charakterystyka tłuszczów jest dosyć trudna. W związku z tym właściwości tłuszczów określa się za pomocą umownych wskaźników chemicznych, będących wypadkową właściwości poszczególnych składników. Wskaźniki te nazywamy liczbami tłuszczowymi. Liczba zmydlania (podaje średnią masę cząsteczkową kwasów tłuszczowych), liczba jodowa (wskazuje na ilość wiązań nienasyconych). A) OZNACZANIE LICZBY ZMYDLANIA Liczba zmydlania (LZ) jest to liczba miligramów KOH potrzebna do zmydlenia 1g tłuszczu i zobojętnienia zawartych w nim wolnych kwasów tłuszczowych. Znajomość liczby zmydlania pozwala wyznaczyć średnią masę cząsteczkową kwasów tłuszczowych wchodzących w skład danego tłuszczu. Tłuszcze zawierające stosunkowo dużą ilość estrów kwasów o mniejszej masie cząsteczkowej jak kwas masłowy, kaprylowy (masło, olej kokosowy) mają dużą liczbę zmydlenia. Tłuszcze zawierające estry długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (olej rzepakowy, słonecznikowy) mają małe liczby zmydlania (patrz Tabela 2). WYKONANIE: 1. Do kolby stożkowej o pojemności 200 300 ml odważyć od 1 g badanego tłuszczu (olej, masło) z dokładnością do 0.01g. Równolegle wykonać próbę kontrolną nie zawierającą tłuszczu. Próby tej nie ogrzewać! 2. Do wszystkich kolb dodać po 10 ml 0,5 M roztworu KOH i 50 ml etanolu. Do kolb włożyć lejek szklany (chłodnica). 3. Zwartość kolb ogrzewać przez 20-30 minut we wrzącej łaźni wodnej. Dodać 3 4 krople fenoloftaleiny do uzyskania różowego zabarwienia. 4. Nadmiar KOH miareczkować 0,5 M roztworem HCl do odbarwienia roztworu. 5. Obliczyć wartość liczby zmydlania (LZ) ze wzoru: ( a b) LZ 28,055 m mgkoh g Gdzie: a- ilość 0,5 M roztworu HCL zużyta na miareczkowanie próby kontrolnej [ml] b - ilość 0,5 M roztworu HCL zużyta na miareczkowanie próby badanej [ml] m - masa próbki [g]. 1
7. Zinterpretować wyniki (patrz Tabela 2). 8. Na podstawie wielkości liczby zmydlania (LZ) oblicz średni ciężar cząsteczkowy M śr kwasu tłuszczowego ze wzoru: 56110 M śr LZ Gdzie: LZ liczba zmydlania 56110 - gramorównoważnik KOH [mg] Tabela 1 Oznaczanie liczby zmydlania (LZ) Rodzaj tłuszczu Masa próbki, g a, ml HCl b, ml HCl LZ, mg KOH/g tłuszczu M śr g/mol 9. Zinterpretować wyniki. 10. Obliczyć liczbę zmydlania tripalmitynianu glicerolu (M KOH = 56 g/mol, M tłuszczu = 806 g/mol). Napisać równanie. Tabela 2 Liczba zmydlania (LZ) i liczba jodowa (LJ) wybranych tłuszczy Rodzaj tłuszczu Liczba zmydlania Liczba jodowa Tłuszcze zwierzęce Smalec wieprzowy 194-203 46-70 Masło 209-240 26-38 Tran 175-197 150-180 Oleje Oliwa 187-196 80-88 Arachidowy 188-197 83-100 Sojowy 190-194 115-137 Rzepakowy 168-179 94-106 Słonecznikowy 188-194 120-135 Lniany 187-195 170-200 2
