(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 186568 (21) Numer zgłoszenia: 314051 (22) Data zgłoszenia: 3 0.04.1996 (13) B1 (51) IntCl7 C12N 15/12 C12N 15/62 C12N 15/70 C12N 1/21 C07K 14/47 A61K 38/17 A61K 47/48 (54) Homogenne i rekombinowane, biologicznie czynne białka otyłości oraz ich fragmenty, białko fuzyjne, wektor ekspresyjny, sekwencje DNA, organizm gospodarza E. coli, sposób wytwarzania biologicznie czynnego, rekombinowanego ludzkiego białka otyłości i kompozycje farmaceutyczne (30) Pierwszeństwo: 05.05.1995,US,08/435777 07.06.1995,US,08/484629 (73) Uprawniony z patentu: F.HOFFMANN-LA ROCHE AG, Bazylea, CH (43) Zgłoszenie ogłoszono: 12.11.1996 BUP 23/96 (72) Twórcy wynalazku: Arthur Campfield, Verona, US Rene Devos, Oostende, BE Yves Guisez, St-Andries Brugge, BE Pascal S. Bailon, Florham Park, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.01.2004 WUP 01/04 (74) Pełnomocnik: Kossowska Janina, PATPOL Spółka z 0.0. (57) 1. Homogenne, biologicznie czynne ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6 lub jego fragment, który wykazuje biologiczną aktywność tego białka. PL 186568 B1

Homogenne i rekombinowane, biologicznie czynne białka otyłości oraz ich fragmenty, białko fuzyjne, wektor ekspresyjny, sekwencje DNA, organizm gospodarza E. coli, sposób wytwarzania biologicznie czynnego, rekombinowanego ludzkiego białka otyłości i kompozycje farmaceutyczne Zastrzeżenia patentowe 1. Homogenne, biologicznie czynne ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6 lub jego fragment, który wykazuje biologiczną aktywność tego białka. 2. Białko albo jego fragment, według zastrz. 1, znamienne tym, że biologiczna aktywność białka albo fragmentu charakteryzuje się zmniejszeniem ilości przyjmowanego pożywienia u ssaków i zmniejszeniem przyrostu masy ciała u ssaków. 3. Rekombinowane, biologicznie czynne ludzkie białko otyłości wolne od innych białek ssaków obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, lub jego fragment, o biologicznej aktywności tego białka. 4. Białko albo jego fragment, według zastrz. 3, znamienne tym, że jego biologiczna aktywność charakteryzuje się zmniejszeniem ilości przyjmowanego pożywienia u ssaków i zmniejszenia przyrostu masy ciała u ssaków. 5. Wektor ekspresyjny, obejmujący: a) sekwencję promotorową, i b) sekwencję DNA kodującego białko fuzyjne, które obejmuje ludzkie białko ob o Id. Sekw. nr 6, oraz peptyd sygnałowy białka A błony zewnętrznej E. coli, przy czym wektor ten jest zdolny do ekspresjonowania białka fuzyjnego w komórkach gospodarza E. coli. 6. Wektor ekspresyjny, według zastrz. 5, w którym sekwencja promotorową składa się z promotora operatora lac i promotora lipoproteiny. 7. Białko fuzyjne zawierające ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6 oraz peptyd sygnałowy białka A błony zewnętrznej Escherichia coli. 8. Sekwencja DNA zawierająca pierwszą i drugą część, w której: (a) pierwsza część jest sekwencją genu sompa o Id. Sekw. nr 7, kodującą peptyd sompa; i (b) druga część jest sekwencją nukleotydową o Id. Sekw. nr 4 kodującą ludzkie białko ob, pozbawioną części sekwencji nukleotydowej kodującej naturalną sekwencję sygnałową. 9. Organizm gospodarza Escherichia coli transformowany wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 5. 10. Sposób wytwarzania biologicznie czynnego, rekombinowanego ludzkiego białka otyłości, wolnego od innych białek ssaka, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy: a) konstruowanie wektora ekspresyjnego posiadającego sekwencję promotorową oraz sekwencję DNA kodującego białko fuzyjne, które obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 6, oraz peptyd sygnałowy białka A błony zewnętrznej E. coli; b) wprowadzanie wektora ekspresyjnego do komórki gospodarza E. coli w celu jej transformowania; c) ekspresjonowanie białka fuzyjnego w komórkach gospodarza E. coli; i d) działanie na komórkę gospodarza E. coli buforem do zimnego wstrząsu osmotycznego w celu uwolnienia ludzkiego białka ob, wolnego od innych białek ssaka i wolnego od peptydu sygnałowego; oraz e) poddanie płynu osmotycznego zawierającego ludzkie białko otyłości kombinacji następujących procesów: chromatografii kolumnowej anionowymiennej, chromatografii kolumnowej z oddziaływaniem hydrofobowym i filtracji żelowej, w wyniku których otrzymuje się homogenne, biologicznie czynne rekombinowane ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6.

186 568 3 11. Sekwencja ludzkiego genu ob obejmująca Id. Sekw. nr 4. 12. Kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej koniugatów glikolu polietylenowego i/lub glikolu polipropylenowego związanego z ludzkim białkiem ob obejmującym sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, o średnim ciężarze cząsteczkowym jednostek glikolu polietylenowego albo polipropylenowego w koniugacie rzędu od 15000 do 60000. 13. Kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej koniugatów o wzorze I-A, w którym P oznacza ludzkie białko ob obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, n i n' są liczbami całkowitymi, których suma wynosi od 300 do 1500, a średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie od 15000 do 60000, zaś R i R' oznacza niższą grupę alkilową. 14. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że suma n i n' wynosi od około 800 do 1200, zaś średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie 35000 do 45000. 15. Kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej koniugatów o wzorze I-B, w którym P oznacza ludzkie białko ob obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, określone w zastrz. 1 do 4, n jest liczbą od 300 do 1500, średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie od 15000 do 60000, zaś R oznacza niższą grupę alkilową. 16. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że n zawiera się między 850 a 1000, zaś średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie pomiędzy 35000 a 45000. * * * Przedmiotem wynalazku są homogenne i rekombinowane, biologicznie czynne białka otyłości oraz ich fragmenty, białko fuzyjne, wektor ekspresyjny, sekwencje DNA, organizm gospodarza E. coli, sposób wytwarzania biologicznie czynnego, rekombinowanego ludzkiego białka otyłości i kompozycje farmaceutyczne. Otyłość, jak się opisuje, jest najczęstszą chorobą żywieniową w społeczeństwach zachodnich (Zhang, Y., i in., Naturę 372, 425-432 (1994)). Więcej niż trzech na dziesięciu dorosłych Amerykanów waży co najmniej 20% ponad swą masę należną (Zhang, Y. i in., powyżej). Zwiększony ciężar ciała stanowi problem zdrowotny ponieważ jest związany z poważnymi chorobami, jak cukrzyca typu II (tzn. cukrzyca insulinoniezależna), nadciśnienie i hi perlipidemia (Grundy, S.M. i Barnett, Disease-a-Mouth 36, 645-696 (1990)). Istnieją dowody, że masa ciała jest regulowana fizjologicznie zaś otyłość (oraz związane z nią stany czy choroby) spowodowana jest częściowo zaburzeniami tej regulacji (Zhang, Y. i in., powyżej). U gryzoni opisano siedem mutacji pojedynczych genów powodujących fenotyp otyłości, z których pięć występuje u myszy. Spośród tych siedmiu modeli zwierzęcych najintensywniej badana jest mutacja genu obese (ob) u myszy, znaleziona w roku 1950 (Ingalls, A.M. i in., J. Hered. 41, 317-318 (1950)). Myszy homozygotyczne pod względem tej mutacji przejawiają znaczną otyłość, rozwijają cukrzycę typu II, wykazują hiperfagię i hipometabolizm, jako część zespołu przypominającego chorobliwą otyłość u ludzi (Friedman J.M. i in., Genomics 11, 1054-1062 (1991)). Gen ob znajduje się na ramieniu krótszym chromosomu 6 i koduje białko (tzn. białko ob) ulegające ekspresji w tkance tłuszczowej (Zhang, Y. i in., powyżej). Myszy homozygotyczne wytwarzają niewiele białka ob lub nie wytwarzają go wcale i w konsekwencji wykazują zaburzoną regulację masy ciała prowadzącą do otyłości. Mysie lub ludzkie białka ob mogą być podawane pacjentom cierpiącym na skutek defektów lub mutacji w ich genie obese (ob), którego defekty albo mutacje uniemożliwiają albo zakłócają wytwarzanie i/lub funkcję białek ob w modulowaniu masy ciała. Białka te mogą więc być użyte jako substancje o działaniu hormonów, do kontrolowania, zapobiegania albo leczenia otyłości i pokrewnych jej stanów i chorób u ludzi i zwierząt.

