PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 1, str. 97 101 JADWIGA SAWECKA 1, JOANNA SKULIMOWSKA 1, JERZY WINDYGA 2, JERZY KOŚCIELAK 1 Ocena przydatności polimorfizmu dwunukleotydowych powtórzeń w intronach 1 i 24 genu czynnika VIII do wykrywania nosicielstwa hemofilii A An evaluation of the usefulness of dinucleotide repeat polymorphisms in introns 1 and 24 of the factor VIII gene for hemophilia A carrier diagnosis 1 Z Zakładu Biochemii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie Kierownik: Dr nauk biol. Urszula Bany-Łaszewicz 2 Z Kliniki Zaburzeń Hemostazy i Chorób Wewnętrznych Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie Kierownik: Dr n. med. Jerzy Windyga STRESZCZENIE WdroŜono analizę dwunukleotydowego polimorfizmu w intronie 1 i 24 genu czynnika VIII do rozpoznawania nosicielstwa i diagnostyki prenatalnej hemofilii A. Badanie polimorfizmu intronu 1 przeprowadzono u 37 pacjentek, a w intronie 24 u 40. Informatywność metod wynosiła odpowiednio 76% i 58%. Przydatność nowowdroŝonej analizy polimorfizmu dwunukleotydowych powtórzeń wykazano podczas diagnostyki prenatalnej. Po ustaleniu płci płodu (Ŝeński) wykluczono nosicielstwo genu hemofilii A. Analizę polimorfizmów prowadzono z zastosowaniem techniki PCR oraz elektroforezy w natywnym Ŝelu poliakryloamidowym, barwionym srebrem. SŁOWA KLUCZOWE: Wykrywanie nosicielstwa hemofilii A Polimorfizm dwunukleotydowych powtórzeń Technika PCR Barwienie srebrem SUMMARY Analysis of dinucleotide repeat polymorphism in introns 1 and 24 of the factor VIII gene for hemophilia A carrier detection and prenatal diagnosis was performed. Analysis of polymorphism in intron 1 was determined in 37 carriers and in intron 24 in 40 carriers. The informativity of method was 76% and 58%, respectively. The usefulness of the new dinucleotide polymorphism analysis was established during prenatal diagnosis. After determination of sex of a female fetus the carrier status for the hemophilia A gene was excluded. Analysis of polymorphism was done by PCR technique, electrophoresis in native gel and silver staining. KEY WORDS: Hemophilia A carrier detection Polymorphism of dinucleotide tandem repeats Polymerase chain reaction (PCR) Silver staining
98 J. SAWECKA i wsp. WSTĘP Hemofilia A jest przykładem choroby dziedzicznej, w której dopiero wprowadzenie diagnostyki opartej na analizie DNA dało pełny obraz choroby, a co waŝniejsze umoŝliwiło dokładne określenie stanu nosicielstwa i badania prenatalne [1]. Analiza sprzęŝeń genetycznych i bezpośrednie wykrywanie mutacji sprawczych to dwie podstawowe strategie biologii molekularnej stosowane w diagnostyce chorób genetycznie uwarunkowanych. W przypadku hemofilii A identyfikacja mutacji sprawczych jest zadaniem trudnym z uwagi na wielkość [186 kb] i złoŝoność genu czynnika VIII [2]. DuŜa liczba mutacji w lokus genu [ponad 1200] i ich heterogenność [3] sprawia, Ŝe określenie stanu nosicielstwa hemofilii A w rodzinach, w których jeszcze nie wykryto mutacji sprowadza się do analizy sprzęŝeń genetycznych. Wykrycie mutacji sprawczej, poza inwersjami w intronach 22 i 1 [4, 5, 6] wymaga indywidualnego podejścia w badaniu kaŝdej rodziny. W Instytucie Hematologii i Transfuzjologii, jedynej placówce w Polsce, w której są wykonywane badania genetyczne hemofilii A, poza oznaczaniem mutacji, są analizowane trzy polimorfizmy genu czynnika VIII: dwa polimorfizmy dwunukleotydowych powtórzeń w intronach 13 i 22 [7] oraz dimorfizm miejsca restrykcyjnego BclI w intronie 18 genu czynnika VIII [8]. Celem prezentowanej pracy jest wdroŝenie metod oznaczania dwóch polimorfizmów dwunukleotydowych powtórzeń w obrębie intronów 1 i 24 genu czynnika VIII oraz otrzymanie wstępnych danych na temat heterozygotyczności nosicielek. MATERIAŁ I METODY Krew od pewnych nosicielek pochodziła z Zakładu Hemostazy i Zakrzepic Instytutu Hematologii i Transfuzjologii. Materiałem do badania prenatalnego były kosmki trofoblastu. Genomowy DNA izolowano standardowymi metodami [9] z zastosowaniem 