B) OZNACZANIE LICZBY JODOWEJ Liczba jodowa (LJ) jest to ilość gramów jodu, która zostaje przyłączona do 100 g tłuszczu. Metoda polega na wykorzystaniu właściwości związków nienasyconych do przyłączania atomów chlorowca w miejscu podwójnych wiązań. Tłuszcze o dużej zawartości estrów nienasyconych kwasów tłuszczowych np. oleje roślinne charakteryzują się dużą liczbą jodową (olej rzepakowy, słonecznikowy). Tłuszcze stałe o małej zawartości nienasyconych wiązań mają mała liczbę jodową (masło, smalec) (patrz Tabela 2). W metodzie Hanusa IBr (jodobromek) ulega addycji do wiązań podwójnych w tłuszczu. Do reakcji używa się nadmiaru IBr. Nieprzereagowany IBr w reakcji z KI daje I 2. IBr + KI I 2 + KBr Wydziela się molowo tyle I 2, ile pozostało nieprzereagowanego IBr. Wydzielony I 2 miareczkuje się tiosiarczanem sodu (Na 2 S 2 O 3 ). Jest to reakcja utlenienia i redukcji. Wskaźnikiem w tej reakcji jest skrobia, która z I 2 daje granatowe zabarwienie. Zanik tego zabarwienia świadczy o zakończeniu reakcji. IBr + KI I 2 + KBr I 2 + 2 S 2 O 3 2-2 I - + S 4 O 6 2- WYKONANIE: 1. Do suchej kolby stożkowej o objętości 250 ml ze szlifem odważyć na wadze analitycznej 0,7 g jednego z tłuszczów (oleju, masła) z dokładnością do 0.01g. Równolegle wykonać próbę kontrolną nie zawierającą tłuszczu. 2. Dodać10 ml chloroformu (pod dygestorium!!) i dokładnie rozpuścić naważkę. 3. Dodać15 ml odczynnika Hanusa, kolbę zamknąć korkiem i dokładnie wymieszać jej zawartość. 4. Kolbę pozostawić w ciemnym miejscu na 30 minut, wstrząsając co pewien czas. 5. Dodać 15 ml 10% roztworu KI (zmywając nim szyjkę kolby i korek), dokładnie wymieszać. 6. Dodać 50 ml wody destylowanej. 7. Wydzielony jod natychmiast miareczkować 0,1 M roztworem Na 2 S 2 O 3 do uzyskania jasno pomarańczowego zabarwienia. 8. Dodać około 2 ml roztworu skrobi (do zabarwienia niebieskiego). 9. Miareczkować dalej 0,1 M roztworem Na 2 S 2 O 3 do odbarwienia roztworu. 10. Wartości wpisać do Tabeli 3. 11. Obliczyć wartość liczby jodowej (LJ) wg wzoru: ( a b) LJ 1,269 m [g I 2 /100 g tłuszczu] Gdzie: a - ilość 0,1 M roztworu Na 2 S 2 O 3 zużytego na miareczkowanie próby kontrolnej [ml] 3
b - ilość 0,1 M roztworu Na 2 S 2 O 3 zużytego na miareczkowanie próby badanej [ml] 1,269 - współczynnik przeliczeniowy m- masa próbki [g]. Tabela 3 Oznaczanie liczby jodowej (LJ) Rodzaj tłuszczu Masa próbki, g a, ml Na 2 S 2 O 3 b, ml Na 2 S 2 O 3 Liczba jodowa (LJ) g I 2 /100 g tłuszczu 1. Zinterpretować wyniki (patrz tabela 2). 2. Oblicz liczbę jodową dla trilinolianu glicerolu (Masy molowe: MI 2 = 254g/mol; M tłuszczu = 878g/mol). Napisać równanie. ZADANIE 2 OCENA JAKOŚCI TŁUSZCZU Tłuszcze są produktami nietrwałymi, ulegają pod wpływem działaniem światła, powietrza, wilgoci, temperatury, drobnoustrojów, zmianom chemicznym, określanych jako jełczenie. Jełczenie powoduje obniżenie wartości odżywczej tłuszczu, między innymi poprzez zniszczenie NNKT i obniżenie zawartości witamin A i E. Najważniejszymi procesami chemicznymi zachodzącymi podczas jełczenia są hydroliza i utlenianie. Hydroliza polega na rozpadzie tłuszczów pod wpływem przegrzanej pary wodnej na wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. Tłuszcz w tym okresie jełczenia charakteryzuje się wysoką kwasowością. Utlenianie tłuszczu zachodzi pod wpływem tlenu z powietrza, światła i temperatury. Podczas utleniania tłuszczów w I etapie powstają nadtlenki i hydronadtlenki, które są nietrwałe i szybko ulegają przemianom