KREW I HEMOPOEZA. Hct = Skład osocza krwi. Elementy morfotyczne krwi. Rozmaz krwi (metoda Maya-Grünwalda i Giemsy) Wskaźnik hematokrytu

Transkrypt

1 KREW jest tkanką płynną, ponieważ płynna jest istota międzykomórkowa (osocze). Komórki (erytrocyty i leukocyty) i fragmenty komórek (płytki krwi) to elementy morfotyczne. KREW I HEMOPOEZA Funkcje krwi transport: tlenu i substancji odżywczych do komórek, CO 2 i metabolitów wydalanych przez komórki, komórek i czynników uczestniczących w procesach obronnych, substancji regulacyjnych (np. hormonów) do komórek udział w utrzymywaniu homeostazy ustrojowej (równowaga wodno-jonowa, stabilizacja ph, termoregulacja) krzepnięcie osocze elementy morfotyczne Wskaźnik hematokrytu leukocyty i płytki erytrocyty Hct = objętość elementów morfotycznych objętość krwi pełnej mężczyźni 0,4 0,5 kobiety 0,35 0,45 Na wartość wskaźnika hematokrytu największy wpływ ma ilość krwinek czerwonych. Skład osocza krwi Woda 91 92% Białka: albuminy, globuliny α, β, γ (immunoglobuliny), fibrynogen 7 8% Inne substancje: 1 2% jony (Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, Cl -, HCO 3-, PO 4 3-, SO 4 2- ) produkty przemiany materii (mocznik, kwas moczowy, kreatynina) substancje odżywcze (glukoza, aminokwasy, lipidy) gazy (tlen, dwutlenek węgla, azot) substancje regulacyjne (hormony, enzymy, witaminy) Surowica to osocze pozbawione fibrynogenu i czynników krzepnięcia. Rozmaz krwi (metoda Maya-Grünwalda i Giemsy) Elementy morfotyczne krwi Erytrocyty (krwinki czerwone) /mm 3 Leukocyty (krwinki białe) /mm 3 Trombocyty (płytki krwi) /mm 3 granulocyty Neutrofile 55-65% (obojętnochłonne) Eozynofile 2-4% (kwasochłonne) Bazofile 0,5-1% (zasadochłonne) agranulocyty Limfocyty 25-35% Monocyty 4-8% 1

2 Erytrocyty (krwinki czerwone) średnica 7,5 μm brak jądra brak organelli hemoglobina gruby glikokaliks Erytrocyty utrzymują kształt dzięki obecności wewnętrznego szkieletu błonowego (białka transbłonowe: glikoforyna C, białko III szczytu elektroforetycznego + podbłonowa: spektryna). Spośród wszystkich elementów morfotycznych, tylko erytrocyty i płytki krwi pełnią swoje funkcje w obrębie łożyska naczyniowego. Leukocyty wędrują przez ściany naczyń do tkanek (głównie tkanki łącznej), które są terenem ich działania. retikulocyty (1-2%) najmłodsze erytrocyty zawierające skupiska rybosomów Cukrowce glikokaliksu erytrocytów są antygenami głównego układu grupowego (AB0) Za układ grupowy Rh odpowiadają antygeny (głównie D) w obrębie białka błonowego Rh30 Trzy parametry morfologii krwi określają kondycję układu czerwonokrwinkowego: 1. całkowita zawartość erytrocytów /mm 3 2. wskaźnik hematokrytu 3. zawartość hemoglobiny norma: g/dl u kobiet g/dl u mężczyzn Zmniejszenie liczby krwinek czerwonych bądź zmniejszenie zawartości hemoglobiny nosi nazwę niedokrwistości (anemii). Przykład: anemia mikrocytarna z niedoboru żelaza prawidłowy anemia L E U K O C Y T Y Neutrofile fagocytują i zabijają bakterie GRANULOCYTY (neutrofile, eozynofile, bazofile) AGRANULOCYTY (limfocyty, monocyty) segmenty jądra zawierają dużą ilość ziarn azurochłonnych* i swoistych * szczególna forma pęcherzyków hydrolazowych zawierają niewielką ilość ziarn azurochłonnych jądro segmentowane jądro niesegmentowane nie dzielą się mogą się dzielić i różnicować krótki czas życia (dni) długi czas życia (tygodnie lata) średnica ok. 12 μm segmentowane jądro ubogie organelle liczne ziarnistości swoiste i azurochłonne zawierające białka antybakteryjne i enzymy ziarna proteolityczne swoiste Zdolne do: ruchu pełzakowatego fagocytozy zabijania bakterii produkcji mediatorów regulujących reakcje immunologiczne ziarna azurochłonne Neutrofile są głównymi komórkami ostrego stanu zapalnego. 2

