Choroby neurodegeneracyjne stanowią duże wyzwanie dla współczesnej

Znaczenie kinazy ATM w procesach neurodegeneracyjnych STRESZCZENIE Choroby neurodegeneracyjne stanowią duże wyzwanie dla współczesnej medycyny. Pomimo wieloletnich badań nie poznano bezpośrednich przyczyn tych chorób ani nie opracowano skutecznej terapii. Rzadką chorobą objawiającą się obumieraniem komórek głównie w móżdżku jest zespół ataksja-teleangiektazja (A-T), który jest spowodowany mutacją w genie kodującym kinazę ATM biorącą udział między innymi w naprawie uszkodzeń DNA, regulacji cyklu komórkowego oraz kontroli apoptozy. W ostatnich latach wykazano obecność tej kinazy w cytoplazmie, dzięki czemu odkryto jej udział w regulacji procesów metabolicznych, homeostazy mitochondrialnej, odpowiedzi na stres oksydacyjny i modulacji funkcji synaps. Plejotropowe działanie kinazy ATM wymaga efektywnej kontroli, sprawowanej między innymi przez białka posiadające specyficzne motywy wiążące kinazę ATM czyli białka ATMIN i NBS1. Regulacja ważnych dla przeżycia komórki procesów kontrolowanych przez białko ATM może w przyszłości okazać się atrakcyjnym celem strategii terapeutycznych zarówno chorób nowotworowych, jak i chorób neurodegeneracyjnych. WPROWADZENIE Pomimo zaawansowanego rozwoju medycyny nadal nieznane są skuteczne metody leczenia chorób o podłożu neurodegeneracyjnym. Najczęściej występującymi schorzeniami tego typu są choroba Alzheimera (AD, ang. Alzheimer s disease) oraz choroba Parkinsona (PD, ang. Parkinson s disease). Za główny czynnik ryzyka rozwoju tych patologii uważa się starzenie organizmu, które w odpowiedniej konfiguracji z predyspozycjami genetycznymi i/lub czynnikami środowiskowymi prowadzą do ujawnienia się objawów chorobowych. Etiopatogeneza większości chorób neurodegeneracyjnych, oprócz ich form genetycznych, nie została wyjaśniona [1]. Na poziomie komórkowym procesom neurozwyrodnieniowym sprzyja stres oksydacyjny, dysfunkcja mitochondriów oraz nadmiar endogennego neuroprzekaźnika pobudzającego kwasu glutaminowego [2]. Układ nerwowy jest bardzo aktywny metabolicznie, o czym może świadczyć fakt, że około 20% wdychanego tlenu jest w nim zużywana, a konsekwencją tego jest produkcja dużej ilości metabolitów, w tym wolnych rodników, które mogą być szkodliwe dla komórek [3]. Wysokie zapotrzebowanie energetyczne komórek nerwowych wymaga wydajnej pracy mitochondriów, a konieczność dostarczenia niezbędnych organelli i białek do zakończeń neuronalnych (aksonów i dendrytów) wymusza ich wydajny transport. Zdolność do sprawnego usuwania wolnych rodników jest szczególnie istotna dla neuronów dopaminergicznych, gdzie metabolizm i samoutlenianie dopaminy jest związane ze zwiększoną produkcją reaktywnych form tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species) [4]. Zwiększony poziom ROS w neuronach sprzyja oksydacji lipidów, białek oraz DNA, co w konsekwencji może prowadzić do dysfunkcji neuronów i w końcowym etapie do ich degeneracji [5]. Szczególnie niebezpieczna może być dla post-mitotycznych komórek nerwowych nadmierna akumulacja uszkodzeń DNA, która jest skutkiem podwyższonego stresu genotoksycznego wywołanego przez ROS oraz zaburzonymi mechanizmami naprawy DNA, procesami obserwowanymi w przebiegu wielu zależnych od wieku chorób neurodegeneracyjnych [6]. O znaczeniu systemu naprawy DNA w komórkach nerwowych może świadczyć fakt, że inaktywacja kluczowych białek zaangażowanych w te procesy prowadzi do neurodegeneracji [7]. Przykładem takiego schorzenia jest zespół ataksja-teleangiektazja (A-T, ang. ataxia telangiectasia disease), nazywany również syndromem Louis-Bara lub syndromem Boder-Sedgwicka. Jest to rzadkie schorzenie genetyczne (jeden przypadek na 100 000 narodzin), spowodo- Jakub Chwastek * Danuta Jantas Władysław Lasoń Zakład Neuroendokrynologii