4 186 568 W celu zastosowania mysich lub ludzkich białek ob w taki sposób, białka te mogą być podawane we wstrzyknięciach różnymi drogami jak np. dootrzewnowo, dożylnie, domięśniowo czy podskórnie, w częstym podawaniu. Ponieważ są one podawane często we wstrzyknięciach, ważne jest by mysie lub ludzkie białka ob były oczyszczone, najkorzystniej do homogenności, wolne były od zanieczyszczających substancji białkowych, oraz były produkowane drogą ekspresji rekombinacyjnej w rozpuszczalnej i biologicznie czynnej postaci. Jest ogólnie znane osobom praktykującym, że zanieczyszczenia obecne w środkach medycznych do wstrzyknięć mogą często prowadzić do toksycznych działań ubocznych albo niekorzystnych odpowiedzi odpornościowych. Aczkolwiek sekwencja mysiego genu ob została ujawniona przez Zhang Y. i in., powyżej, nie zostały jednak opisane metody ekspresji mysiego białka ob albo jego ludzkiego odpowiednika ani też produkcji tych białek w aktywnej biologicznie i rozpuszczalnej postaci, z której mogą być one oczyszczane do homogenności. Stąd, przedmiotem niniejszego wynalazku jest homogenne, biologicznie czynne ludzkie białko ob oraz sposób jego wytwarzania. W zgłoszeniu opisano również sposób otrzymywanie mysiego białka ob w homogennej, rozpuszczalnej i biologicznie czynnej postaci. Ujawniono, że rekombinowane ludzkie i mysie białka ob mogą ulegać ekspresji w biologicznie czynnej i rozpuszczalnej postaci, a następnie być oczyszczane do homogenności odpowiedniej do wstrzykiwania pacjentom w celu leczenia, zapobiegania albo kontrolowania otyłości i związanych z nią stanów i chorób jak np. cukrzyca typu II, nadciśnienie, hiperlipi demia itp. Tak więc przedmiotem wynalazku jest homogenne ludzkie białko ob, obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, w postaci biologicznie czynnej. Przedmiotem wynalazku jest również fragment białka według wynalazku, który wykazuje biologiczną aktywność tego białka. Korzystnie białko według wynalazku albo jego fragment charakteryzują się aktywnością biologiczną zmniejszającą ilość przyjmowanego pożywienia i przyrost masy u ssaków. Przedmiotem wynalazku jest również rekombinowane, biologicznie czynne ludzkie białko otyłości obejmujące Id. Sekw. nr 6, wolne od innych białek ssaków oraz jego fragment wykazujący biologiczną aktywność tego białka. Korzystnie białko według wynalazku albo jego fragment charakteryzują się aktywnością biologiczną zmniejszającą ilość przyjmowanego pożywienia i przyrost masy u ssaków. Przedmiotem wynalazku jest też wektor ekspresyjny zawierający promotor oraz sekwencję DNA, która koduje białko fuzyjne zawierające dwie części: peptyd sygnałowy białka A błony zewnętrznej E. coli (tzn. sompa) oraz ludzkie białko ob o sekwencji aminokwaso wej o Id. Sekw. nr 6. Wektor według wynalazku jest zdolny do ekspresjonowania białka fuzyjnego w komórkach E. coli. Korzystnie sekwencja promotorową wektora według wynalazku składa się z promotora operatora lac i promotora lipoproteiny. W zakres wynalazku wchodzi też białko fuzyjne obejmujące ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6 oraz peptyd sygnałowy białka A błony zewnętrznej Escherichia coli. Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja DNA zawierająca pierwszą i drugą część, w której: (a) pierwsza część jest sekwencją genu sompa o Id. Sekw. nr 7, kodującą peptyd sompa; i (b) druga część jest sekwencją nukleotydową o Id. Sekw. nr 4 kodującą ludzkie białko ob, pozbawioną części sekwencji nukleotydowej kodującej naturalną sekwencję sygnałową. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka ob według wynalazku obejmujący skonstruowanie wektora ekspresyjnego według wynalazku, a następnie wprowadzenie wektora do komórki gospodarza E. coli w celu jej transformowania i ekspresjonowanie białka fuzyjnego według wynalazku. W sposobie według wynalazku uzyskiwana jest wydajna ekspresja i translokacja białka fuzyjnego do przestrzeni periplazmatycznęj (tzn. pomiędzy wewnętrzną i zewnętrzną błonę komórkową bakterii E. coli), w którym to momencie peptyd sygnałowy jest odcinany od białka ob pozostawiając je w rozpuszczalnej i biologicznie czyn-

186 568 5 nej postaci. Następnym etapem sposobu według wynalazku, jest uwolnienie ludzkiego białka ob w rozpuszczalnej i biologicznie czynnej postaci do bezkomórkowego otoczenia w następstwie działania na komórki E. coli buforem do zimnego wstrząsu osmotycznego. Ostatnim etapem sposobu według wynalazku jest poddanie płynu osmotycznego zawierającego ludzkie białko otyłości kombinacji chromatografii anionowymiennej, chromatografii kolumnowej opartej na oddziaływaniu hydrofobowym i filtracji żelowej, w wyniku których otrzymuje się homogenne, biologicznie czynne rekombinowane ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6. Przedmiotem wynalazku jest też organizm gospodarza transformowany wektorem ekspresyjnym według wynalazku. W niniejszym zgłoszeniu opisano również sposób ekspresji i produkcji mysiego białka ob przy użyciu mysiego genu ob opisanego przez Zhang, Y. i in., powyżej, sekwencję którego stanowi sekwencja nukleotydowa 702 par zasad (bp) oznaczona tu jako Id. Sekw. nr 1. Ta sekwencja mysiego genu ob zawiera 501 bp sekwencji kodującej albo otwartej ramki odczytu (ORF) rozpoczynającej się kodonem startu w pozycji 36 i kończącej się kodonem stop w pozycji nukleotydowej 537 i posiadającej nie ulegające translacji sekwencje na końcach 5' i 3'. ORF zawiera sekwencję sygnałową o długości 63 bp od nukleotydu 36 do 98. Sekwencja mysiego genu ob (Id. Sek. nr 1) koduje mysie białko ob (plus jego sekwencję sygnałową), które stanowi sekwencję aminokwasową o długości 167 aminokwasów i oznaczone jest jako Identyfikator Sęk. Nr 2. W białku tym o Identyfikatorze Sekw. Nr 2 pierwsze 21 aminokwasów stanowi sekwencję sygnałową mysiego białka ob. Dojrzałe mysie białko ob (bez jego sekwencji sygnałowej) rozciąga się od aminokwasu 22 (Val) do aminokwasu 167 (Cys) i przedstawione jest jako Id. Sęk. Nr 3. Wynalazek obejmuje również sekwencję ludzkiego genu ob obejmującą Id. Sekw. nr 4. Sekwencja ludzkiego genu ob jest 690-nukleotydową sekwencją, która może być wykorzystana w sposobie wytwarzania ludzkiego białka ob według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących zawierająca jeden lub więcej koniugatów glikolu polietylenowego i/lub glikolu polipropylenowego związanego z ludzkim białkiem ob obejmującym sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, o średnim ciężarze cząsteczkowym jednostek glikolu polietylenowego albo polipropylenowego w koniugacie rzędu od 15000 do 60000. W zakres wynalazku wchodzi również kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących zawierająca jeden lub więcej koniugatów o wzorze I-A, w którym P oznacza ludzkie białko ob obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, n i n' są liczbami całkowitymi, których suma wynosi od 300 do 1500, a średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie od 15000 do 60000, zaś R i R1oznacza niższą grupę alkilową. Korzystnie suma n i ń wynosi od około 800 do 1200 zaś średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie 35000 do 45000. Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących zawierająca jeden lub więcej koniugatów o wzorze I-B, w którym P oznacza ludzkie białko ob według wynalazku obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, n jest liczbą od 300 do 1500, średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie od 15000 do 60000, zaś R oznacza niższą grupę alkilową. Korzystnie n zawiera się między 850 a 1000 zaś średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego we wspomnianym koniugacie w kompozycji jest w zakresie pomiędzy 35000 a 45000. Zhang Y. i in., powyżej, donosi o ludzkim genie ob jako wysoce homologicznym do mysiego genu ob oraz ujawnia konwencjonalną metodę z użyciem sond oligonukleotydowych dla mysiego genu ob, które mogą być użyte do 1) przesiewania biblioteki cdna klonów uzyskanych z ludzkiej tkanki tłuszczowej, 2) identyfikacji tych klonów zawierających ludzki gen ob, oraz 3) izolacji i sekwencjonowania sekwencji ludzkiego genu ob. Sekwencjonowana

6 186 568 standardowymi metodami sekwencja ludzkiego genu ob posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną w Id. Sekw. nr 4. Podobnie jak w przypadku mysiego genu ob, ludzki gen ob zawiera sekwencję kodującą albo otwartą ramkę odczytu (ORF) długości 501 bp rozpoczynającą się kodonem startu w pozycji nukleotydowej 37 i zakończonej kodonem stop w pozycji nukleotydowej 538 oraz posiadającą nie ulegające translacji sekwencje na końcach 5' i 3'. ORF zawiera sekwencję sygnałową długości 63 bp od nukleotydu 37 do 99. Sekwencja ludzkiego genu ob (Id. Sekw. nr 4) koduje ludzkie białko ob wraz z sekwencją sygnałową, zaś jego sekwencja aminokwasowa przedstawiona została w Id. Sekw. nr 5. Pierwszych 21 aminokwasów tego białka o długości 167 aminokwasów przedstawia sekwencję sygnałową. Dojrzałe ludzkie białko ob (bez sekwencji sygnałowej) rozciąga się od aminokwasu 22 (Val) do aminokwasu 167 (Cys) i przedstawione zostało w Id. Sekw. Nr 6. Zhang Y. i in., powyżej, donosi o 84% identyczności pomiędzy mysim i ludzkim białkiem ob. Zhang Y. i in., powyżej, donosi również o istnieniu odmiany mysiego i ludzkiego białka ob, która to odmiana charakteryzuje się u obu gatunków delecją glutaminy w pozycji 49. Około 30% klonów cdna w bibliotekach uzyskanych z mysiej tkanki tłuszczowej i ludzkiej tkanki tłuszczowej wykazuje brak kodonu 49 (Zhang Y. i in., powyżej). Poniższe określenia posiadają definicje przedstawione poniżej: Mysie białko ob (mob) dotyczy białka o Identyfikatorze Sekw. Nr 3, którego właściwości biologiczne dotyczą leczenia, kontrolowania albo zapobiegania otyłości albo związanych z nią stanów i chorób. W szczególności, mysie białko ob określone jest jako będące każdym białkiem lub polipeptydem posiadającym sekwencję aminokwasowa, która jest istotnie homologiczna z sekwencją aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 3, i dalej wykazuje następujące aktywności biologiczne: 1) Gdy białko albo polipeptyd podawany jest przez wstrzyknięcie do komór mózgu (ICV) głodzonych od 16-18 godzin dojrzałych otyłych myszy ob/ob, posiadających masę ciała przynajmniej 30 gramów, w dawce 20 μg lub mniej, z użyciem metody opisanej przez Haleya i McCormicka, Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15 (1957), białko lub polipeptyd: (a) zmniejszają ilość przyjmowanego pokarmu w 5-godzinnym teście karmienia o 50% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym wstrzyknięto sam nośnik (ED50 dla redukcji ilości przyjmowanego pokarmu) oraz (b) zmniejsza przyrost masy ciała podczas 24 godzin następujących po wstrzyknięciu ICV o 50% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym wstrzyknięto sam nośnik (ED50 dla redukcji przyrostu masy ciała); albo 2) Gdy białko lub polipeptyd podawany jest dootrzewnowo (IP) niegłodzonym dojrzałym myszom ob/ob posiadającym masę ciała przynajmniej 30 gramów dwa razy dziennie: o świcie i ponownie w trzy