3 Ruch pełzakowaty Pod wpływem czynników chemotaktycznych produkowanych przez bakterie i/lub komórki uczestniczące w procesach obronnych neutrofile (i inne leukocyty) przechodzą przez ścianę naczynia, a następnie migrują do źródła czynników chemotaktycznych. W przechodzeniu przez śródbłonek istotną rolę odgrywają cząsteczki adhezyjne (selektyny, integryny, białka nadrodziny immunoglobulin) błony komórkowej leukocyta i komórki śródbłonkowej. Etapy migracji leukocytów przez ścianę naczynia: Fagocytoza: głównie bakterii szczególnie intensywna po opłaszczeniu bakterii przeciwciałami i/lub składnikami dopełniacza (mechanizm receptorowy) Zabijanie i trawienie bakterii wybuch tlenowy fuzja ziarn z fagosomem zabicie bakterii trawienie bakterii System zabijania bakterii: Czynniki tlenozależne szybko działające związane z powstawaniem wolnych rodników wybuchem tlenowym Ponadto neutrofile posiadają receptory rozpoznające wzorzec (PRR), które rozpoznają składniki drobnoustrojów (bakterii, wirusów, grzybów). Czynniki tlenoniezależne wolno działające trawiące lub dziurawiące ściany kom. bakterii (lizozym, defenzymy) hamujące metabolizm bakterii (laktoferryna) Neutrofile zabijają bakterie nawet po swojej śmierci tworzy się zewnątrzkomórkowa sieć neutrofila (NET neutrophil extracellular trap) z ginących neutrofili wydostaje się rozluźniona chromatyna, tworząc gęstą zewnątrzkomórkową sieć, do której przyczepiają się bakteriobójcze białka uwolnione z ziarn neutrofila bakterie złapane w tę sieć giną Eozynofile zabijają larwy pasożytów i współpracują z mastocytami w reakcjach alergicznych Neutrofil Histony MPO Katepsyna G Elastaza Bakteria DNA średnica ok. 15 μm dwusegmentowe jądro ubogie organelle kwasochłonne ziarna swoiste, zawierające: - główne białko zasadowe (MBP) - białko kationowe eozynofili (ECP) - eozynofilową neurotoksynę (EDN) - eozynofilową peroksydazę - enzymy hydrolityczne 3

4 Funkcje eozynofili Bazofile są podobne morfologicznie i czynnościowo do mastocytów, ale stanowią odrębną populację komórek zabijanie pasożytów (poprzez wydzielanie zawartości ziarn) współpraca z mastocytami i bazofilami, neutralizacja czynników prozapalnych (w tym w alergii) działanie immunoregulacyjne i prozapalne słaba zdolność do fagocytozy słabe własności bakteriobójcze i guzobójcze średnica ok. 10 μm jądro segmentowane lub nie zasadochłonne ziarna swoiste zawierające: - histaminę - siarczan chondroityny - czynnik chemotaktyczny dla eozynofili receptory dla IgE Bazofile obok mastocytów są głównymi komórkami nadwrażliwości (alergii) typu I. Limfocyty odpowiadają za reakcje immunologiczne średnica 8 i μm ( małe i duże ) duże kuliste jądro ubogie organelle Monocyty migrują do tkanek, gdzie przekształcają się w makrofagi, komórki prezentujące antygeny (dendrytyczne) lub osteoklasty Limfocyty B humoralna odpowiedź immunologiczna Limfocyty T komórkowa odpowiedź immunologiczna Limfocyty NK zabijanie antygenowo nieprawidłowych komórek Wygląd dużych limfocytów mają również krążące w krwi komórki macierzyste. średnica μm nerkowate jądro dobrze rozwinięte organelle ziarna azurochłonne zdolność do fagocytozy Płytki krwi inicjują proces krzepnięcia krwi Płytki agregują w miejscu uszkodzenia ściany naczyniowej i wydzielają substancje uruchamiające proces krzepnięcia krwi średnica 2-4 μm brak jądra gruby glikokaliks strefa obwodowa (hialomer) - mikrotubule - filamenty aktynowe - otwarty system kanalikowy (wpuklenia błony kom.) - gęsty system tubularny (magazynuje jony Ca 2+ ) strefa centralna (granulomer) - organelle i ziarna - glikogen kontakt z uszkodzonym miejscem przyleganie uwalnianie zawartości ziaren agregacja utworzenie czopu płytkowego wytworzenie fibryny i stabilizacja skrzepu Substancje uwalniane z płytek oraz inne czynniki krzepnięcia (osoczowe, tkankowe) doprowadzają do wytworzenia skrzepu. Adhezja Agregacja Tworzenie fibryny Płytki krwi są bezjądrzastymi fragmentami większych komórek prekursorowych. 4