Doświadczanej, Instytut Farmakologii PAN, Kraków * Zakład Neuroendokrynologii Doświadczanej, Instytut Farmakologii PAN, ul. Smętna 12, 31-343 Kraków; tel.: (12) 662 33 94, e-mail: chwastek@ if-pan.krakow.pl Artykuł otrzymano 3 czerwca 2014 r. Artykuł zaakceptowano 15 sierpnia 2014 r. Słowa kluczowe: ATM, neurodegeneracja, neuroprotekcja, nowotwory Wykaz skrótów: A-T zespół ataksja-teleangiektazja; ATM ang. ataxia telangiectasia mutated; DSB dwuniciowe uszkodzenia DNA; NBS zespół Nijmegen; ROS (ang. reactive oxygen species) reaktywne formy tlenu Postępy Biochemii 60 (3) 2014 313

wane mutacją genu ATM, powodującą utratę stabilności kinazy ATM (ang. ataxia telangiectasia mutated), a w łagodniejszych wariantach niższy poziom białka lub obniżoną aktywność enzymu [8]. Podstawowymi objawami tej choroby są zaburzenia koordynacji (ataksja móżdżkowa), poszerzone naczynia krwionośne (teleangiektazja) w obrębie skóry i gałek ocznych, niedobory immunologiczne, bezpłodność, większa podatność na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem i wzrost ryzyka wystąpienia nowotworów. Zasadniczym elementem patomechanizmu tego schorzenia jest postępująca degeneracja móżdżku, a w późniejszych etapach choroby mogą wystąpić również uszkodzenia innych obszarów mózgu [9]. W fibroblastach uzyskanych od pacjentów cierpiących na A-T zaobserwowano między innymi nieprawidłową odpowiedź na stres oksydacyjny, dysfunkcje mitochondriów, nieprawidłową budowę cytoszkieletu, niestabilność chromosomów oraz zwiększoną wrażliwość na promieniowanie jonizujące. Dodatkowo u pacjentów A-T występuje obniżony poziom antyoksydantów, takich jak witaminy A i E [10]. W badaniach mechanizmów A-T często wykorzystywanym modelem zwierzęcym są myszy z usuniętym genem ATM (knock-out genu ATM). Zwierzęta te charakteryzują się zwiększoną wrażliwością na promieniowanie jonizujące, spadkiem odporności i wzrostem ryzyka wystąpienia nowotworów. Co ciekawe, nie obserwuje się u tych zwierząt neurodegeneracji móżdżku, która jest zasadniczym elementem choroby w przebiegu A-T u ludzi [11,12]. Dalsze badania wykazały u myszy z usuniętym genem ATM upośledzenie funkcji szlaku nigrostratialnego, postępującą z wiekiem degenerację komórek dopaminergicznych oraz osłabienie funkcji synaptycznych komórek hipokampa [13]. Podobne deficyty zaobserwowano u starszych myszy z wyciszonym genem kodującym kinazę ATM, u których stwierdzono znaczny spadek liczby neuronów dopaminergicznych w substancji czarnej [14]. Natomiast zwierzęta, u których zaindukowano ekspresję genu kodującego nieaktywną katalitycznie kinazę ATM, umierały we wczesnym okresie embrionalnym. Przyczyna tego zjawiska nie jest jasna. Autorzy sugerują, że nieaktywna kinaza ATM wiąże się z dwuniciowymi uszkodzeniami DNA (DSB, ang. double strand break), co zapobiega aktywacji dalszych poziomów przekazywania sygnału [15], natomiast brak białka ATM może być kompensowany poprzez aktywację jego substratów przez inne białka należące do rodziny PIKK (ang. phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases) [15]. W mysim modelu A-T stwierdzono również wczesne zaburzenia w uwalnianiu insuliny z komórek β trzustki, a w efekcie rozwój hiperglikemii [16]. Ostatnie lata zaowocowały licznymi doniesieniami na temat nowych fizjologicznych funkcji kinazy ATM, odbiegających od jej roli w naprawie uszkodzeń DNA. Aktywność tej kinazy w cytoplazmie związana jest między innymi z modulacją poziomu wolnych rodników, utrzymaniem prawidłowej funkcji mitochondriów, regulacją insulinowego szlaku sygnałowego i indukcją procesów autofagii [10]. Informacje dotyczące cytoplazmatycznych funkcji kinazy ATM dają podstawy do rozważenia kinazy ATM jako nowego celu terapeutycznego dla nieuleczalnych jak dotąd chorób, takich jak cukrzyca, choroby neurodegeneracyjne lub nowotwory. W