6M NaCl do odbiałczania preparatów DNA [10]. Reakcje PCR wykonywano metodą Saiki i wsp. [11]. Jako starterów do powielenia fragmentów DNA uŝyto syntetycznych nukleotydów umoŝliwiających namnoŝenie fragmentów obejmujących dwunukleotydowe powtórzenia w intronach 1 i 24. Do powielenia fragmentu intronu 1 zastosowano startery o następującej sekwencji nukleotydowej: (S intr. 1-1.F) 5 - ATG CAA AAG AAC TGA AAT GGG, (S intr. 1-1.R) 5 - GAC CCT GTA CTT TTA CCA TTG (12). Fragmenty intronu 24 namnaŝano przy uŝyciu starterów o następującym składzie (S intr. 24.F) 5 - AGT CCA AGA TCA AGG GGT AGG, (S intr. 24.R) 5 - CAT CAC ATT CCA GCC TGG ACT (13). Próbki namnoŝonego DNA analizowano metodą elektroforezy natywnej w 12% Ŝelu poliakrylamidowym zawierającym 10% glicerol, po wybarwieniu srebrem. WYNIKI Badanie polimorfizmu intronu 1 przeprowadzono u 37 pewnych nosicielek, a w intronie 24 u 40.W analizowanym materiale informatywność metod wynosiła odpowied-
Ocena przydatności polimorfizmu 99 nio 76% i 58%. Przydatność nowowdroŝonej analizy polimorfizmu dwunukleotydowych powtórzeń wykazano podczas diagnostyki prenatalnej w rodzinie G. W badanej rodzinie analizy polimorfizmu dwunukleotydowych powtórzeń w intronie 22 oraz dimorfizmu miejsca restrykcyjnego BclI w intronie 18 genu czynnika VIII były nieinformatywne ze względu na homozygotyczność cięŝarnej nosicielki. Po wstępnym oznaczeniu płci płodu (Ŝeński) przeprowadzono badania na nosicielstwo genu hemofilii A. Wyniki badań przedstawiono na Ryc. 1, 2. Ryc. 1. Analiza polimorfizmu intronu 1 w rodzinie G, badanie prenatalne. Produkty PCR poddawano elektoroforezie w warunkach natywnych i wybarwiano srebrem. Allele na rycinie oznaczono umownie literami A i B. (0) 123 bp, wzorzec DNA; 1 DNA chorego, ojca nosicielki; 2 DNA cięŝarnej nosicielki, córki chorego; 3 DNA płodu; 4 DNA męŝa nosicielki. Fig. 1. Analysis of dinucleotide repeat polymorphism in intron 1 in family G, prenatal diagnosis. Alleles are marked with letters A and B. PCR products were separated by electrophoresis under native conditions and silver stained. (0) 123 bp, DNA marker; 1 DNA of hemophilic patient, father of carrier; 2 DNA of pregnant carrier, daughter of hemophilic patient; 3 DNA of fetus; 4 DNA of a carrier s husband. Ryc. 2. Analiza polimorfizmu intronu 24 w rodzinie G, badanie prenatalne. Produkty PCR poddawano elektoroforezie w warunkach natywnych i wybarwiano srebrem. Allele na rycinie oznaczono umownie literami A i B. (0) 123 bp, wzorzec DNA, 1 DNA chorego, ojca nosicielki, 2 DNA cięŝarnej nosicielki, córki chorego, 3 DNA płodu, 4 DNA męŝa nosicielki Fig. 2. Analysis of dinucleotide repeat polymorphism in intron 24 in family G, prenatal diagnosis. Alleles are marked with letters A and B. PCR products were separated by electrophoresis under native conditions and silver stained. (0) 123 bp, DNA marker; 1 DNA of hemophilic patient, father of carrier; 2 DNA of pregnant carrier, daughter of hemophilic patient; 3 DNA of fetus; 4 DNA of carrier s husband. W obu analizach u chorego (Ryc.1 i 2, ścieŝka 1) allel oznaczony umownie literą A był sprzęŝony z chorobą. CięŜarna córka chorego, nosicielka (Ryc.1 i 2, ścieŝka 2),
100 J. SAWECKA i wsp. heterozygota, posiadała allel sprzęŝony z chorobą (A) oraz allel sprzęŝony z prawidłowym genem czynnika VIII, oznaczony jako B. W DNA płodu (Ryc.1 i 2, ścieŝka 3) w analizach obu polimorfizmów wykazano obecność prawidłowej postaci allelu niesprzęŝonego z chorobą (B), odziedziczonego od matki. W oparciu o uzyskane wyniki wykluczono nosicielstwo hemofilii A. DYSKUSJA W wielu laboratoriach wykrywanie nosicielstwa i diagnostyka prenatalna hemofilii A opiera się na analizie sprzęŝeń genetycznych z uŝyciem polimorficznych wewnątrzgenowych markerów DNA [14]. Jest to jedyna strategia, która moŝe być wykorzystana w badaniach krewnych pacjentów, u których nie wykryto inwersji w intronach 1 i 22 oraz mutacji po zsekwencjonowaniu całego genu [15]. W naszym laboratorium dotychczas badano trzy polimorfizmy w obrębie