Mikrobiologia jamy ustnej treść ćwiczeń Ćwiczenie 1. Mikrobiologia ogólna - Budowa komórki bakteryjnej. Metody barwienia preparatów bakteryjnych. Pożywki bakteryjne. Techniki posiewów. Uzyskiwanie czystej hodowli. Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) kształty i budowa komórek bakteryjnych (elementy stałe i dodatkowe), metody barwienia preparatów bakteryjnych (proste i złożone, pozytywne i negatywne, pozytywnonegatywne), rodzaje mikroskopów używanych w bakteriologii i ich zastosowanie. Fizjologia bakterii, postacie i skład pożywek bakteryjnych (płynne, półpłynne i stałe, proste i wzbogacone, wybiórcze, diagnostyczne i wybiórczodiagnostyczne), techniki wykonywania posiewów, optymalne warunki dla hodowania bakterii in vitro (temperatura, środowisko gazowe, ph, ciśnienie osmotyczne), fazy wzrostu hodowli bakteryjnej, metoda uzyskiwania czystej hodowli. 1. Demonstracja preparatów bakteryjnych barwionych metodą negatywną ukazujących kształty komórek bakteryjnych. a/ Komórki cylindryczne. b/ Komórki kuliste. 2. Demonstracja preparatów bakteryjnych ukazujących obecność otoczki. a/ Preparat barwiony metodą pozytywno-negatywną. b/ Preparat z tkanki zakażonej bakteriami posiadającymi otoczki. 3. Demonstracja preparatów bakteryjnych ukazujących obecność przetrwalników. a/ Preparat barwiony metodą Grama. b/ Preparat barwiony zielenią malachitową. 4. Demonstracja preparatu bakteryjnego ukazującego rzęski. 5. Barwienie preparatów bakteryjnych metodą Grama. a/ Omówienie i demonstracja wykonywania preparatów bakteryjnych z hodowli na pożywce płynnej i stałej. b/ Omówienie i demonstracja barwienia preparatu bakteryjnego metodą Grama. c/ Omówienie i demonstracja pracy z mikroskopem świetlnym przy oglądaniu preparatów bakteryjnych.
6. Demonstracja podstawowych pożywek bakteryjnych. a/ Proste - woda peptonowa, bulion, agar zwykły. b/ Wzbogacone - bulion z glukozą, agar z krwią, pożywka Loefflera, pożywka Loewensteina-Jensena. 7. Demonstracja wzrostu bakterii na pożywkach. a/ Wzrost bakterii na pożywkach płynnych (kożuszek, zmętnienie, osad). b/ Wzrost bakterii na pożywce stałej (trzy różne rodzaje kolonii). c/ Wzrost szczepów barwnikotwórczych (zabarwione kolonie, zabarwiona pożywka wokół kolonii). Do wykonania 1. Przerysowanie preparatów demonstracyjnych. 2. Wykonanie preparatu bakteryjnego z wybranej kolonii, zabarwienie go metodą Grama i przerysowanie. 3. Posiew redukcyjny mieszanej hodowli płynnej na pożywkę agarową.
