ZNACZENIE RNA W REGULACJI EKSPRESJI GENÓW

26 BIOLETYN 17/III/2015 Ścieżki wiedzy ZNACZENIE RNA W REGULACJI EKSPRESJI GENÓW ANNA DANIŁOWICZ ekspresja genów, sirna, RNA, CRISPR Przed naukowcami zajmującymi się biotechnologią postawiono trudne zadanie w postaci kontroli procesów zachodzących w komórce i ich wykorzystania do np. syntezy użytecznych dla człowieka metabolitów komórkowych. Biotechnolodzy codziennie wykorzystują znajomość mechanizmu ekspresji genów, co pozwala im na działalność w różnych dziedzinach. Przykładem jest narzucenie mikroorganizmom określonych warunków, w których są zdolne do produkcji leków lub nakłonienie komórek do poprawnego funkcjonowania, co ma ogromne znaczenie w medycynie. Duży nacisk kładzie się na systemy regulacji oparte na białkach, ale ostatnio zaczęto skupiać się również na wykorzystaniu systemach opartych na RNA, które w równym stopniu jak polipeptydy bierze udział w regulacji takich procesów jak transkrypcja, degradacja mrna (ang. messenger RNA) i translacja [2]. Kwas rybonukleinowy może regulować ekspresję genów poprzez obecność miejsc w łańcuchu tej cząstki, gdzie poszczególne jego części są do siebie komplementarne i mogą wytworzyć się między nimi wiązania wodorowe, tworząc drugorzędową strukturę [4]. TRANSKRYPCJA Rysunek 1. Struktura RNA (źródło: http://www.nature.com/). Proces transkrypcji stanowi pierwszy etap ekspresji genów. Jego mechanizm opiera się na przepisaniu informacji genetycznej zawartej w sekwencji nukleotydów z nici DNA na RNA. Proces można podzielić na inicjację, elongację oraz terminację. W pierwszym etapie polimeraza RNA wiąże się z rozplecioną lokalnie matrycą w miejscu promotorowym. Następnie w fazie elongacji dobudowuje ona kolejne rybonukleotydy, komplementarne do nici DNA, do powstającej nici mrna w kierunku 5' 3'. Proces kończy się w miejscu terminacyjnym, które najczęściej charakteryzuje się komplementarnymi do siebie regionami, co skutkuje wytworzeniem w transkrypcie struktury drugorzędowej typu spinka do włosów [5]. W procesie transkrypcji kontrola na poziomie RNA polega głównie na regulacji terminacji transkrypcji [2], która może przebiegać w postaci zależnej od białka (helikazy) Rho. Białko to podąża za polimerazą RNA dobudowującą kolejne nukleotydy komplementarne do nici. Gdy polimeraza dotrze do drugorzędowej struktury spinki do włosów utworzonej przez mrna

ZNACZENIE RNA W REGULACJI EKSPRESJI GENÓW Anna Daniłowicz 27 kończy elongację. Wtedy helikaza Rho dogania polimerazę i rozbija wiązania wodorowe między parami zasad RNA-DNA, co pozwala na odłączenie matrycy od transkryptu. Innym równie powszechnie występującym w komórkach mechanizmem jest zatrzymanie się polimerazy na strukturze spinki do włosów oraz jej odłączenie się w wyniku zmniejszania siły oddziaływań pomiędzy drugorzędowym RNA i podjednostką polimerazy [1] [2]. Cząsteczka sirna (ang. small interfering RNA) jest to rodzaj kwasu rybonukleinowego o długości 20-30 nukleotydów, który nie ulega translacji i bierze udział w regulacji różnych procesów, szczególnie w procesie syntezy białek [3]. Jednym z mechanizmów regulacji transkrypcji z udziałem sirna jest atenuacja występująca w plazmidach i fagach bakterii zarówno u gram-dodatnich jak i u bakterii gram ujemnych. Jej rola wynika z sprzężenia transkrypcji i translacji u bakterii. Mechanizm atenuacji zależy od powstania dwóch struktur przestrzennych: dużej i małej pętli, których konformacja zależy od sirna. W zależności od powstania jednej z nich transkrypcja ulega zakończeniu (w przypadku utworzenia mniejszej