godziny po zmierzchu, przez tydzień, w dawce całkowitej 20 μg lub mniej, białko lub polipeptyd: (a) zmniejsza 5- i 24-godzinną ilość przyjmowanego pokarmu o co najmniej 20% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym podawano sam nośnik (ED20 dla redukcji ilości przyjmowanego pokarmu) i (b) zmniejsza przyrost masy ciała podczas 24 godzin następujących po pierwszym wstrzyknięciu IP o co najmniej 20% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym podawano sam nośnik (ED20 dla redukcji przyrostu masy ciała). W znaczeniu tu użytym, określenie mysie białko ob obejmuje białka świadomie zmodyfikowane przez, przykładowo, kierowaną mutagenezę albo przypadkowo przez mutacje. Ludzkie białko ob (hob) dotyczy białka o Identyfikatorze Sekw. Nr 6, którego właściwości biologiczne dotyczą leczenia, kontrolowania albo zapobiegania otyłości albo związanych z nią stanów i chorób. W szczególności, ludzkie białko ob określone jest jako będące każdym białkiem lub polipeptydem posiadającym sekwencję aminokwasową, która jest istotnie homologiczna z sekwencją aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 6, i dalej wykazuje następujące aktywności biologiczne:

186 568 7 1) Gdy białko albo polipeptyd podawany jest przez wstrzyknięcie do komór mózgu (ICV) głodzonych od 16-18 godzin dojrzałych otyłych myszy ob/ob, posiadających masę ciała przynajmniej 30 gramów, w dawce 20 μg lub mniej, z użyciem metody opisanej przez Haleya i McCormicka, Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15 (1957), białko lub polipeptyd: (a) zmniejszają ilość przyjmowanego pokarmu w 5-godzinnym teście karmienia o 50% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym wstrzyknięto sam nośnik (ED50 dla redukcji ilości przyjmowanego pokarmu) oraz (b) zmniejsza przyrost masy ciała podczas 24 godzin następujących po wstrzyknięciu ICV o 50% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym wstrzyknięto sam nośnik (ED50 dla redukcji przyrostu masy ciała); 2) Gdy białko lub polipeptyd podawany jest dootrzewnowo (IP) niegłodzonym dojrzałym myszom ob/ob posiadającym masę ciała przynajmniej 30 gramów dwa razy dziennie: o świcie i ponownie w trzy godziny po zmierzchu, przez tydzień, w dawce całkowitej 20 μg lub mniej, białko lub polipeptyd: (a) zmniejsza 5- i 24-godzinną ilość przyjmowanego pokarmu o conajmniej 20% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym podawano sam nośnik (ED20 dla redukcji ilości przyjmowanego pokarmu) i (b) zmniejsza przyrost masy ciała podczas 24 godzin następujących po pierwszym wstrzyknięciu IP o co najmniej 20% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym podawano sam nośnik (ED20 dla redukcji przyrostu masy ciała). W znaczeniu tu użytym, określenie ludzkie białko ob obejmuje białka świadomie zmodyfikowane przez, przykładowo, kierowaną mutagenezę albo przypadkowo przez mutacje. Istotnie homologiczne, co może odnosić się zarówno do sekwencji kwasu nukleinowego jak i do sekwencji aminokwasowej, oznacza, że poszczególna sekwencja, przykładowo, sekwencja zmutowaną, różni się od sekwencji odniesienia jednym lub licznymi podstawieniami, delecjami albo addycjami, których efekt nie powoduje negatywnych funkcjonalnych różnic pomiędzy sekwencją zmutowaną i sekwencją odniesienia. Dla celów niniejszego wynalazku sekwencje posiadające homologię wyższą niż 95%, porównywalne pod względem właściwości biologicznych i charakterystyki ekspresji uważane są za istotnie homologiczne. W celu określenia homologii pominąć należy okrawanie dojrzałej sekwencji. Sekwencje wykazujące niższy stopień homologii, porównywalną aktywność biologiczną i porównywalną charakterystykę ekspresji uważane są za istotne zamienniki. Ogólnie, homologiczne sekwencje DNA mogą być zidentyfikowane przez hybrydyzację krzyżową w standardowych warunkach hybrydyzacji o pośredniej surowości. Fragment mysiego lub ludzkiego białka ob oznacza każde białko albo polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową części lub fragmentu mysiego lub ludzkiego białka ob, i które posiada aktywność biologiczną, odpowiednio, mysiego lub ludzkiego białka ob. Fragmenty obejmują białka albo polipeptydy wytworzone przez degradację proteolityczną mysiego lub ludzkiego białka ob albo wytworzone syntezą chemiczną sposobami rutynowymi w dziedzinie wiedzy. Białko ob lub jego fragment jest biologicznie czynny gdy podanie tego białka lub jego fragmentu ssakowi, włączywszy człowieka, zmniejsza ilość przyjmowanego pokarmu i zmniejsza tempo przyrostu masy ciała ssaka. Określenie tej aktywności biologicznej ludzkiego lub mysiego białka ob może być przeprowadzone konwencjonalnymi, dobrze znanymi testami wykorzystującymi w tym celu jeden lub więcej gatunków ssaków, w szczególności otyłe myszy ob. Kilka spośród tych testów, które mogą zostać wykorzystane do wykazania takiej aktywności biologicznej zostało tu opisanych. W określaniu aktywności biologicznej testem ICV na myszach ob/ob, jak to opisano, ED50 dla zmniejszenia ilości przyjmowanego pożywienia dla ludzkiego lub mysiego białka ob korzystnie wynosi 20 μg lub mniej, zaś ED50 dla zmniejszania przyrostu masy ciała wynosi 20 μg lub mniej. Alternatywnie, w określaniu aktywności biologicznej ludzkiego lub mysiego białka ob w teście IP na myszach ob/ob, jak to opisano, ED20 dla zmniejszenia ilości przyjmowanego pożywienia wynosi 20 μg lub mniej zaś ED20 dla zmniejszenia przyrostu masy ciała wynosi 20 μg lub mniej. Ogólnie, korzystne są fragmenty wykazujące wyżej wspomnianą aktywność biologiczną.