Ćwiczenie 2. Mikrobiologia ogólna Występowanie bakterii w środowisku człowieka i w jego organizmie. Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na bakterie. Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) Występowanie bakterii w środowisku człowieka (rezerwuar zarazka, drogi jego rozprzestrzeniania się, źródło zakażenia). Występowanie bakterii w organizmie człowieka (stała i przejściowa flora bakteryjna, nosicielstwo bakterii chorobotwórczych). Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na bakterie. Kontrola bakteriologiczna środowiska człowieka (sanityzacja, antyseptyka, aseptyka, odkażanie, wyjaławianie). 1. Bakterie w środowisku i w organizmie człowieka. a/ Występowanie bakterii w powietrzu badanie metodą sedymentacji na agarze z krwią przez 30 minut. b/ Występowanie bakterii na powierzchni stołu badanie przy użyciu płytki kontaktowej (agar z krwią). c/ Występowanie bakterii na odzieży badanie metodą odciskową na agarze z krwią powierzchni fartucha. d/ Występowanie bakterii na powierzchni skóry odciśnięcie opuszki palca na agarze z krwią przed umyciem rąk, po ich normalnym umyciu oraz po przetarciu preparatem odkażającym, a także pobranie wymazu z powierzchni dłoni i jego posianie na agar z krwią, Coccosel Agar i pożywkę McConkeya. 2. Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na bakterie. a/ Wpływ temperatury posiew hodowli płynnej gronkowca złocistego i laseczki siennej na pożywkę agarową przed i po 10 minutach gotowania. b/ Wpływ promieniowania UV naświetlanie przez 10 minut częściowo osłoniętej papierem hodowli pałeczki okrężnicy na płytce agarowej. c/ Wpływ preparatu odkażającego posiew na płytkę agarową hodowli pałeczki okrężnicy na pożywce płynnej przed i po 10 minutach działania na nią 5% roztworu fenolu. d/ Demonstracja preparatu SPORAL stosowanego do sprawdzania skuteczności wyjaławiania w autoklawie. Do wykonania 1. Wykonanie i przerysowanie preparatu barwionego metodą Grama z odcisku na szkiełku podstawowym własnego języka.
Ćwiczenie 3. Mikrobiologia ogólna Identyfikowanie bakterii. Antybiotyki i chemioterapeutyki. Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) Metody identyfikowania bakterii na podstawie ich cech biochemicznych, budowy antygenowej i budowy DNA. Charakterystyka, mechanizm i zakres działania na komórkę bakteryjną antybiotyków i chemioterapeutyków. Mechanizm powstawania i przenoszenia oporności na antybiotyki i chemioterapeutyki u bakterii (oporność naturalna i nabyta, przenoszenia oporności pionowe i poziome). Metody oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki (najmniejsze stężenie hamujące MIC, najmniejsze stężenia bójcze MBC). 1. Identyfikowanie bakterii na podstawie ich cech biochemicznych. a/ Demonstracja pożywek diagnostycznych i zestawów testów biochemicznych wykorzystywanych do identyfikowania bakterii (testy API). b/ Określanie właściwości hemolitycznych bakterii hemoliza typu alfa, beta i gamma. 2. Demonstracja wykonania antybiogramu metodą krążkowo-dyfuzyjną. 3. Demonstracja antybiogramu wykonanego metodą krążkowo-dyfuzyjną. 4. Demonstracja ustalania najmniejszego stężenia hamującego antybiotyku (MIC) przy zastosowaniu E-testu. 5. Demonstracja działania na bakterie dwóch antybiotyków synergizm i antagonizm. 6. Demonstracja metody wykrywania wytwarzania beta-laktamaz przez pałeczki Gram-ujemne. 7. Demonstracja metody wykrywanie szczepów gronkowca złocistego opornych na metycylinę (MRSA). Do wykonania 1. Odczytanie i opisanie wyników doświadczeń wykonanych na poprzednim ćwiczeniu. 2. Wykonanie i przerysowanie preparatu barwionego metodą Grama z wybranej kolonii z posiewów wymazu z jamy ustnej, płytki kontaktowej, płytki sedymentacyjnej, odcisku opuszki palca lub odcisku odzieży.
3. Ocena mikrobiologicznej czystości powietrza: x = liczba bakterii w 1 m 3 powietrza = a x 10000 p x t x 0,2 a = liczba kolonii na płytce (średnia arytmetyczna z co najmniej 5 płytek) p = powierzchnia płytki (πr 2, π = 3,14) t = czas ekspozycji (30) 0,2 = stała Klasa czystości wg normy MZiOS: I do 70 komórek/m 3 II do 300 komórek/m 3 III do 700 komórek/m 3 4. Odczytanie, zapisanie i interpretacja demonstracyjnych antybiogramów. Ćwiczenie 4. Seminarium z mikrobiologii ogólnej. Kolokwium z mikrobiologii ogólnej. Na kolokwium obowiązuje znajomość materiału dotyczącego mikrobiologii ogólnej z pierwszych trzech ćwiczeń oraz z wykładów i podręczników.