pętli tworzącej sygnał terminacji) lub jest kontynuowana (gdy powstanie większa pętla zatrzymująca rybosom) [1] [2]. Inną grupą makrocząsteczek biorącą udział w terminacji transkrypcji są ryboprzełączniki (ang. ryboswitchers) [2], które składają się z aptameru [7], czyli krótkiego odcinka wiążącego się z metabolitem i platformy ekspresyjnej, zmieniającej konformację pod wpływem przyłączenia do aptameru liganda [6]. W przypadku ryboprzełączników mechanizm polega na przyłączeniu się platformy ekspresyjnej do mrna i po związaniu się aptameru z odpowiednią cząsteczkę wytworzenie przez transkrypt struktury spinki do włosów i terminacji transkrypcji. Ostatnio odkryto również ich udział w regulacji terminacji zależnej od białka Rho [2]. System CRISPR (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) to metoda bakterii do obrony przed obcym kwasami nukleinowymi. Charakteryzuje się palindromowymi powtórzeniami (sekwencja,do której komplementarna część czytana w kierunku 5'-3' jest taka sama) w genach kodujących cząstki tego systemu. Składa się on z sekwencji liderowej (promotor transkrypcji systemu CRISPR) oraz genów kodujących białka z rodziny Cas, które rozpoznają i tną na kawałki obce kwasy nukleinowe włączając przy tym ich fragmenty do sekwencji CRISPR, co pozwala mikroorganizmowi na rozpoznanie intruza przy kolejnym jego ataku [10]. Znane są trzy główne typy tego systemu różniące się mechanizmem rozkładu inwazyjnego materiału genetycznego przez nukleazy [9]. W najpowszechniej występującym u prokariaontów typie II CRISPR łączy się z sgrna (ang. small guide RNA) łączy się z obcym materiałem genetycznym, jednocześnie oznaczając go i pozwalając na przyłączenie się nukleazy Cas9 (numer białka zależy od pełnionej funkcji) powodując jego rozkład [2][9]. TRANSLACJA Kolejnym etapem ekspresji genów jest translacja, czyli synteza na matrycy mrna łańcucha białkowego, poprzez dołączanie kolejnych aminokwasów w zależności od sekwencji

28 BIOLETYN 17/III/2015 Ścieżki wiedzy nukleotydów w kierunku 5' 3' katalizowana przez rybosomy. Składa się ona z trzech etapów: inicjacji, elongacji i terminacji. W pierwszej fazie mała podjednostka rybosomu przyłącza się do końca 5' mrna, a do niej dołącza się duża podjednostka. Każdy rybosom posiada dwa miejsca, do których w trakcie elongacji wiąże się trna (ang. transport RNA) z aminokwasem odpowiadającym sekwencji. W drugim miejscu znajduje się trna z aminokwasem włączonym już do łańcucha polipeptydowego. Obydwa aminokwasy znajdują się na tyle blisko siebie, aby mogło wytworzyć się wiązanie peptydowe. Następnie cząsteczka trna z pierwszego miejsca przesuwa się na drugie miejsce, z którego w tym samym uwolniony zostaje poprzedni trna. Proces trwa do momentu napotkania kodonu STOP, co powoduje rozpad rybosomu i odłączenie syntezowanego białka [5]. Największą rolę w procesie translacji odgrywa 16S rrna (rybosomalne RNA wchodzące w skład małej podjednostki rybosomu), którego fragment na końcu 3' jest częściowo komplementarny do miejsca wiązania rybosomu na matrycy mrna zwanego również sekwencją Shine-Dalgarno. Jest także wiadome, że stopień dopasowania pomiędzy tymi dwoma sekwencjami wpływa na efektywność translacji. Dodatkowo tworzenie drugorzędowych struktur przez RNA w regionach przylegających do miejsca wiązania rybosomu i kodonu inicjacyjnego również mogą zmienić dostępność miejsca wiązania dla 16S rrna, co powoduje zmianę wydajności translacji. Mechanizm tworzenia struktur drugorzędowych jest regulowany dzięki obecności sirna i ich białek opiekuńczych, które