5 SZPIK KRWIOTWÓRCZY - miejsce hemopoezy naczyniowy hemopoetyczny Przedziały: naczyniowy hemopoetyczny Przedział naczyniowy Cienkościenne naczynia zatokowe (odmiana naczyń włosowatych): śródbłonek brak blaszki podstawnej komórki przydankowe (odmiana perycytów) rusztowanie z tkanki łącznej siateczkowatej: włókna srebrochłonne i komórki zrębowe (fibroblasty, makrofagi, mezenchymatyczne kom. macierzyste) w jego obrębie grupy dojrzewających komórek krwi i nieliczne adipocyty jednopęcherzykowe Komórki śródbłonkowe budujące ścianę naczynia tworzą doraźnie tzw. pory migracyjne dla komórek szpikowych przechodzących do krwi. Przedział hemopoetyczny Komórki przydankowe regulują ten proces poprzez odsłanianie fragmentów ściany naczynia. Wszystkie komórki krwi wywodzą się z jednej komórki macierzystej Powstawanie erytrocytów (linia erytropoezy) Komórki o podobnej morfologii proerytroblast rybosomy erytroblast zasadochłonny Komórki różniące się morfologicznie erytroblast polichromatofilny (wielobarwliwy) erytroblast kwasochłonny hemoglobina Rozmaz szpiku: linia rozwojowa erytrocytów: 20% linia rozwojowa granulocytów: 65% pozostałe linie: 15% 5

6 mieloblast Powstawanie granulocytów (linia granulopoezy) Powstawanie płytek krwi (linia trombopoezy) megakarioblast promielocyt (wytwarzanie ziarn azurochłonnych) (endomitozy) mielocyty (wytwarzanie ziarn swoistych) metamielocyty (wytwarzanie ziarn gelatynazowych w linii neutrofili) młody neutrofil (forma pałeczkowata) promegakariocyt (endomitozy) megakariocyt Megakariocyt duży (do 100 μm) DNA do 64n płatowate jądro obszary: - okołojądrowy (organelle) - pośredni (błony demarkacyjne) - zewnętrzny (mikrofilamenty) Techniki mikroskopowe (2) Techniki histologiczne barwienie uwalnianie płytek krwi błony demarkacyjne (głębokie wpuklenia błony komórkowej) Barwienie klasyczne (przeglądowe) (np. hematoksylina eozyna, HE) Barwnik wiąże się ze strukturami zawierającymi wiele różnych związków chemicznych niska swoistość barwienia. Cząsteczka barwnika posiada: grupę chwytną grupę barwną Barwienia histochemiczne Wybarwienie struktur zawierających tylko określony rodzaj substancji chemicznej wysoka swoistość barwienia. Metody o wysokiej swoistości pozwalają na uwidocznienie w preparacie mikroskopowym (in situ) konkretnych związków chemicznych i umożliwiają określenie ich lokalizacji w strukturach komórkowych i tkankowych. błękit alcjanowy 6

7 Barwienie rutynowe hematoksylina i eozyna Barwienia trójbarwne - AZAN barwienie ma charakter reakcji zobojętniania barwnik kwaśny (eozyna) łączy się ze strukturami komórkowymi i tkankowymi o odczynie zasadowym barwnik zasadowy (hematoksylina) łączy się ze strukturami komórkowymi i tkankowymi o odczynie kwaśnym do barwień przeglądowych często używamy trichromów zestawów trzech barwników (jednego zasadowego i dwóch kwaśnych), co umożliwia dodatkowe zróżnicowanie różnych struktur zasadowych barwniki: azokarmin, oranż G, błękit anilinowy Impregnacja solami srebra Barwienia wymazów Papanicolau sole srebra impregnują włókna siateczkowe tkanki łącznej (włókna srebrochłonne) włókna kolagenowe (z kolagenu I) barwią się na kolor brunatny efekt niespecyficzny wymazy z jamy ustnej, wymazy pochwowe umożliwia zróżnicowanie komórek na różnym etapie keratynizacji barwniki: eozyna, zieleń jasna, oranż G, hematoksylina (podbarwienie) Barwienie rozmazów krwi i szpiku Maya-Grünwalda i Giemsy Przygotowanie skrawków do barwienia HE: jako utrwalacz stosuje się najczęściej alkohol metylowy barwniki: azur II, błękit metylenowy, eozyna wchodzące w skład komercyjnych barwników Maya-Grünwalda i Giemsy w pracowniach diagnostycznych badanie składu komórkowego krwi (morfologia z rozmazem) jest wykonywane automatycznie przy użyciu cytometrów przepływowych odparafinowanie (ksylen) nawodnienie (alkohol etylowy) barwienie w hematoksylinie płukanie (woda bieżąca zmiana koloru hematoksyliny) barwienie w eozynie płukanie (krótko) Zamykanie: odwadnianie (alkohol) prześwietlanie (ksylen) zamykanie w żywicy 7