Ćwiczenie 5. Mikrobiologia jamy ustnej - bakterie wywołujące stany chorobowe w obrębie jamy ustnej. Ziarenkowce Gram-dodatnie (rodzaj Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus). Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) Rodzaj Staphylococcus, Streptococcus i Enterococcus systematyka, rezerwuar zarazka, źródła i drogi zakażenia, budowa i układ komórek, mechanizmy chorobotwórczości, chorobotwórczość, metody identyfikacji. 1. Demonstracja wzrostu Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis w pożywce płynnej i na agarze z krwią. 2. Demonstracja wzrostu Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis na pożywce wybiórczo-diagnostycznej Chapmana. 3. Demonstracja identyfikacji Staphylococcus aureus metodą aglutynacji lateksowej. 4. Demonstracja identyfikacji szczepu gronkowca koagulazo-ujemnego za pomocą cech biochemicznych (zestaw API STAPH). 5. Demonstracja preparatu Staphylococcus aureus w ropie. 6. Rodzaj Streptococcus a/ Demonstracja wzrostu Streptococcus pyogenes w bulionie i na agarze z krwią z krążkiem zawierającym bacytracynę. b/ Demonstracja wzrostu Streptococcus pneumoniae i Streptococcus mitis na agarze z krwią z krążkami zawierającymi optochinę. c/ Demonstracja preparatu Streptococcus pyogenes we krwi. d/ Demonstracja preparatu Streptococcus pneumoniae. e/ Demonstracja identyfikacji szczepu paciorkowca za pomocą cech biochemicznych (zestaw API STREP). 7. Rodzaj Enterococcus a/ Demonstracja wzrostu Enterococcus faecalis na pożywce z żółcią i eskuliną. b/ Demonstracja preparatu Enterococcus faecalis. Do wykonania 1. Przerysowanie preparatów demonstracyjnych. 2. Odczytanie wyników testów biochemicznych w systemie API STAPH i identyfikacja gatunkowa zarazków. 3. Wykonanie preparatu barwionego metodą Grama z hodowli płynnej Streptococcus pyogenes.
Ćwiczenie 6. Mikrobiologia jamy ustnej - bakterie wywołujące stany chorobowe w obrębie jamy ustnej. Pałeczki Gram-dodatnie (rodzaj Corynebacterium, Mycobacterium, Actinomyces), ziarenkowce Gram-ujemne (rodzaj Neisseria), krętki (rodzaj Treponema) Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) Rodzaj Corynebacterium, Mycobacterium, Actinomyces, Neisseria, Treponema systematyka, rezerwuar zarazka, źródła i drogi zakażenia, budowa i układ komórek, mechanizmy chorobotwórczości, metody identyfikacji, profilaktyka. 1. Rodzaj Corynebacterium a/ Demonstracja wzrostu Corynebacterium diphtheriae na pożywce Loefflera. b/ Demonstracja metody określania wytwarzania toksyny błoniczej przez Corynebacterium diphtheriae (Test Eleka). c/ Demonstracja preparatów Corynebacterium diphtheriae i Corynebacterium pseudodiphtheriticum barwionych metodą Neissera i metodą Grama. 2. Rodzaj Mycobacterium a/ Demonstracja wzrostu różnych gatunków prątków na pożywce Loewensteina-Jensena. b/ Demonstracja testów biochemicznych stosowanych w identyfikacji prątków test Bogena i test niacynowy. c/ Demonstracja preparatu Mycobacterium tuberculosis w tkance barwionego metodą Ziehla-Neelsena. 3. Rodzaj Actinomyces a/ Demonstracja preparatu Actinomyces israelii. 4. Rodzaj Neisseria a/ Demonstracja preparatu Neisseria gonorrhoeae. c/ Demonstracja wzrostu Neisseria meningitidis na agarze z krwią. 5. Krętki a/ Demonstracja preparatu Treponema pallidum w zakażonej tkance.