intronów 13, 18 i 22 genu czynnika VIII. Łączna analiza tych trzech polimorfizmów pozwoliła na rozpoznanie nosicielstwa u 86% badanych kobiet [7]. W prezentowanej pracy heterozygotyczność w analizowanym materiale wynosiła odpowiednio 76% i 58% dla intronu 1 i 24. W badaniach przeprowadzonych w Korei heterozygotyczność była znacznie niŝsza i wynosiła dla intronu 1 34%, a dla intronu 24 35,2% [13]. RóŜnica ta prawdopodobnie odzwierciedla róŝnice etniczne badanych populacji. Włączenie do badań hemofilii A analizy dwóch dodatkowych wewnątrzgenowych polimorfizmów w obrębie intronów 1 i 24 umoŝliwi diagnostykę prenatalną i wykrywanie nosicielstwa hemofilii A u blisko 100% badanych kobiet. UŜyteczność metody oznaczania polimorfizmów intronów 1 i 24 wykazano w diagnostyce prenatalnej, w rodzinie, w której analizy polimorfizmów intronów 18 i 22 były nieinformatywne. Zaproponowana metoda z zastosowaniem analizy pięciu polimorfizmów w obrębie genu czynnika VIII jest najszybszym i najprostszym rozwiązaniem w diagnostyce genetycznej hemofilii A. Wymaga tylko powielenia odpowiednich fragmentów DNA, przeprowadzenia elektroforezy w warunkach natywnych i wybarwienia prąŝków DNA z uŝyciem srebra. PIŚMIENNICTWO 1. Peyvandi F, Jayandharan G, Chandy M i wsp. Genetic diagnosis of haemophilia and other inherited bleeding disorders. Haemophilia 2006; 12: (supl. 30): 82 9. 2. Gitschier J, Wood WI, Goralka TM i wsp. Characterization of the human factor VIII gene. Nature 1984; 312: 326 30. 3. Haemophilia A Mutation Database (http://europium. csc.mrc.ac.uk) 4. Sawecka J, Skulimowska J, Kościelak J. Mutacje inwersyjne u pacjentów chorych na cieŝką hemofilię A. Acta Hematol Pol 2000; 31: 47-50. 5. Sawecka J, Skulimowska J, Windyga J, Łopaciuk S, Kościelak J. Prevalence of the intron 22 inversion of the factor VIII gene and inhibitor development in Polish patients with severe hemophilia A. Arch Immunol Ther Exp 2005; 53: 352-6. 6. Sawecka J, Skulimowska J, Windyga J, Kościelak J. Inwersja intronu 1 genu czynnika VIII u pacjentów chorych na cieŝką hemofilię A. Acta Hematol Pol 2006; 37: 61-5.
Ocena przydatności polimorfizmu 101 7. Sawecka J, Skulimowska J, Kościelak J. Zastosowanie uproszczonej metody analizy polimorfizmu dwunukleotydowych powórzeń w intronach 13 i 22 genu czynnika VIII do wykrywania nosicielstwa hemofilii A. Acta Hematol Pol 1997; 28: 267-271. 8. Sawecka J, P.Strzyga, A. Klukowska, R. Rokicka- Milewska, J. Kościelak.Diagnostyka nosicielstwa hemofilii A na podstawie analizy wewnątrzgenowego i okołogenowego polimorfizmu genu czynnika VIII. Pol. Arch Med Wew 1995; 94: 425-431. 9. Rolfs A, Schuller I, Finckh U, Weber-Rolfs I. Isolation of DNA from cells and tissue for PCR. PCR Clinical Diagnostics and Research. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg 1992; 79 89. 10. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988; 3: 1215. 11. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S. Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 1988; 239: 489-91. 12. Tizzano E, A. Vencesla, M. Cornet, M. Baena and M. Baiget. Utility of a (GT) n dinucleotide repeat in intron 1 of the factor 8 gene for haemophilia A carrier diagnosis. Haemophilia 2005; 11: 142 4. 13. J.W Kim, S.Y. Park, Y.M.Kim, J.M.Kim, D.J.Kim, H.M.Ryu. Identification of new dinucleotiderepeat polymorphisms in factor VIII gene using fluorescent PCR. Haemophilia 2005; 11: 38-42. 14. Peyvandi F. Carrier detection and prenatal diagnosis of hemophilia in developing countries. Semin Thromb Hemost 2005; 31: 544-54. 15. Klopp N, Oldenburg J, Uen C, Schneppenheim R, Graw J. 11 hemophilia A patients without mutations in the factor VIII encoding gene. Thromb Haemost 2002; 88: 357-360. Praca wpłynęła do Redakcji 01.09.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 16.12.2008 r. Adres do korespondencji: Dr n. przyr. Jadwiga Sawecka Zakład Biochemii, Instytut Hematologii i Transfuzjologii ul. Chocimska 5 00-957 Warszawa tel. 022-8493651 w 128 lub 118 email: jsawecka@ihit.waw.pl