poprzez oddziaływania z mrna odsłaniają miejsce wiązania rybosomu i umożliwiają inicjację procesu translacji, co obserwuje się w pewnych genach E. coli [2]. Inną grupą cząsteczek biorącą udział w inicjacji translacji są ryboprzełączniki, które zmieniają konformację pod wpływem przyłączenia do aptameru liganda, co powoduje odsłonięcie lub zakrycie miejsca, do którego może przyłączyć się rybosom. Mechanizm ten jest idealny do kontrolowania ekspresji komórkowej [2]. Kolejną regulującą ten proces strukturą są rybozymy, czyli małe jądrowe rybonukleoproteiny (snrnp, ang. small nuclear ribonucleoproteins), które biorą udział w procesie wycinania intronów i łączenia egzonów [1][8]. Połączono je z aptamerami tworząc kompleks zależny od przyłączonego liganda nazywany aptozymem. W zależności od reakcji na ligand jego obecność może oznaczać aktywację genu przez rozpoczęcie wycinania intronów lub represjonować ekspresję przez zatrzymanie składania mrna [2]. Opisane powyżej mechanizmy są przykładami mechanizmów regulacji ekspresji genów przez RNA, które wykorzystywane w inżynierii genetycznej mogą pomóc w m.in. wyciszaniu lub aktywacji danych genów. Warto również wspomnieć o cząsteczkach RNA biorących udział w obróbce potranslacyjnej białek, które również mogą być inspiracją w planowaniu nowych rozwiązań biotechnologicznych [2].

ZNACZENIE RNA W REGULACJI EKSPRESJI GENÓW Anna Daniłowicz 29 DEGRADACJA mrna Fragmenty RNA kontrolują również proces degradacji mrna. W przypadku bakterii degradacja jest prowadzona przez degradosom, składający się z RNazy E (endonukleazy), fosforylazy polinukleotydowej (PNPaza) usuwającej nukleotydy od końca 3' i zależnej od obecności fosforu jako kosubstratu oraz helikazy RhIB, rozbijającej struktury spinki do włosów. Działalność RNazy E dotyczy głownie RNA jednoniciowych, struktury drugorzędowe hamują jej aktywność, co czyni je czynnikiem ograniczającym ten proces [1][2]. Interakcje pomiędzy sirna i mrna prowadzą do degradacji matrycy do syntezy białek poprzez działalność endonukleaz takich jak RNazy III i E, co powoduje zahamowanie inicjacji translacji, często nieodwracalnie. Większość sirna powoduje degradację, ale niekiedy także może stabilizować mrna [2]. Rybozymy także katalizują degradację mrna. Przykładem jest rybozym klasy glms, który w odpowiedzi na przyłączenie się fosforanu glukozaminy szybko rozkłada matrycę do syntezy białek. W przypadku ryboprzełączników, oprócz pośredniego działania poprzez opisany już powyżej proces hamowania translacji, odkryto w ostatnich latach, że w E. coli mogą one indukować bezpośrednio rozkład mrna, a nawet blokować inicjację translacji poprzez zmianę wynikającą z przyłączenia ligandu skutkującym wystawieniem na działanie RNazy E [2]. JAK ZNALEŹĆ POWIĄZANIE POMIĘDZY SEKWENCJĄ RNA I JEGO STRUKTURĄ? Ważnym elementem badań nad wykorzystaniem wyżej wymienionych mechanizmów jest dogłębne poznanie zależności między sekwencją i konformacją oraz poznanie zasad zachowania struktur drugorzędowych RNA. Pomoc w rozwiązaniu tego problemu oferują narzędzia komputerowe, które pozwalają zwizualizować cząsteczkę w 3d, a także przewidzieć jej reakcję podczas poszczególnych etapów ekspresji genów. Najsłynniejsze algorytmy biorące pod uwagę struktury drugorzędowe zostały opracowane w programie MC-Fold i MCSim. Problemem są niektóre struktury tworzone przez RNA takie jak 'pseudoknocks', czyli co najmniej podwójne pętle dodatkowo połowicznie tworzące wiązania między sąsiadującymi parami nukleotydów. Dla takich struktur odpowiedniejsze są programy Hotknocks i Turboknot uwzględniające w swoich algorytmach ten problem. Rysunek 2. Sekwencjonowanie (źródło: http://www.genengnews.com). Istnieją także metody takie jak Kingfold