Do wykonania 1. Przerysowanie preparatów demonstracyjnych Corynebacterium diphtheriae barwionego metodą Neissera, Mycobacterium tuberculosis w tkance, Actinomyces israelii i Neisseria gonorrhoeae.
Ćwiczenie 7. Mikrobiologia jamy ustnej. Fizjologiczna flora bakteryjna jamy ustnej. Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) Najważniejsze rodzaje bakterii występujących w jamie ustnej człowieka i stanowiących jej florę fizjologiczną (Gram-dodatnie i Gram-ujemne, tlenowe, względnie beztlenowe i beztlenowe). Ochronna rola fizjologicznej flory bakteryjnej.. Do wykonania 1. Posiew 0,1 ml różnych rozcieńczeń śliny na pożywki wybiórcze w celu oznaczenia liczebności w ślinie paciorkowców (agar z krwią i azydkiem), gronkowców (agar SM), enterokoków (agar Coccosel), pałeczek kwasu mlekowego (agar Rogosy) oraz bakterii wytwarzających zewnątrzkomórkowe wielocukry (agar z sacharozą). 2. Wykonanie preparatu z własnej śliny barwionego metodą Grama i przerysowanie.
Ćwiczenie 8. Mikrobiologia jamy ustnej. Bakteriologia próchnicy zębów i chorób przyzębia. Część teoretyczna (obowiązujący zakres materiału) Osłonka nabyta i płytka nazębna; mechanizm powstawania, skład, patologiczne oddziaływanie na twarde tkanki zęba i tkanki przyzębia. Rodzaje bakterii bytujących w szczelinach dziąsłowych i będących czynnikiem etiologicznym różnych postaci stanów zapalnych dziąseł i przyzębia. Mechanizmy chorobotwórczości bakterii wywołujących stany zapalne dziąseł i przyzębia. 1. Oznaczenie ph śliny. 2. Uwidocznienie płytki nazębnej. 3. Demonstracja bakterii będących czynnikiem etiologicznym próchnicy zębów barwionych metodą Grama. a/ Streptococcus sp. b/ Lactobacillus sp. c/ Actinomyces sp. 4. Demonstracja preparatów niektórych bakterii będących czynnikiem etiologicznym stanów zapalnych dziąseł i przyzębia: a/ Prevotella sp. b/ Porphyromonas sp. c/ Fusobacterium sp. i Treponema vincentii (martwiczo-wrzodziejące zapalenie dziąseł). Do wykonania 1. Odczytanie wyników posiewów wykonanych na poprzednim ćwiczeniu i ustalenie liczebności bakterii w 1 ml śliny wg wzoru: X = liczba kolonii na płytce x odwrotność rozcieńczenia x 10 2. Po uwidocznieniu płytki nazębnej zdjąć ją z powierzchni zęba, zawiesić w kropli wody, zabarwić metodą Grama i przerysować.
Ćwiczenie 9. Seminarium z mikrobiologii jamy ustnej. Kolokwium z mikrobiologii szczegółowej. Na kolokwium obowiązuje znajomość materiału z ćwiczeń oraz z wykładów i podręczników, dotyczącego rodzajów bakterii omawianych na ćwiczeniach, tj. rodzajów Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium, Actinomyces, Lactobacillus, Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium, Neisseria, Treponema. Ćwiczenie 10. Seminarium z mikrobiologii jamy ustnej z przeglądem preparatów. II termin kolokwium z mikrobiologii szczegółowej. Ćwiczenie 11. Egzamin praktyczny. Na egzaminie obowiązuje znajomość preparatów i demonstracji ze wszystkich ćwiczeń tj. z mikrobiologii ogólnej i mikrobiologii jamy ustnej.