8 186 568 Replikon jest jakimkolwiek elementem genetycznym (tzn. plazmidem, chromosomem, wirusem) działającym jako autonomiczna jednostka replikacji DNA in vivo, tzn. zdolna do replikacji pod swoją własną kontrolą. Wektor ekspresyjny jest replikonem, takim jak plazmid, fag lub kosmid, do którego może być włączony inny segment DNA, tak że prowadzi to do replikacji włączonego segmentu. Obejmuje on jednostkę transkrypcyjna obejmującą połączenie (1) elementu albo elementów genetycznych wykazujących działanie regulacyjne w ekspresji genu, przykładowo, promotorów lub wzmacniaczy, (2) sekwencji strukturalnej lub kodującej, która ulega transkrypcji na mrna i translacji na białko, oraz (3) odpowiednich sekwencji rozpoczynających i kończących transkrypcję. Klon jest grupą cząsteczek DNA uzyskanych z jednej z sekwencji DNA oryginalnej długości i wytworzonych przez bakterie lub wirusy przy użyciu technik inżynierii genetycznej, często z wykorzystaniem plazmidów. Sekwencja sygnałowa jest sekwencją kwasu nukleinowego położoną na początku (koniec 5') sekwencji kodującej białka, które ma być ekspresjonowane. Sekwencja sygnałowa koduje peptyd sygnałowy, położony na końcu N nowopowstającego białka, który powoduje, że komórka gospodarz przenosi białko w kierunku swej błony komórkowej albo przez błonę komórkową, zaś w trakcie tego przenoszenie peptyd sygnałowy jest zwykle odcinany. Kodon startu jest zwykle kodonem ATG położonym w sekwencji kodującej białko, zwykle na końcu 5' i sygnalizuje pierwszy aminokwas w sekwencji białka. Kodon stop jest kodonem nonsensownym położonym w sekwencji kodującej zwykle na końcu 3' sekwencji kodującej białko i sygnalizujący koniec wydłużania łańcucha polipeptydowego. Otwarta ramka odczytu (ORF) jest liniowym szeregiem tripletów kodonów w dwuni ciowym DNA, kodującym sekwencję aminokwasową in vivo i in vitro gdy znajduje się pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulatorowych. Granice ORF wyznaczone są przez kodon startu na końcu 5' i kodon stop na końcu 3'. Może być również określona jako sekwencja kodująca. Sekwencja promotorową jest regionem regulatorowym DNA zdolnym do wiązania polimerazy RNA w komórce i rozpoczynania transkrypcji znajdującej się poniżej (w kierunku 3') otwartej ramki odczytu jednego lub więcej genów strukturalnych, sekwencja promotorową jest zwykle położona na końcu 5' sekwencji kodującej albo otwartej ramki odczytu i rozciąga się w kierunku 5' obejmując minimalną liczbę zasad albo elementów koniecznych do zapoczątkowania transkrypcji polipeptydu w stopniu możliwym do odróżnienia od poziomu tła. Sekwencja kodująca albo ORF znajduje się pod kontrola sekwencji promotorowej gdy polimeraza RNA dokonuje transkrypcji sekwencji kodującej na mrna. Kompozycja zawierająca A (przy czym A oznacza pojedynczy polipeptyd) jest homogenna dla A jeżeli nie zawiera wykrywalnej ilości zanieczyszczających białek albo innych substancji endogennych, wykrywanych standardowymi sposobami, przykładowo, przez barwienie żeli poliakrylamidowych. Dla celów wynalazku, określenie homogenna odnosi się do kompozycji zawierającej pojedyncze białko albo polipeptyd, jeżeli przynajmniej 95% masy kompozycji stanowi te białko albo polipeptyd. Poniższe etapy opisują sposób ekspresji rekombinacyjriej ludzkich lub mysich białek w biologicznie czynnej, bezkomórkowej postaci rozpuszczalnej, wolnej od innych białek ssaczych, z której białka ob mogą być dalej oczyszczane do homogenności. Etapy te są przedstawione szczegółowo w przykładach. 1) Uzyskanie mysiego albo ludzkiego genu ob. cdna (Identyfikator Sekw. Nr 1) kodujący mysie białko ob wraz z jego naturalną sekwencję sygnałową opublikowany został przez Zhang Y., i in., wyżej. Mysie cdna wyizolowano i amplifikowano techniką PCR przy użyciu oligodezoksynukleotydowych starterów w sposób standardowy. Startery DNA i sposoby na ich uzyskanie opisano w Zhang Y., i in., wyżej. cdna (Identyfikator Sekw. Nr 4) według wynalazku, kodujący ludzkie białko ob wraz z jego naturalną sekwencją sygnałową uzyskano przy użyciu tych samych starterów oligodezoksynukleotydowych, które zastosowano w Zhang Y., i in., wyżej. Przy użyciu technik

186 568 9 standardowych ludzkie cdna wyizolowano z biblioteki cdna faga lambda wykonanej z RNA uzyskanego z ludzkiej tkanki tłuszczowej. cdna ludzkiego i mysiego ob można uzyskać nie tylko z bibliotek cdna, ale również innymi standardowymi sposobami np. syntezą chemiczną albo przez klonowanie genomowego DNA lub jego fragmentów, oczyszczanego z odpowiedniej komórki. Procedury te opisano w Sambrook i in., DNA Cloning: A Practical Approach, tom I i n, wyd. D.N. Glover, 1985, MLR Press, Ltd. Oxford, U.K.; Benton i Davies, Science 196, 180-182 (1977) oraz Grunstein i Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965 (1975). W celu uzyskania cdna ludzkiego lub mysiego ob z bibliotek cdna, biblioteki cdna przesiewane są standardowymi technikami hybrydyzacji DNA metodami opisanymi w Benton i Davies, wyżej, albo Grunstein i Hogness, wyżej, przy użyciu starterów wykonanych przez odwrotną transkrypcję poliadenylowanego RNA wyizolowanego z mysich komórek tłuszczowych zawierających mysi gen ob. Klony hybrydyzujące ze starterami analizowane są przez cięcie endonukleazami restrykcyjnymi, elektroforezę na żelu agarozowym i dodatkowymi eksperymentami hybrydy zacyjnymi ( Southern biot ) z użyciem starterów poddanych elektroforezie. Po izolacji kilku klonów hybrydyzujących z mysimi sondami cdna, hybrydyzujący segment jednego z klonów jest wklonowywany i sekwencjonowany standardowymi technikami. Klony uzyskane z genomowego DNA mogą zawierać sekwencje regulatorowe i regiony DNA intronów oprócz regionów kodujących; klony uzyskane z cdna nie zawierają sekwencji intronowych. Podczas klonowania molekularnego genów z genomowego DNA, wytwarzane są segmenty DNA, niektóre zawierające pożądany gen. DNA może być cięty w specyficznych miejscach przy użyciu różnych enzymów restrykcyjnych. Alternatywnie, można użyć DNAzy w obecności manganu w celu pocięcia DNA, albo DNA może zostać rozerwany fizycznie przez, przykładowo, sonikację. Liniowe fragmenty DNA mogą zostać rozdzielone według wielkości standartowymi technikami, obejmującymi choć nie ograniczonymi do elektroforezy na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym oraz chromatografią kolumnową. Niezależnie od źródła, ludzki lub mysi gen ob może być klonowany molekularnie do odpowiedniego wektora przez namnażanie genu metodami