niniejszym artykule przedstawiono zarys obecnego stanu wiedzy na temat kinazy ATM i innych białek towarzyszących, ze zwróceniem szczególnej uwagi na ich rolę w komórkach układu nerwowego i ich potencjalnego użycia jako celu nowych strategii neuroprotekcyjnych. BUDOWA I FUNKCJE KINAZY ATM Kinaza ATM jest dużym białkiem, składającym się z 3056 reszt aminokwasowych, o masie około 350 kda i należącym do rodziny PIKK. Gen ATM jest zlokalizowany na 11 chromosomie, obejmuje około 150 tysięcy par zasad oraz składa się z 66 eksonów [11]. Białko posiada trzy ważne domeny. Od końca aminowego jest to domena HEAT, umożliwiająca przyłączenie się do kinazy ATM białek regulujących. Przy końcu karboksylowym występuje domena FAT, stabilizująca białko oraz domena FATC, regulująca aktywacje kinazy [17]. Reszta cysteiny, która w łańcuchu kinazy ATM zajmuje pozycję 2991 odgrywa bardzo ważną rolę w aktywacji enzymu przez stres oksydacyjny [18]. Co ciekawe, zaobserwowano, że ta reszta aminokwasowa występuje w tej samej pozycji u kręgowców lądowych, lecz nie u kręgowców morskich. Na tej podstawie autorzy wysnuli hipotezę, że taka budowa kinazy ATM pomogła organizmom lepiej radzić sobie ze stresem oksydacyjnym, spowodowanym wzrostem poziomu tlenu w nowo kolonizowanym środowisku [19]. Najlepiej poznaną funkcją kinazy ATM jest jej udział w sygnalizacji i odpowiedzi na dwuniciowe uszkodzenie DNA (Ryc. 1). Forma nieaktywna składa się z dwóch białek ATM (homodimer) połączonych niekowalencyjnie. Obecność DSB prowadzi do autofosforylacji (w pozycji S1981) i rozpadu struktury na dwa monomery [20]. Jednym z pierwszych substratów kinazy ATM jest histon H2AX (ang. H2A histone family, member X), którego ufosfo- Rycina 1. Schemat jądrowej sygnalizacji kinazy ATM w odpowiedzi na dwuniciowe uszkodzenia DNA. Inne wyjaśnienia w tekście pracy. 314 www.postepybiochemii.pl

rylowana forma (γh2ax) stanowi marker dwuniciowego uszkodzenia DNA [21]. W miejscu występowania γh2ax gromadzi się kompleks MRN, składający się z białek: MRE11 (ang. meiotic recombination 11), Rad50 oraz NBS1 (ang. Nijmegen breakage syndrome protein 1). Pozwala on na połączenie zerwanych końców DNA i stanowi czujnik uszkodzeń. Oddziaływanie kinazy ATM z kompleksem MRN, poprzez NBS1, prowadzi do jej dalszej aktywacji i fosforylacji innych substratów. Są to między innymi takie białka jak: p53, BRCA1 (ang. breast cancer type 1 susceptibility protein), Chk2 (ang. checkpoint kinase 2) i MDM2 (ang. mouse double minute 2), które biorą udział w kontroli cyklu komórkowego, naprawie DNA oraz programowanej śmierci komórki (apoptozie) [22]. Jądrowa rola kinazy ATM wychodzi zdecydowanie poza jej udział w procesach naprawy DNA. Jako przykład może posłużyć aktywacja białka p53, którego aktywność może decydować o wyborze pomiędzy śmiercią a przeżyciem komórki [23]. Jednym z białek wzmacniających aktywację p53 za pośrednictwem kinazy ATM jest AMPK (ang. AMP-activated protein kinase). Aktywacja AMPK prowadzi również do zahamowania szlaku mtor (ang. mammalian target of rapamycin) i w rezultacie do śmierci komórek na drodze autofagii. AMPK odgrywa znaczącą rolę w regulacji metabolizmu komórki oraz progresji podziałów mitotycznych [24]. Leki wywołujące uszkodzenie DNA, takie jak methotrexat, etopozyd lub homocysteina, powodują zależną od kinazy ATM apoptozę neuronów [25]. Ma to związek prawdopodobnie z próbami powrotu postmitotycznych neuronów do cyklu komórkowego, po zadziałaniu czynników genotoksycznych. Naprawa DNA zachodzi sprawniej w komórkach aktywnych mitotycznie. Jednak próba powrotu do cyklu komórkowego w neuronach jest zjawiskiem bardzo niekorzystnym, ze względu na postępujące nagromadzenie uszkodzeń i niestabilność DNA. Dodatkowo podział mocno rozbudowanego cytoszkieletu komórek nerwowych jest znacznie utrudniony, co w rezultacie