Struktury histologiczne są optycznie obiektami fazowymi nie zmieniają ani amplitudy fali światła (obiekty nie są ciemniejsze ani jaśniejsze), ani jej długości (barwa), a jedynie powodują załamanie światła i przesunięcie fazy Techniki histologiczne barwienie oko ludzkie nie jest w stanie zarejestrować tej zmiany stąd konieczność uwidocznienia struktur. W technikach mikroskopowych jest to realizowane przez barwienie preparatów. Stosując różne techniki barwienia jesteśmy w stanie uwidocznić odmienne składniki komórkowe lub tkankowe Cząsteczka barwnika posiada: grupę chwytną grupę barwną Większość metod barwienia oparta jest na chemicznym wiązaniu cząsteczki barwnika ze składnikami tkankowymi. Łączenie barwnika z substratem tkankowym najczęściej oparte jest na tworzeniu różnorodnych oddziaływań chemicznych: - oddziaływania elektrostatyczne - wiązania kowalencyjne - oddziaływania van der Waalsa - wiązania wodorowe Czasami występuje konieczność wcześniejszej modyfikacji chemicznej tkanek, co dopiero umożliwia wiązanie cząsteczki barwnika taki proces nazywa się bejcowaniem błękit alcjanowy W zależności od zdolności wiązania barwnika z określonymi strukturami mówimy o swoistości barwienia. Barwienia histologiczne (strukturalne) cechują się raczej niewielką swoistością. Wybrane metody barwienia Barwienie rutynowe hematoksylina i eozyna Rodzaje hematoksylin najczęściej stosowane: hemalauny konieczność utlenienia hematoksyliny barwienie progresywne / regresywne H. campechianum Delafield Mayer Ehrlich Weigert Bejca amonowoglinowy potasowoglinowy potasowoglinowy Chlorek żelaza Utlenianie Światło i powietrze Jodan sodowy Tlen z powietrza Chlorek żelaza Roztwór Kwas cytrynowy Glicerol, kwas octowy Kwas solny Dodatkowo Woda Wodzian chloralu 1
Barwienia trójbarwne (np. AZAN) Impregnacja solami srebra np. włókna srebrochłonne Barwienia rozmazów i wymazów Giemsa / May Grünwald Papanicolau Przygotowanie skrawków do barwienia HE: odparafinowanie (ksylen) nawodnienie (alkohol etylowy) barwienie w hematoksylinie płukanie (woda bieżąca zmiana koloru hematoksyliny) barwienie w eozynie płukanie (krótko) Zamykanie: odwadnianie (alkohol) prześwietlanie (ksylen) zamykanie w żywicy Barwienia histochemiczne Cel barwienia: wykazanie obecności konkretnych substancji chemicznych i określenie ich lokalizacji tkankowej Dużo większa swoistość niż barwień strukturalnych Wykonanie na materiale histologicznym reakcji chemicznej, w wyniku której powstaje produkt: - barwny lub kontrastowy (elektronowo gęsty, fluoryzujący) - nierozpuszczalny w środowisku reakcji Rodzaje rekacji histochemicznych - reakcje jednoetapowe - reakcje wieloetapowe - wiązanie elektrostatyczne - reakcje stereospecyficzne - reakcje fizyczne oparte na różnicy rozpuszczalności barwnika (barwienie lipidów) Reakcja Feulgena reakcja dwuetapowa 1. hydroliza w HCl 2. reakcja z odcz. Schiffa tu: dod. podbarwienie cytoplazmy zielenią jasną 2
Przykłady reakcji histochemicznych Hoechst - DNA (met. fluorescencyjna) Reakcja Feulgena - DNA Pyronina - RNA (met. Bracheta) PAS polisacharydy obojętne Błękit alcjanowy polisacharydy kwaśne Błękit toluidynowy polisacharydy kwaśne (barwienie metachromatyczne) 3
Sudan III (barwienie lipidów, reakcja fizyczna) Błękit pruski żelazo Czerwień alizarynowa złogi wapniowe Czerwień Kongo złogi amyloidu Barwienia histoenzymatyczne Wykazanie aktywności konkretnych enzymów Fosfataza kwaśna (enzym lizosomalny) - makrofagi SUBSTRAT ENZYM PRODUKT Warunki przeprowadzenia reakcji: - enzym musi być czynny (utrwalanie, zatapianie może go inaktywować) - inkubacja przeprowadzana w warunkach optymalnych dla działania enzymu Niektóre z enzymów są charakterystyczne dla wybranych organelli lub komórek, dlatego metody histoenzymatyczne mogą być stosowane do ich identyfikacji 4
Rekacje histochemiczne uwagi: Podbarwienie tła Reakcje kontrolne Czułość metody Ocena ilościowa 5