znanymi w dziedzinie. Użyty być może każdy z dostępnych w handlu wektorów. Przykładowo, mysie cdna może być wprowadzone do wektora pcdna3, zaś ludzkie cdna może być wprowadzone do wektora pbluescriptsk'. Odpowiednie wektory do zastosowania w gospodarzach bakteryjnych opisane zostały w Pouwels i in., Cloning Yectors: A Laboratory Manual, 1985, Elsevier, N.Y. Jako reprezentatywny choć nie ograniczający przykład, użyteczne wektory do klonowania do zastosowania w bakteriach mogą zawierać marker umożliwiający selekcję i bakteryjny początek replikacji uzyskany z dostępnych w handlu plazmidów, które z kolei uzyskano z dobrze znanego wektora do klonowania pbr322 (ATCC 37017). Takie dostępne w handlu wektory obejmują, przykładowo, pkk223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) i pgeml (Promega Biotec, Madison, Wise., USA). Sekwencje nukleotydowe ludzkiego albo mysiego genu ob wprowadzone do tych dostępnych w handlu wektorów mogą być potwierdzone sposobami znanymi w dziedzinie wiedzy, standardową techniką sekwencjonowania nukleotydów. Inne kwasy nukleinowe kodujące białka ob gatunków innych niż człowiek lub mysz mogą być również użyte. Nawiązując, jeżeli specyficzne DNA sklonowano i sekwencjonowano w odniesieniu do ludzkiego lub mysiego genu ob, potencjalnie każdy zwierzęcy adipocyt może byó użyty jako źródło kwasu nukleinowego białka ob. 2) Konstruowanie wektora ekspresyjnego dla ludzkiego i mysiego białka ob. Mysi albo ludzki gen ob klonowany zgodnie ze sposobami opisanymi powyżej jest użyty do konstruowania wektorów ekspresyjnych dla, odpowiednio, mysiego lub ludzkiego białka ob. Do ekspresji biologicznie czynnego ludzkiego lub mysiego białka ob przez transfekowanego lub transformowanego gospodarza E. coli, oraz do wydzielania białka ob do peripla zmy, może być użyty nowy wektor. Ten wektor ekspresyjny obejmuje promotor i sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne. Białko fuzyjne składa się z dwóch części: pierwsza cześć jest peptydem sygnałowym białka A błony zewnętrznej E. coli (sompa) zaś druga część jest mysim lub ludzkim białkiem ob (pozbawionym ich naturalnych sekwencji sygnałowych). Se-

10 186 568 kwencja DNA kodująca to białko fuzyjne składa się z dwóch części: pierwszej części kodującej peptyd sompa oraz drugiej części kodującej mysie lub ludzkie białko ob (pozbawione ich naturalnych sekwencji sygnałowych). Pierwsza część sekwencji DNA, kodująca peptyd sompa jest sekwencją sygnałową opisaną przez De Sutter i in., Gene 141, 163-170 (1994) i posiada sekwencję nukleotydową Identyfikatora Sekw. Nr 7. Druga część dwuczęściowej sekwencji DNA koduje mysie lub ludzkie białko ob i posiada sekwencję nukleotydową o, odpowiednio, Identyfikatorze Sekw. 1 albo Identyfikatorze Sekw. Nr 4 pozbawionych części sekwencji nukleotydowej kodującej odpowiednią sekwencję sygnałową. Peptyd sygnałowy kodowany przez sekwencję sygnałową sompa o Identyfikatorze Sekw. Nr 7 posiada sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 8 jak opisana przez De Sutter K., i in., wyżej. Nowy wektor ekspresyjny według wynalazku uzyskany jest przez wprowadzenie promotora i sekwencji DNA kodującej białko fuzyjne do standardowego wektora ekspresyjnego odpowiedniego do ekspresji rekombinowanych białek w komórkach gospodarza E. coli. Do konstruowania tego nowego wektora ekspresyjnego według wynalazku może być użyty każdy promotor, o ile jest zdolny do kontrolowania, w komórkach gospodarza E. coli, transkrypcji białka fuzyjnego zawierającego peptyd sompa i białko ob. Jeżeli sompa używany jest jako peptyd sygnałowy, korzystne jest zastosowanie zarówno promotora-operatora lac (POlac) jak i promotora lipoproteiny (Plpp). Inne promotory użyteczne do ekspresji w E. coli obejmują promotor polimerazy RNA T7 opisany przez Studiera i in., J. Mol. Biol., 189, 113-130 (1986), promotor lacz opisany przez Lauera i in., J. Mol. Appl. Genet., 1, 139-147 (1981) i dostępny z American Tissue Type Collection (ATCC) jako ATCC 37121, promotor tac opisany przez Maniatisa w Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor 1982, i dostępny jako ATCC 37138, promotor fosfatazy alkalicznej (phoa) i promotor trp opisany przez Goeddela i in., Nuci. Acids Res. 8, 4057-4075 (1980). Odkryto również inne promotory i zastosowano w E. coli zaś szczegóły dotyczące ich sekwencji nukleotydowej, umożliwiające osobie biegłej ich funkcjonalne ligowanie do wektora ekspresyjnego według wynalazku zostały opublikowane (Siebenlist i in., Celi 20, 269-281 91980). W szczególności, wektor ekspresyjny obejmuje: a) sekwencję promotorową i b) sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne, które to białko obejmuje mysie białko ob o Identyfikatorze Sekw. 3 albo ludzkie białko ob o Identyfikatorze Sekw. 6 oraz peptyd sygnałowy dla białka A błony zewnętrznej E. coli. Następnie, opisany jest sposób konstruowania nowego wektora ekspresyjnego. Sposób ten jest dalej wyszczególniony w przykładach i przedstawiony w figurach 2 i 3. Najpierw, sekwencja kodująca ludzkiego lub mysiego genu ob (pozbawionego jego naturalnej sekwencji sygnałowej) wprowadzona jest do plazmidu zawierającego sekwencję sygnałową sompa, tworząc np. plazmid pt10somparpdi. Plazmid pt10somparpdi i jego konstrukcja i wykonanie opisane zostało w De Sutter i in., wyżej. Wprowadzony do tego plazmidu, ludzki lub mysi gen ob poddawany jest fuzji z genem sompa tworząc w tym plazmidzie sekwencję genu hybrydowego. Gen sompa musi się znajdować powyżej regionu 5' sekwencji kodującej genu ob. Następnie, do plazmidu zawierającego sekwencję genu hybrydowego wprowadzane są promotory, jak to wymieniono powyżej, korzystnie promotor lipoproteiny (Popp) i promotor-operator lac (POlac), tworząc wektor ekspresyjny według wynalazku. Oznaczono dwa wykonania tych wektorów ekspresyjnych jako plppsompa mob i plppsompahobl i przedstawiono, odpowiednio, na figurze 2 i 3. Do skonstruowania takich plazmidów zastosowany być może każdy sposób albo procedura znana w dziedzinie wiedzy. Ponadto, kolejność w której poddaje się fuzji sekwencje sompa i genu ob, wprowadza sekwencje genu do odpowiedniego plazmidu i wprowadza promotor uzyskując wektor według wynalazku, nie jest istotna. Przykładowo, sekwencja genu sompa może zostać początkowo poddana fuzji z sekwencją mysiego lub ludzkiego genu ob bezpośrednio tworząc sekwencję genu hybrydowego a następnie ta sekwencja hybrydowa wprowadzona do plazmidu zawierającego już wprowadzone, odpowiednie promotory.