prowadzi do wzrostu poziomu sygnałów apoptotycznych i śmierci komórki [7]. Z drugiej strony kinaza ATM poprzez fosforylację białka NEMO (ang. NF-kappa-B essential modulator) aktywuje transkrypcję czynnika NF-κB (ang. Nuclear factor kappa B), powodując wzrost ekspresji genów antyapoptotycznych [26]. Dezaktywacja kinazy ATM polega na jego defosforylacji przy udziale przynajmniej dwóch fosfataz: PP2A (ang. protein phosphatase 2) oraz PP5 (ang. protein phosphatase 5) [27]. Komórki całkowicie pozbawione kinazy ATM są nadal w stanie naprawiać DNA, jednak robią to znacznie wolniej. Dlatego też, w celu wytłumaczenia różnorodności oraz intensywności objawów chorobowych występujących w zespole A-T brane są również pod uwagę pozajądrowe funkcje kinazy ATM [13]. BIAŁKA REGULUJĄCE AKTYWNOŚĆ KINAZY ATM Białko NBS1, jako składnik kompleksu MRN, reguluje proces naprawy dwuniciowych uszkodzeń DNA, lecz nie stwierdzono jego aktywności enzymatycznej. Na końcu aminowym znajduje się domena FHA oraz tandemowo ułożone dwie domeny BRCT, typowe dla białek biorących udział w procesach naprawy DNA [28]. Są one odpowiedzialne za oddziaływanie między innymi z histonem γh2ax. Na końcu karboksylowym znajduje się fragment odpowiedzialny za wiązanie białek, takich jak kinaza ATM oraz MRE11. Dzięki swojej budowie, NBS1 w momencie wystąpienia dwuniciowego uszkodzenia DNA łączy się z histonem γh2ax, a następnie oddziałuje z kinazą ATM. Prowadzi to do fosforylacji białek niezbędnych do naprawy DSB, w tym samego NBS1 [29]. Mutacja genu kodującego NBS1 powoduje zespół Nijmegen, który objawia się niestabilnością chromosomową, niedoborami odporności, podwyższoną wrażliwością na promieniowanie jonizujące, predyspozycją do zapadania na nowotwory oraz mikrocefalią (małogłowiem) [30]. Zmiany neurodegeneracyjne spowodowane tą mutacją są głównie wadami rozwojowymi, co wskazuje na jego ważną rolę w okresie prenatalnym. Może to być związane ze wzmożoną apoptozą spowodowaną nadmierną fosforylacją białka p53 przez kinazę ATM oraz niestabilnością kompleksu MRN, przez co osłabieniu ulega proces blokady cyklu komórkowego na czas naprawy DSB, a samo poprawianie błędów jest mniej efektywne [31]. Wzrost poziomu białka NBS1 zaobserwowano w komórkach nowotworowych, zwłaszcza w grupie nowotworów szyi i głowy. Białko łączy się z katalityczną podjednostką kinazy PI3-K i w efekcie prowadzi do jej aktywacji, co może być przyczyną wzmożonych podziałów komórek [32]. Ponadto fibroblasty ze skróconym genem Nbs1 kodującym nieaktywne białko, szybciej starzały się w wyniku przyspieszonej degradacji telomerów [33]. Całkowite usunięcie genu Nbs1 prowadzi do śmierci myszy w okresie embrionalnym, natomiast wyciszenie genu w ośrodkowym układzie nerwowym skutkuje osłabionym wzrostem zwierząt oraz wczesnym rozwojem katarakty. Co więcej, w okresie postnatalnym zaobserwowano nieprawidłowy rozwój móżdżku, zahamowaną proliferację neuronalnych komórek progenitorowych oraz mikrocefalię. Mechanizm powstawania tych dysfunkcji nie jest poznany, jednak objawy te są podobne do ludzkiego syndromu Nijmegen [34]. Drugim białkiem regulującym funkcje kinazy ATM jest ATMIN (ang. ATM interactor), zwane również ASCIZ (ang. ATM/ATR-substrate CHK2-interacting zinc finger protein). Na końcu karboksylowym występuje homologiczny fragment do białka NBS1, przez który białko ATMIN oddziałuje z kinazą ATM. Posiada również liczne motywy SQ/TQ (reszty seryny lub treoniny przed resztą glutaminy), które są preferowanymi miejscami fosforylacji przez kinazy należące do rodziny PIKK. Na końcu aminowym ATMIN obecne są palce cynkowe, które umożliwiają bezpośrednie wiązanie nici DNA. Obecność domeny PEST, będącej miejscem sygnałowym do proteolizy, świadczy o krótkim okresie półtrwania tego białka [35]. Wykazano, że ATMIN oraz NBS1 współzawodniczą o wiązanie kinazy ATM. Deficyt NBS1 w mysich fibroblastach powoduje zahamowanie proliferacji, któremu częściowo zapobiega usunięcie białka ATMIN [36]. Wyniki badań Kanu i współpracowników sugerują, że kinaza ATM oraz ATMIN współdziałają, zwłaszcza jeżeli nie występują uszkodzenia DNA. Warto też wspomnieć, że białka te nie występują razem w kompleksach naprawczych, wywołanych promieniowaniem radiacyjnym. Ich oddziaływanie zaobserwowano natomiast podczas stresu hipotoniczne- Postępy Biochemii 60 (2) 2014 315