30 BIOLETYN 17/III/2015 Ścieżki wiedzy (pozwala na wizualizację zachowania RNA podczas transkrypcji), które pozwalają na obserwacje zmian w strukturze podczas samych procesów ekspresji genów. Warto również wspomnieć o bazach struktur RNA takich jak ViennaRNA lub Unafold, które pozwalają na porównywanie otrzymanych w trakcie badań struktur RNA [2]. Strukturę RNA można poznać również w sposób doświadczalny. Jest możliwość określenia układu przestrzennego ryboprzełączników i rybozymów poprzez NMR (ang. nuclear magnetic resonance) lub rentgenografię strukturalną. Niestety te metody nie pozwalają na określenie struktury srna. Rozwiązaniem jest chemiczna i enzymatyczna modyfikacja RNA lub weryfikacja poprzez różnego rodzaju elektroforezy i sekwencjowanie [2]. Obiecująca wydaje się tutaj metoda RNA-Seq, która pozwala na określenie ilości RNA polegająca na izolacji RNA, jego fragmentacji i konwersji do DNA przy użyciu przypadkowych starterów. Następnie sekwencjonuje się otrzymany materiał i porównuje się sekwencje z danymi zamieszczonymi na specjalnej platformie. Strukturę RNA można uzyskać za pomocą metody SHAPE-Seq (ang. selective 2 -hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing), w której używa się chemicznych odczynników wpływających na strukturę drugorzędową i czwartorzędową RNA. Translację i transkrypcję RNA bada się izolując rybosomy przeprowadzające właśnie translację i analizując fragmenty mrna niezwiązane z białkiem. Do badanie oddziaływań RNA z białkami używa się immunoprecypitacji RNA (RIP-Seq- ang. RNA immunoprecipitation- sequencing), gdzie obrazowo ujmując sprawdza się, które białko odpowiada badanej sekwencji. Materiał wyjściowy poddaje się odwrotnej transkrypcji i następnie sekwencjonuję się go, aby sprawdzić, która sekwencja reaguje z badanym białkiem. Metody te określa się mianem technik NGS (ang. next-generation sequencing) [2]. PODSUMOWANIE Wykorzystanie RNA w biologii syntetycznej stanowi innowacyjny potencjał dla dalszych badań i jest inspiracją do poszukiwań rozwiązań opartych na naturalnych mechanizmach regulacji ekspresji genów przez cząsteczki RNA. Rozwijające się metody laboratoryjne i techniki komputerowe pozwolą na coraz lepsze poznanie i wykorzystanie w praktyce wiedzy o tych procesach, co pozwoli na ukierunkowanie komórek na produkcję wymaganych substancji, np. dzięki sztucznym ryboprzełącznikom można produkować antybiotyki i niektóre białka [2]. ŹRÓDŁA BIBLIOGRAFICZNE: 1. Brown T.A., Genomy, PWN, Warszawa 2012. 2. Chappell J., Takahashi M., Meyer S., Loughrey D., Watters J., Lucks J., The centrality of RNA for engineering gene expression, Biotechnology Journal 2013, nr 8, s. 1379-1395. 3. Grosshance H., Filipowicz W.: The expanding world of small RNAs, Nature, 2008, vol. 451, str. 414-416.

ZNACZENIE RNA W REGULACJI EKSPRESJI GENÓW Anna Daniłowicz 31 4. Turner P., McLennan A.,Bates A., White M.: Krótkie wykłady. Biologia molekularna, Wydawnictwo PWN, Warszawa 2011. 5. Ziembińska A., Lalik A., Węgrzyn A.: Markery Molekularne. Podstawy dla studentów kierunków technicznych, Wyd. Politechniki Śląskiej, Gliwice 2011 6. https://pl.wikipedia.org/wiki/ryboprze%c5%82%c4%85cznik 7. https://pl.wikipedia.org/wiki/aptamer 8. https://pl.wikipedia.org/wiki/rybozymy 9. https://en.wikipedia.org/wiki/crispr 10. http://crooveck.blogspot.com/2010/12/crispr-clustered-regularly-interspaced.html