186 568 11 Jest jednakże konieczne, by sekwencja genu sompa znajdowała się powyżej końca 5' sekwencji mysiego lub ludzkiego genu ob. Przy użyciu tego nowego wektora ekspresyjnego, zaś w szczególności przez zastosowanie sekwencji sygnałowej kodującej sompa, mysie lub ludzkie białko ob może być przeniesione do przestrzeni periplazmatycznej, gdzie peptyd sygnałowy jest odpowiednio odcinany, pozostawiając całe ludzkie lub mysie białko ob, w biologicznie czynnej i rozpuszczalnej postaci. Znajdując się w przestrzeni periplazmatycznej białka ob mogą być efektywnie wydzielane do bezkomórkowego otoczenia wolnego od innych ssaczych białek, po poddaniu komórek gospodarza zimnemu wstrząsowi osmotycznemu, kiedy to białka ob mogą zostać oczyszczone do homogenności w biologicznie czynnej postaci. 3. Ekspresjonowanie ludzkiego albo mysiego białka ob w transformowanych komórkach E. coli. Następnie, wektory ekspresyjne skonstruowane według opisanych wyżej procedur wprowadzane są do komórek gospodarza E. coli w celu transformowania komórek E. coli. Użyty być może każdy szczep E. coli, jak np. E. coli K-12 szczep 294 jak to opisano w Patencie Brytyjskim Nr 2055382 A (ATCC Nr 31446). Inne szczepy użyteczne w nawiązaniu do niniejszego wynalazku obejmują E. coli MC1061 (Casadaban i Cohen, J. Mol. Biol. 138, 179-207 (1980)), E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC Nr 31537) i E. coli W 3110 (ATCC Nr 27325) albo inne szczepy, spośród których wiele jest zdeponowanych i dostępnych w uznanych instytucjach przechowujących mikroorganizmy. Transformowane komórki E. coli namnażane są do odpowiedniej gęstości komórkowej i hodowane standartowymi sposobami. W tak namnażanych i hodowanych transformowanych gospodarzach E. coli, wektory ekspresyjne według wynalazku, wydajnie i efektywnie umożliwiają ekspresję mysich lub ludzkich białek ob oraz przeniesienie tych białek do periplazmy komórek gospodarza E. coli w rozpuszczalnej i biologicznie czynnej postaci. Peptyd sygnałowy sompa (tzn. pierwsza część białka fuzyjnego) odcinany jest podczas przeniesienia białka fu zyjnego do periplazmy dając biologicznie czynne białko ob wolne od innych ssaczych białek czy polipeptydów. Wytworzone drogą rekombinacji ludzkie albo mysie białka ob w rozpuszczalnej biologicznie czynnej postaci w periplazmie transformowanych komórek E. coli są następnie oczyszczane do homogenności. Rekombinowane ludzkie albo mysie białka ob przenoszone do periplazmy komórek, zgodnie z procedurami opisanymi tu, mogą być efektywnie wydzielane poza komórkę przez poddanie komórek gospodarza zimnemu wstrząsowi osmotycznemu sposobem znanym w dziedzinie wiedzy i opisanym przez Koshlanda D. i Botsteina D., Celi 20, 749-760 (1980). Zastosowanie zimnego wstrząsu osmotycznego uwalnia białka ob z komórek E. coli w biologicznie czynnej postaci, wolnej od innych ssaczych białek albo polipeptydów. Ludzkie albo mysie białka ob znajdujące się w płynie osmotycznym w następstwie zimnego wstrząsu osmotycznego transformowanych komórek E. coli, według wyżej opisanych procedur, są biologicznie czynne i mogą być oczyszczane do homogenności przy użyciu kombinacji chromatografii kolumnowej anionowymiennej, chromatografii kolumnowej opartej na oddziaływaniach hydrofobowych i filtracji żelowej. Chromatografia kolumnowa anionowymienna i chromatografia kolumnowa oparta na oddziaływaniach hydrofobowych mogą być przeprowadzone w dowolnej kolejności, jednakże zastosowanie obu musi poprzedzać filtrację żelową. Etap wymiany jonowej może być przeprowadzony standardowymi sposobami. Najkorzystniejszą kolumną do chromatografii anionowymiennej jest kolumna Q Sepharose Fast Flow. Odpowiednie ośrodki do chromatografii anionowymiennej obejmują różne nierozpuszczalne matryce zawierające grupy dietyloaminoetylowe (DEAE) albo dietylo-(2-hydroksypropylo)aminoetylowe (QAE). Matrycą może być akrylamid, agaroza, dekstran, celuloza albo inne rodzaje powszechnie stosowane do oczyszczania białek. Szczególnie użytecznym materiałem do chromatografii anionowymiennej jest DEAE-Sephacel (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Gdy stosowane są ośrodki zawierające grupy DEAE, ekstrakty zawierające mysie albo ludzkie białka ob wprowadza się przy słabo zasadowym ph, np. 8,1. Związane mysie lub

12 186 568 ludzkie białka ob mogą być eluowane w bardziej oczyszczonej postaci przez zastosowanie gradientu soli w odpowiednim buforze, jak Tris-HCl. Ogólnie, charakterystyka gradientu może być określona we wstępnym doświadczeniu polegającym na elucji z użyciem małej ilości rekombinowanego białka. Materiał zawierający ludzkie lub mysie białko ob, uzyskany przez zastosowanie chromatografii anionowymiennej, gdy chromatografia anionowymienna zastosowana jest jako pierwszy etap oczyszczania, poddawany jest następnie chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych jest techniką rozdziału, w której substancje rozdzielane są na podstawie różnicy w sile oddziaływań hydrofobowych z nienałado wanym materiałem złoża zawierającym grupy hydrofobowe. Zwykle, kolumna oddziaływań hydrofobowych jest uprzednio równoważona w warunkach faworyzujących wiązanie hydrofobowe, np. przy wysokiej sile jonowej. Do elucji próbki można stosować malejący gradient soli. Zastosowana być może każda kolumna oddziaływań hydrofobowych. Najkorzystniejszą kolumną oddziaływań hydrofobowych jest fenylo-sepharose, jednakże, butylo-sepharose może być również zastosowana. Według wynalazku, materiał zawierający rekombinowane mysie lub ludzkie białko ob, eluowany z kolumny anionowej, wprowadzany jest do kolumny zawierającej względnie silnie hydrofobowy żel jak fenylo-sepharose. W celu ułatwienia oddziaływań hydrofobowych z hydrofobowym żelem, stosowany jest rozpuszczalnik zawierający, przykładowo, siarczan amonu w stężeniu większym lub równym 0,4 M, przy czym najkorzystniejsze jest stężenie 0,4 M. Tak więc, kolumna i próbka doprowadzona jest do 0,4 M siarczanu amonu w buforze 50 mm Tris i próbka wprowadzona zostaje do kolumny. Kolumnę przemywa się 0,4 M siarczanem amonu jako buforem. Białko ob eluowane jest następnie rozpuszczalnikiem osłabiającym oddziaływania hydrofobowe jak, przykładowo, malejący gradient soli, glikol etylenowy lub propylenowy albo mocznik. Najkorzystniejsze wykonanie obejmuje przemywanie kolumny kolejno buforem Tris oraz buforem Tris zawierającym 20% glikol etylenowy. Białko ob jest następnie eluowane z kolumny gradientem malejącego stężenia siarczanu amonu i