Rycina 2. Pozajądrowe funkcje kinazy ATM z wyróżnieniem miejsca ich występowania w komórce. Inne wyjaśnienia w tekście pracy. go oraz w wyniku działania chlorochiny [37]. Wykazano, że ATMIN tworzy kompleks z białkiem Rad51 przy naprawie uszkodzeń DNA spowodowanych czynnikami utleniającymi oraz metylującymi, nawet jeśli aktywność kinazy ATM została zahamowana [38]. Należy tutaj dodać, że metylacja wywołana czynnikami chemicznymi występuje w innych miejscach nukleotydów niż fizjologiczna (regulująca transkrypcję genów) i prowadzi do destabilizacji DNA [39]. Myszy pozbawione białka AT- MIN giną około 16 dnia ciąży i występują u nich poważne defekty, takie jak brak rozwoju płuc oraz brak czaszki (przy jednoczesnym rozwoju mózgu) [40]. Zwierzęta z zahamowaną ekspresją genu kodującego ATMIN w układzie nerwowym rodziły się i były w stanie funkcjonować, jednak zaobserwowano u nich szereg nieprawidłowości, takich jak mniejsze rozmiary ciała oraz skrócony czas życia w porównaniu do zwierząt kontrolnych [3]. Analiza histologiczna mózgu mutantów wykazała znaczący ubytek liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej oraz korze nowej. Hodowle fibroblastów z zarodków, w których wywołano całkowite usunięcie genu ATMIN były bardziej podatne na stres oksydacyjny oraz związane z nim starzenie się komórek [3]. Pomiary ilości białka ATMIN w różnych narządach myszy wykazały, że jest go znacznie więcej w mózgu i móżdżku niż w innych tkankach, co może popierać hipotezę o jego znaczeniu w funkcjonowaniu ośrodkowego układu nerwowego [40]. Poważne defekty rozwojowe, powodujące obumieranie płodów myszy pozbawionych białka ATMIN, świadczą o jego roli w organizmach żywych. Jedną z niedawno poznanych funkcji ATMIN jest aktywowanie transkrypcji mrna kodującego białko DYNLL1 (ang. dynein, light chain, LC8-type 1). Jest to małe, o sekwencji zachowanej w ewolucji białko, znane jako składnik kompleksu motorycznego dyneiny. Odpowiada za łączenie różnych białek z kompleksem transportującym te białka do właściwego miejsca w komórce, a także w transporcie mitochondriów do zakończeń aksonalnych [41,42]. Knock- -down genu ATMIN w linii komórkowej wyprowadzonej z kostniakomięsaka (ang. osteosarcoma) powoduje zna- 316 www.postepybiochemii.pl

czący spadek ekspresji genu Dynll1. Wykazano obecność białka ATMIN w cytoplazmie oraz jego migrację do jądra podczas stymulacji czynnikiem metylującym [41]. Śmiertelność myszy spowodowana usunięciem genu ATMIN może mieć zatem związek z zaburzoną kontrolą ekspresji genu kodującego białko DYNLL1. KINAZA ATM W UKŁADZIE NERWOWYM W komórkach eukariotycznych dwuniciowe uszkodzenia DNA są naprawiane na drodze homologicznej rekombinacji (HR, ang. homologous recombination) oraz przez łączenie niehomologicznych końców (NHEJ, ang. non-homologous end joining). Mechanizmy te występują w różnych fazach cyklu komórkowego i wykorzystują inne zestawy enzymów [43]. HR używa chromatydy siostrzanej jako matrycy umożliwiającej odbudowanie uszkodzonego fragmentu, dlatego może zachodzić tylko w fazie S oraz G2. Ten mechanizm naprawy dominuje podczas rozwoju zarodkowego, kiedy komórki szybko się dzielą. NHEJ modyfikuje końce DSB w taki sposób, że możliwa jest ich bezpośrednia ligacja. Czasem konieczne jest usunięcie nienadających się do ligacji fragmentów