do aldehydów, ketonów, związków epoksydowych, wolnych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i nadtlenków tych kwasów. Zależnie od charakteru utworzonych związków rozróżnia się jełczenie aldehydowe lub ketonowe. Aldehydowemu ulegają kwasy tłuszczowe nienasycone, a ketonowemu nasycone. W celu określenia stopnia jełczenia tłuszczu wyznacza się liczby tłuszczowe takie jak liczba kwasowa (określa stopień hydrolizy) oraz liczba nadtlenowa (określa stopień utlenienia). 4
A) OZNACZANIE LICZBY KWASOWEJ Liczba kwasowa (LK) jest miarą zawartości wolnych kwasów tłuszczowych (KT), czyli określa stopień hydrolizy tłuszczu. Wolne kwasy tłuszczowe powstają na skutek rozrywania wiązań estrowych. Jest to ilość mg KOH potrzebna do zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych zawartych w 1 g badanego tłuszczu. Świeże tłuszcze charakteryzują się niskimi liczbami kwasowymi. Zjełczałe, częściowo zhydrolizowane, cechują się wysoką zawartością wolnych kwasów tłuszczowych. Stąd oznaczenie tej liczby wykorzystuje się przy ocenie wartości odżywczej tłuszczu. Liczba kwasowa w rafinowanych olejach roślinnych (wg PN-A-86908) powinna być mniejsza od 0,3; masła 2,0; margaryny 1,5; a smalcu 1,0. WYKONANIE: Oznaczenie wykonać dla dwóch rodzajów tłuszczów, świeżego i starego (olej). 1. Odważyć 5 g tłuszczu z dokładnością do 0.01g i umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 200 ml. 2. Do kolby dodać 10 ml mieszaniny (etanol benzen1:1). Pod dygestorium!! 3. Roztwór ostudzić i szybko miareczkować 0,01 N roztworem KOH wobec fenoloftaleiny, do uzyskania lekko różowego zabarwienia. 4. Wykonać próbę kontrolną. W tym celu do kolby dodać 10 ml mieszaniny etanol benzen 1:1 (pod dygestorium!!) miareczkować roztwór 0,01 N roztworem KOH wobec fenoloftaleiny, do uzyskania lekko różowego zabarwienia. 5. Wartości wpisać do Tabeli 4. 6. Obliczyć wartości liczb kwasowych (LK) wg wzoru: ( a b) LK 0,5611 m mgkoh g Gdzie: 0,5611 liczba mg KOH zawarta w 1 ml 0,1 N roztworu KOH a- ilość KOH zużyta na miareczkowanie próby badanej [ml] b - ilość KOH zużyta na miareczkowanie próby kontrolnej [ml] m - masa próbki [g]. 5
Tabela 4 Oznaczanie liczby kwasowej (LK) Rodzaj tłuszczu Masa naważki, g a, ml KOH b, ml KOH Liczba kwasowa (LK) mg KOH/g tłuszczu Porównać i zinterpretować wyniki. B) OZNACZANIE LICZBY NADTLENKOWEJ Liczba nadtlenkowa (LOO) informuje o zawartości w próbce pierwotnych produktów utlenienia lipidów, tj. wodoronadtlenków. Liczba nadtlenkowa jest to ilość ml mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu potrzebna do miareczkowania jodu wydzielonego z roztworu jodku potasu w wyniku działania nadtlenków zawartych w 1 kg tłuszczu. Ilość nadtlenków w próbce, która utlenia jodek potasu w warunkach oznaczenia, wyraża się jako miliekwiwalenty aktywnego tlenu zawarte w kilogramie tłuszczu [meq O/kg tłuszczu] w chwili pomiaru. 