rosnącego stężenia glikolu etylenowego w buforze Tris. Skojarzone i kolejne zastosowanie chromatografii anionowymiennej i chromatografii kolumnowej oddziaływań hydrofobowych, w dowolnej kolejności, pozwala uzyskać rutynowo mysie albo ludzkie białko ob o czystości 90%. Etap filtracji żelowej następuje po chromatografii anionowymiennej i chromatografii kolumnowej oddziaływań hydrofobowych przedstawionych powyżej, i może być wykonany dowolną procedurą filtracji żelowej. Białko ob eluowane z kolumny oddziaływań hydrofobowych albo kolumny anionowymiennej, niezależnie, która została zastosowana ostatnio, może być stężone i dializowane do małych objętości przez zastosowanie błony o progu rozdzielczym równym ciężarowi cząsteczkowemu 10000 (błona Amicon YM10). Stężony materiał może być wprowadzony do kolumny zawierającej ośrodek do filtracji żelowej jak Sephadex G100 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Białko ob może być następnie oddzielone od innych zanieczyszczeń na podstawie swego ciężaru cząsteczkowego standartową techniką z użyciem SDS-PAGE. Skojarzone i kolejne zastosowanie chromatografii anionowymiennej, chromatografii kolumnowej oddziaływań hydrofobowych i filtracji żelowej pozwala rutynowo uzyskać ludzkie albo mysie białko ob o czystości 95%. N-końcowe sekwencjonowanie aminokwasów oczyszczonego mysiego lub ludzkiego białka ob może być wykonane sposobami znanymi w dziedzinie wiedzy np. przez elektrotransfer według metody Laemli, U.K., Naturę 227, 680-685 (1970) albo procedurami opisanymi przez Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262, 10035-10038 (1987). Może być również wykonane sekwencjonowanie wewnętrzne metodami znanymi w dziedzinie wiedzy. Przykładowo, przez trawienie prążka M (na nitrocelulozie) endoproteinazą Lyzine C mogą być wytworzone fragmenty peptydowe a następnie rozdzielone przez układ HPLC. Aktywność biologiczna oczyszczonych ludzkich białek ob według wynalazku lub mysich białek ob przejawia się w tym, że częste podawanie białka ob przez wstrzyknięcie pacjentom lub myszom powoduje zmniejszenie przyjmowanej ilości pokarmu oraz zmniejszonym przybieraniem na wadze w porównaniu z nienastrzykiwanymi lub kontrolnymi grupami osobników.

186 568 13 Aktywność biologiczna ludzkich lub mysich białek ob, lub ich fragmentów, uzyskanych i oczyszczonych według wynalazku, może być badana rutynowymi metodami, np. przez powtarzane albo pojedyncze wstrzyknięcie do komór mózgu (ICV) myszy ob/ob według procedur Haleya, T. J., i in., powyżej, jak to opisano szczegółowo w przykładach 13 i 16. W oparciu o ten test ICV, może być oznaczona ED50 dla zmniejszenia ilości przyjmowanego pożywienia i ED50 dla zmniejszenia przyrostu masy ciała. Dodatkowo, przez powtarzane wstrzyknięcia IP myszom ob/ob, jak to szczegółowo opisano w przykładzie 15, może być określona aktywność biologiczna oczyszczonego ludzkiego lub mysiego białka ob lub jego fragmentów. W oparciu o test IP, może być oznaczona ED20 dla zmniejszenia ilości przyjmowanego pożywienia i ED20 dla zmniejszenia przyrostu masy ciała. Aktywność biologiczna ludzkich białek ob albo ich fragmentów według wynalazku, wytworzonych i oczyszczonych sposobem według wynalazku może być również oznaczona u ludzi sposobami znanymi w dziedzinie wiedzy, np. przez pomiar zmniejszenia przyjmowania posiłku testowego w następstwie podania IV białka ob badanemu osobnikowi otyłemu w porównaniu z podaniem IV kontrolnego roztworu soli, w oparciu o metodę Muurahainen, N.E., i in., Am. J. Physiol. 260, 672-680 (1991), i opisaną szczegółowo w przykładach 14 i 17. Ewentualnie, zdolność oczyszczonego mysiego lub ludzkiego białka ob, według wynalazku, do zmniejszania przyrostu masy ciała (np. do powodowania utraty masy ciała) może być określona przez powtarzane wstrzyknięcia IV otyłym osobnikom badanym w oparciu o metodę Drenta, M.J., Int. J. Obesity 19,221-226 (1995), jak to opisano szczegółowo w przykładzie 18. Ludzkie białka ob, według wynalazku, oczyszczone sposobem według wynalazku posiadają aktywność biologiczną przejawiającą się tym że: 1) Gdy białko albo polipeptyd podawany jest przez wstrzyknięcie do komór mózgu (ICV) głodzonych od 16-18 godzin dojrzałych otyłych myszy ob/ob, posiadających masę ciała przynajmniej 30 gramów, w dawce 20 μg lub mniej, z użyciem metody opisanej przez Haleya i McCormicka, Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15 (1957), białko lub polipeptyd: (a) zmniejszają ilość przyjmowanego pokarmu w 5-godzinnym teście karmienia o 50% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym wstrzyknięto sam nośnik (ED50 dla redukcji ilości przyjmowanego pokarmu) oraz (b) zmniejsza przyrost masy ciała podczas 24 godzin następujących po wstrzyknięciu ICV o 50% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym wstrzyknięto sam nośnik (ED50 dla redukcji przyrostu masy ciała); albo 2) Gdy białko lub polipeptyd podawany jest dootrzewnowo (IP) niegłodzonym dojrzałym myszom ob/ob posiadającym masę ciała przynajmniej 30 gramów dwa razy dziennie: o świcie i ponownie w trzy godziny po zmierzchu, przez tydzień, w dawce całkowitej 20 jxg lub mniej, białko lub polipeptyd: (a) zmniejsza 5- i 24-godzinną ilość przyjmowanego pokarmu o co najmniej 20% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym podawano sam nośnik (ED20 dla redukcji ilości przyjmowanego pokarmu) i (b) zmniejsza przyrost masy ciała podczas 24 godzin następujących po pierwszym wstrzyknięciu IP o co najmniej 20% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym podawano sam nośnik (ED20 dla redukcji przyrostu masy ciała). Dodatkowo, owe zmniejszenie masy ciała i ilości przyjmowanego pożywienia występuje już w dawkach poniżej 20μ g lub mniej, przy podawaniu ICV nawet w dawkach rzędu 1 μg lub mniej, zwłaszcza gdy białka te oczyszczone są do homogenności. Testy biologiczne opisane powyżej, i wyszczególnione w przykładach, do określania aktywności biologicznej ludzkich i/lub mysich białek ob mogą być zastosowane do określenia aktywności biologicznej fragmentów tych białek, zarówno gdy fragmenty te wytworzono przez trawienie proteolityczne białek ob, jak i przez syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowanego białka na podstawie częściowej sekwencji DNA dla białka ob czy jakąkolwiek inną metodą znaną w dziedzinie wiedzy. Ludzkie białko ob według wynalazku można sprzęgać z homopolimerami glikolu polietylenowego lub glikolu polipropylenowego, które mogą być niepodstawione lub podstawione