DNA, przez co powstają niewielkie odcinki homologiczne, które służą odbudowie niekompletnej nici. Dlatego mechanizm NHEJ może generować błędy, przez utratę niewielkich fragmentów informacji genetycznej. Ze względu na terminalne zróżnicowanie neuronów, NHEJ jest dominującym sposobem naprawy dwuniciowych uszkodzeń w mózgu [43]. Kinaza ATM oddziałuje z kompleksem MRN podczas naprawy przez homologiczną rekombinację. W mechanizmie NHEJ kinaza ATM katalizuje reakcję fosforylacji białek, takich jak DNA-PK (ang. DNA protein kinase) oraz 53BP1 (ang. p53-binding protein 1). Kinaza ATM fosforyluje również białka uczestniczące w obu mechanizmach, takie jak histon H2AX, BRCA1 i białko p53 [8]. Jedna z hipotez występowania zespołu A-T zakłada, że na skutek dysfunkcji kinazy ATM niedojrzałe neurony, w których wystąpiły uszkodzenia DNA, nie są zdolne do apoptozy, dlatego ulegają dalszemu różnicowaniu i są lokowane w układzie nerwowym. Ich obumieranie w następnych latach życia powoduje neurodegenerację, będącą podstawowym objawem zespołu A-T [22]. Dokładniejsze badania wykazały u osób cierpiących na zespół A-T objawy, takie jak osłabienie długotrwałego wzmocnienia synaptycznego (LTP, ang. long term potentiation) w komórkach nerwowych, defekty w histonowym kodzie epigenetycznym, problemy z integralnością mitochondriów oraz upośledzoną sygnalizację insulinową [44]. Tego typu deficyty sugerują, że kinaza ATM ma znacznie szerszą rolę niż tylko udział w naprawie uszkodzeń DNA. Obecność tego białka jest konieczna, aby utrzymać równowagę pomiędzy cytoplazmatyczną i jądrową ilością deacetylazy histonowej 4 (HDAC4, ang. histone deacetylase 4). ATM prawdopodobnie hamuje aktywność fosfatazy PP2A, która defosforyluje HDAC4 (Ryc. 2). Brak kinazy ATM powoduje nagromadzenie nieufosforylowanej formy HDAC4, która jest transportowana do jądra, co skutkuje zmianami w ekspresji genów. Powyższy mechanizm może mieć związek z degeneracją móżdżku u osób cierpiących na A-T [45]. Kinaza ATM bierze również udział w aktywacji czynnika transkrypcyjnego MEF2D (ang. myocyte enhancer factor 2D), którego gen ulega ekspresji w neuronach. Udowodniono, że ten czynnik wywiera wpływ na przeżywalność neuronów, ich różnicowanie oraz plastyczność synaptyczną, dlatego powyższe działanie kinazy ATM sugeruje jej potencjał neuroprotekcyjny [46]. Uzyskano przesłanki na udział kinazy ATM w chorobach neurodegeneracyjnych. Jedna z obserwacji dotyczy wzrostu aktywności kinazy ATM i odpowiedzi na uszkodzenia DNA w komórkach kory mózgowej skorelowanych z postępem otępienia u pacjentów cierpiących na AD. Zależność ta może być związana z aktywacją przez komórkę szlaków mających na celu ograniczenie szkodliwego wpływu wolnych rodników oraz zapobieganie powrotom neuronów do fazy mitotycznej [47]. W modelu in vitro choroby Parkinsona zauważono, że aktywacja białka p53 zachodzi za pośrednictwem kinazy ATM, a w efekcie aktywowane zostaje proapoptotyczne białko Puma. Udział kinazy ATM w aktywacji p53 został potwierdzony, przez zastosowanie jej inhibitora (kofeiny), a w efekcie odnotowano spadek poziomu ufosforylowanej formy p53 [48]. W modelu in vitro choroby Parkinsona wykorzystującym MPP+ (ang. 1-methyl-4-phenylpyridinium), zahamowanie funkcji kinazy ATM przy pomocy inhibitora KU55933 zmniejszało toksyczny efekt użytej substancji [50]. Autorzy sugerują, że zaobserwowane działanie neuroprotekcyjne może być związane ze zmniejszeniem aktywności białek proapoptotycznych, będących substratami kinazy ATM [49]. W linii komórkowej pochodzącej z prążkowia, będącej modelem choroby Huntingtona wykazano obniżony poziom ufosforylowanej formy kinazy ATM oraz białka BRCA1 w odpowiedzi na uszkodzenia DNA, w porównaniu do kontroli. Zaburzenie aktywacji tych białek prowadzi do osłabienia odpowiedzi komórkowej na uszkodzenia DNA, co