3 O 2-2 + 2 I - + 8 H+ O 2 + I 2 + 4 H 2 O I 2 + 2 S 2 O 3-2 2 I - + S 4 O 6-2 Liczba nadtlenkowa wyznaczona dla olejów roślinnych powinna być równa lub niższa niż 5,0; dla smalcu 3,0; margaryny 4,0; masła 4,5. WYKONANIE: 1. Odważyć 5 g tłuszczu z dokładnością do 0.01g i przenieść do kolby stożkowej ze szlifem o objętości 200 ml. Równolegle wykonać próbę kontrolną nie zawierającą tłuszczu. 2. Do kolby dodać 5 ml chloroformu (pod dygestorium!!) i mieszać do całkowitego rozpuszczenia tłuszczu, następnie dodać 7,5 ml lodowatego kwasu octowego i 0,5ml nasyconego roztworu KI, po czym kolbę szybko zamknąć korkiem na szlif. 3. Zawartość kolby mieszać przez 1 minutę, a następnie odstawić w ciemne miejsce na 5 minut. 4. Po tym czasie do kolby dodać 37,5 ml wody destylowanej opłukując starannie korek, a następnie dodać kilka kropli roztworu skrobi do momentu pojawienia się ciemnogranatowego zabarwienia. Wymieszać. 5. Zawartość kolby natychmiast miareczkować 0.002 N roztworem tiosiarczanu sodu do uzyskania odbarwienia (trwającego co najmniej pół minuty). 6. Wartości wpisać do Tabeli 5. 6
7. Liczbę nadtlenkową (LOO), wyrażoną w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kg tłuszczu, obliczyć wg wzoru: ( a b).1000 LOO c [milirównoważniki aktywnego O 2 /kg] m Gdzie: a - ilość 0,002 N roztworu Na 2 S 2 O 3 zużytego na miareczkowanie próby badanej [ml] b - ilość 0,002 N roztworu Na 2 S 2 O 3 zużytego na miareczkowanie próby kontrolnej [ml] c- stężenie molowe tiosiarczanu sodu [mol/l] 1000 - współczynnik przeliczeniowy, liczby ml zużytego Na 2 S 2 O 3 na milirównoważniki tlenu w 1 kg tłuszczu m - masa próbki [g] Tabela 5 Oznaczanie liczby nadtlenkowej (LOO) Rodzaj tłuszczu Masa naważki, g a, ml Na 2 S 2 O 3 b, ml Na 2 S 2 O 3 Liczba nadtlenkowa (LOO) meq O/kg tłuszczu Porównać i zinterpretować wyniki. B) OBLICZANIE LICZBY ESTROWEJ Liczba estrowa (LE) stanowi różnicę wartości liczby kwasowej (LK) i liczby zmydlania (LZ). Oznacza ona liczbę mg KOH potrzebną do zobojętnienia kwasów tłuszczowych związanych estrowo, a uwolnionych w procesie zmydlania 1 g tłuszczu. W tłuszczach obojętnych, tj. nie zawierających wolnych kwasów tłuszczowych, LE równa jest LZ. Oblicz liczbę estrową (LE) badanych tłuszczy wg wzoru: LE= LZ LK Porównać i zinterpretować wyniki. ZAKRES MATERIAŁU 7
Powtórzenie wiadomości o kwasach tłuszczowych i tłuszczach. Hydroliza enzymatyczna (lipazy) i zmydlanie tłuszczów (reakcje). Aktywacja kwasów tłuszczowych - schemat przemian, enzymy. Transport kwasów tłuszczowych przez błony- rola acylokarnityny. β-oksydacja kwasów tłuszczowych - schemat przemian, enzymy. Bilans energetyczny β -oksydacji kwasu palmitynowego i stearynowego. Literatura 1. Biochemia, J. M. Berg i wsp., PWN, Warszawa 2007 2. Biochemia Harpera, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 2006 3. Cytobiochemia, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 2002 4. Biochemia kręgowców, W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa 2005 5. Zarys biochemii, P. Karlson, PWN, Warszawa 1987 6. Ćwiczenia z biochemii, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 2005 7. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J., ART, 1997 8. Ćwiczenia z biochemii, A. Łogin i in., ART, Olsztyn, 1997 8