8 Barwienia histochemiczne substancja wykrywana (w preparacie mikroskopowym) + swoisty substrat (w roztworze) = produkt - widoczny (barwny, fluoryzujący, lub elektronowo gęsty) - nierozpuszczalny (gromadzący się w miejscu powstania) Reakcje histochemii klasycznej wykrywają: różne klasy białek różne klasy cukrowców różne klasy lipidów DNA i RNA niektóre substancje niskocząsteczkowe Typy reakcji histochemicznych jednoetapowe wieloetapowe Mechanizmy reakcji histochemicznych Wiązanie barwników zachodzi na drodze: oddziaływań elektrostatycznych oddziaływań stereospecyficznych (barwnik i wykrywana w preparacie substancja pasują do siebie przestrzennie i wytwarzają wiązania) selektywnej rozpuszczalności Reakcja Feulgena reakcja dwuetapowa: 1. hydroliza w HCl 2. reakcja z odczynnikiem Schiffa tu: dod. podbarwienie cytoplazmy zielenią jasną Wykrywanie kwasów nukleinowych Wykrywanie cukrowców Reakcja Feulgena (DNA): (1) Kontrolowana hydroliza (2) Odczynnik Schiffa Wykrywanie DNA barwnikami fluorescencynymi (DAPI, Hoechst) Reakcja PAS (Periodic Acid-Schiff): (1) Utlenianie w kwasie nadjodowym (2) Odczynnik Schiffa Barwienie błękitem alcjanowym: w zależności od ph barwnik wiąże się z różnymi klasami cukrowców - wykrycie polisacharydów obojętnych - wykrycie polisacharydów kwaśnych Barwienie metachromatyczne (metachromazja) - struktury barwią się na kolor odmienny niż kolor barwnika w roztworze - cząsteczki barwnika wiążą się z regularnie i gęsto rozmieszczonymi grupami anionowymi i tworzą polimer Reakcja z żelazem koloidalnym: (1) Wiązanie jonów żelaza z resztami cukrowcowymi (2) Przekształcenie związanego żelaza w błękit pruski monomer niebieski polimer fioletowy Błękit toluidynowy - wykrywa polisacharydy kwaśne - wykrywa polisacharydy kwaśne 8

9 Wykrywanie lipidów Barwienie Sudanem III - wysoka rozpuszczalność barwnika w tłuszczach - barwienie jest procesem fizycznym Wykrywanie składników patologicznych Czerwień alizarynowa: - wykrywanie złogów wapniowych - stosuje się m. in. w badaniach dotyczących wzrostu kości, osteoporozy, złogów wapnia w układzie naczyniowym Czerwień Kongo: - wykrywanie złogów amyloidu - identyfikacja poszczególnych białek wymaga reakcji immunohistochemicznej - stosuje się m. in. w diagnostyce choroby Altzheimera Barwienia histoenzymatyczne Reakcja precypitacji z kationami metali (reakcja Gomoriego) Wykrywana jest AKTYWNOŚĆ danego enzymu SUBSTRAT ENZYM PRODUKT Warunki przeprowadzenia reakcji: - enzym musi być czynny (utrwalanie materiału może zahamować aktywności badanego enzymu, wtedy trzeba przeprowadzić reakcję na materiale nieutrwalonym i utrwalić go po reakcji) - inkubacja przeprowadzana w warunkach optymalnych dla działania enzymu (koenzymy, jony, ph) Niektóre z enzymów są charakterystyczne dla wybranych organelli lub komórek, dlatego metody histoenzymatyczne mogą być stosowane do ich identyfikacji. - wstępne rozszczepienie substratu przez obecny w tkance enzym - wytrącenie nierozpuszczalnej soli z obecnymi w środowisku reakcji jonami metali - dodatkowa reakcja barwna Wykrywanie fosfatazy kwaśnej: białko markerowe dla lizosomów i makrofagów. 9