może skutkować śmiercią neuronów [50]. Pomiar cytoplazmatycznego poziomu kinazy ATM ujawnił znaczącą ilość nieufosforylowanej (w pozycji S1981) formy tego białka w komórkach pochodzenia neuronalnego, natomiast takiej zależności nie wykazano dla komórek grasicy, śledziony [51] oraz fibroblastów [52]. Rozbieżność ta jest częściowo tłumaczona zaangażowaniem kinazy ATM w regulacji uwalniania neurotransmiterów w synapsach przez interakcję fizyczną z białkami, takimi jak VAMP2 (ang. vesicle-associated membrane protein 2) oraz synapsyna-i (Ryc. 2). Kinaza ATM poprzez oddziaływanie z tymi białkami bierze udział w dokowaniu pęcherzyków synaptycznych oraz uczestniczy w ich uwalnianiu. Jednakże, wyciszenie genu kodującego kinazę ATM powoduje niewielkie zmiany synaptyczne co dowodzi, że jego rola polega raczej na modulowaniu funkcji synaps niż na kontroli kluczowych procesów takich jak przewodzenie sygnałów i uwalnianie pęcherzyków synaptycznych [51]. Zanotowano również obecność kinazy ATM w pobliżu innych struktur pęcherzykowych, takich jak lizosomy, peroksysomy i endosomy, jednak jej rola w tych organellach nie została jeszcze wyjaśniona [53]. Różnice w wewnątrzkomórkowym rozmieszczeniu kinazy ATM zaobserwowano w przypadku ludzkich komórek Postępy Biochemii 60 (3) 2014 317

nerwiaka zarodkowego (ang. neuroblastoma) SH-SY5Y, będących modelowym układem komórkowym do badań procesów neurotoksyczności i neuroprotekcji [54]. Różnicowanie tych komórek przy pomocy kwasu retinowego pozwala na zahamowanie ich proliferacji oraz przybranie cech fenotypu neuronalnego (np. wydłużone neuryty, synteza markerów neuronalnych) [55]. Wykazano, że poziom cytoplazmatycznej kinazy ATM znacznie wzrasta w neuronalnie zróżnicowanych komórkach SH-SY5Y. Kinaza ta bierze udział w regulacji insulinowego szlaku sygnałowego PI3K/Akt, poprzez fosforylację białka 4E-BP1 (ang. 4E binding protein 1), odpowiedzialnego za regulację translacji białek oraz pośredniczy w pełnej aktywacji białka Akt, co promuje przeżycie komórki (Ryc. 2) [56,57]. Wysoki poziom cytoplazmatycznej kinazy ATM mógłby zatem tłumaczyć zwiększoną oporność komórek zróżnicowanych SH-SY5Y na działanie szeregu czynników toksycznych (np. staurosporyny, doksorubicyny, laktacystyny, MPP+, salsolinolu) [58-60]. Po podaniu insuliny do komórek mięśniowych myszy kinaza ATM pośredniczyła w fosforylacji białka Akt, co skutkowało wzrostem poziomu transportera GLUT4 (ang. glucose transporter type 4) w błonie komórkowej. Transporter ten odpowiada za insulino-zależny pobór glukozy do komórki, a zaburzenia jego działania prowadzą do oporności na insulinę oraz nietolerancji glukozy [61]. Zasadniczym elementem cytoplazmatycznej funkcji kinazy ATM jest jej udział w regulacji stresu oksydacyjnego, który jest przedmiotem intensywnych badań ostatnich lat [62]. Neurony w różnych regionach mózgu wykazują odmienną wrażliwość na stres oksydacyjny zależną od stałego poziomu wolnych rodników w określonych populacjach komórek oraz od ilości produkowanej przez nie energii [5]. O ile w nadmiarze reaktywne formy tlenu (ROS) i azotu (RNS, ang. reactive nitrogen species) są cytotoksyczne, to ich fizjologiczne ilości uczestniczą między innymi w regulacji proliferacji oraz obronie przed patogenami [63]. Biorą one również udział w regulacji szlaków sygnałowych takich jak MAPK (ang. mitogen- -activated protein kinase) czy PI3-K [62]. W komórkach nerwowych ROS wykorzystywane są do przekazywania sygnałów regulujących plastyczność synaps. Natomiast duże ilości wolnych rodników są czynnikiem uszkadzającym komórki nerwowe, na przykład w niedotlenieniu, hipoglikemii i w chorobach neurodegeneracyjnych. W wyniku nadmiernego stresu oksydacyjnego wewnątrz komórki uszkodzeniu ulegają ważne makrocząsteczki, takie jak białka, lipidy oraz DNA [5]. Kinaza ATM może również działać jako czujnik potencjału oksydacyjno-redukcyjnego (Ryc. 2). Wolne rodniki działają bezpośrednio na to białko poprzez utlenienie reszt cysteiny, przez co powstaje aktywny homodimer ATM, połączony kowalencyjnie mostkiem dwusiarczkowym. Proces ten zachodzi bez udziału dwuniciowych uszkodzeń DNA [19]. Zaobserwowano, że kinaza ATM aktywowana przez nadtlenek wodoru fosforyluje p53 oraz Chk2, ale nie H2AX [64]. Białko p53 uczestniczy w regulacji wielu procesów komórkowych, między innymi kontroli potencjału redoks (gospodarki pro- i antyoksydacyjnej), metabolizmu i dynamiki mitochondrialnej oraz modulacji procesów autofagii [65]. Zidentyfikowano również zależne od ATM procesy metaboliczne, które ograniczają ilość wolnych rodników. Jednym z nich jest cykl pentozofosforanowy, który jest źródłem NADPH (ang. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oraz pentoz. NADPH jest ważnym kofaktorem dla enzymów biorących udział w usuwaniu ROS, takich jak reduktaza cytochromu p450 oraz reduktaza glutationowa [66]. Udowodniono również, że kinaza ATM pośrednio hamuje działanie białka mtorc1 (ang. mtor complex 1) w odpowiedzi na stres oksydacyjny co powoduje obniżenie poziomu syntezy protein oraz wzmaga procesy autofagii. Nie jest jednak jasne, czy proces ten prowadzi do przeżycia czy śmierci komórki [67]. Wykazano, że do aktywacji kinazy ATM przez stres oksydacyjny w komórkach o fenotypie neuronalnym konieczny jest receptor błonowy PDGFRB (ang. platelet-derived growth factor receptor β), nie bierze on natomiast udziału w aktywacji kinazy ATM na skutek uszkodzeń DNA. Opisano ponadto, że nadmierna stymulacja komórek kwasem kainowym (agonista jonotropowych receptorów glutaminianergicznych typu nie-nmda) prowadzi do wzrostu poziomu ufosforylowanej formy kinazy ATM w cytoplazmie, co może wiązać się z jej ochronną rolą przed stresem oksydacyjnym [68]. Kinaza ATM ulega również aktywacji niezależnej od DSB w warunkach niedotlenienia. Jest ona wymagana do stabilizacji i fosforylacji białka HIF-1α (ang. hypoxia-inducible factor 1-alpha), powodując zmiany w ekspresji genów zależnych od tego czynnika. W komórkach z usuniętym genem ATM zaobserwowano wzmożoną aktywność HIF- 1α nawet w warunkach normoksji. Efekt ten wywoływał wzrost ekspresji genów zależnych od HIF-1α, takich jak VEGF (ang. vascular endothelial growth factor) czy Glut1 (ang. glucose transporter type 1). Pierwszy z nich koduje białko odpowiedzialne za rozwój sieci naczyń krwionośnych, co może skutkować rozwojem teleangiektazji (jeden z objawów zespołu A-T). Transporter glukozy typu 1 odpowiada za niezależny od insuliny pobór tego węglowodanu do komórek, a jego nadmiar może prowadzić do oporności na insulinę [69]. Pozajądrowa rola kinazy ATM sprowadza się również do jej udziału w prawidłowym funkcjonowaniu mitochondriów [10]. W móżdżkach myszy będących modelem zespołu A-T dochodzi do wzrostu poziomu specyficznej dla mitochondriów dysmutazy ponadtlenkowej (MnSOD, ang. mitochondria-specific superoxide dismutase) oraz wzmożonego oddychania mitochondrialnego [10]. Błędy w funkcjonowaniu tych organelli mogą powodować zwiększoną produkcję wolnych rodników, a co za tym idzie podniesiony poziom stresu oksydacyjnego. Dysfunkcja mitochondriów ma znaczenie w patomechanizmach nowotworów, cukrzycy czy chorób neurodegeneracyjnych, np. chorobie Azheimera, Parkinsona, Huntingtona, stwardnieniu zanikowym bocznym, a również w niedokrwiennym udarze mózgu i urazach mechanicznych [70]. W komórkach z deficytem kinazy ATM zaobserwowano nieprawidłowe funkcjonowanie mitochondriów (Ryc. 2). Stwierdzono w nich błędy w działaniu pierwszego kompleksu łańcucha transportu elektronów, co prowadzi do wzrostu poziomu ROS oraz spadku zawartości ATP. Prawdopodobnie w celu kompensacji niskiej wydaj- 318 www.postepybiochemii.pl