Pracownia analizy instrumentalnej i spektroskopii molekularnej Makrokierunek Inżynierii Nanostruktur Uniwersytetu Warszawskiego. Semestr zimowy 2012/2013 Zastosowanie spektroskopii FT-IR oraz techniki wymiany izotopowej H/D do badania przemian strukturalnych w kolagenie Cel Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z zastosowaniami spektroskopii FT-IR oraz zjawiskiem wymiany izotopowej H/D w badaniach struktury i stabilności białek. W ramach ćwiczenia analizowane są widma absorpcyjne w podczerwieni mieszanin H 2 O/D 2 O, oraz cienkich filmów kolagenu i żelatyny. Spektroskopia białek w podczerwieni Bogactwo i różnorodność grup i wiazań chemicznych występujących w białkach sprawia, iż ich widma wibracyjne (zarówno absorpcyjne jak i Ramana) pełne są nakładających się, i przeze to trudnych w interpretacji pasm. Samo wiązanie peptydowe (Rys. 1) jest źródłem dziewięciu pasm spektralnych (tzw. pasma amidowe I, II, VII, oraz A i B), spośród których tylko pasma A i B związane są z ze zlokalizowanymi drganiami, podczas gdy drgania odpowiedzialne za pasma amid I..VII są drganiami złożonymi. C N O H Rys. 1. Wiązanie peptydowe wraz z niektórymi elementarnymi drganiami odpowiedzialnymi za pojawienie się pasm amid I i amid A. W kontekście badań spektroskopowych ważne jest, iż nawet subtelne różnice w sprzężeniach i oddziaływaniach wewnątrzmolekularnych, jakie są uwarunkowane typem struktury II-rzędowej białka znajdują swe odzwierciedlenie w położeniu i kształcie niektórych pasm amidowych. Z tego względu obecność takich elementów strukturalnych białek jak α-helisa, β- kartka, czy kłębek statystyczny pociąga za sobą pojawienie się charakterystycznych składowych tych pasm, w szczególności w obszarze amid I i amid III - aktywnych zarówno w widmach absorpcyjnych w podczerwieni jak i w widmach ramanowskich. Tabela 1. Najbardziej użyteczne diagnostycznie pasma amidowe białek i ich orientacyjne położenia. 1
Band Frequencies range [cm -1 ] Assignment Amide A 3300 sterching N-H Amide B 3100 sterching N-H in the Fermi resonance with the first overtone of amide II Amide I 1600-1690 sterching C=O, bendig N-H, sterching C-N Amide II 1480-1580 Sterching C-N, bendig N-H Amide III 1220-1300 sterching C-N, bendig N-H Na Rys. 2 przedstawiono jak powolna, wywołana wysoką temperaturą przemiana konformacyjna α-helisy w antyrównoległą β-kartkę w modelowym polipeptydzie wpływa na położenie i kształt najważniejszego diagnostycznie z tych pasm, jakim jest pasmo amid I. Typowe zakresy częstości amid I odpowiadające różnym strukturom II-rzędowym zostały zebrane w Tabeli 2. α-helisa β-kartka 1720 1700 1680 1660 1640 1620 1600 Liczba falowa [cm -1 ] Rys. 2. Widma absorpcyjne w podczerwieni zakres pasma amid I przedstawiają stopniową przemiane konformacji α-helisy w antyrównoległą β-kartkę w poli(l-lizynie). Zastosowanie spektroskopii w podczerwieni do badań białek napotyka jednak na poważny problem gdy białko jest rozpuszczone w wodzie, ponieważ pik amid I jest wówczas zakryty znacznie silniejszym pasmem pochodzącym od drgań deformacyjnych H-O-H (ok. 1650 cm -1 ). Dwa sposoby pokonania tej przyszkody to (a) zastosowanie spektroskopii Ramana (pasmo H-O-H jest praktycznie niewidoczne w widma ramanowskich), lub (b) zamiana H 2 O na D 2 O (pasmo D-O-D jest przesuniete do ok. 1230 cm -1 ). 2
Tabela 2. Typowe położenia pasma amid I dla różnych struktut II-rzędowych białek. Amide I location [cm -1 ] Secondary structure 1650 α-helix 1632 β-sheet parallel dublet 1620 (s) i 1690 (w) β- sheet antyparallel 1655 random coil 1680 loop, β-hairpin Wymiana H/D Umieszczenie polipeptydu w środowisku wody ciężkiej pociąga za sobą dodatkowe konsekwencje, z których najistotniejsza wiąże się z tzw. wymianą izotopową H/D (deuterowaniem próbki). Atomy wodoru tworzące wiązania kowalencyjne z atomami elektroujemnych pierwiastków (w przypadku białek dotyczy to głównie tlenu i azotu) ulegają ciągłej, dynamicznej wymianie między sobą, co można obserwować podstawiając część z tych atomów innym izotopem. Proces ten biegnie z reguły bardzo szybko (w skali ułamków sekundy), i w zależności od natury chemicznej biorących w nim udział grup chemicznych (np. wodoru w wiązaniu peptydowym i deuteru w D 2 O) przebiega według różnych mechanizmów, i może być katalizowany zarówno przez jony H 3 O +, jak i OH -, co sprawia, że jego kinetyka silnie zależy od ph (pd). Wymiana H/D biegnie oczywiście w kierunku najbardziej prawdopodobnego rozkładu obu izotopów pomiędzy różnymi molekułami w układzie. Na przykład gdy C 2 H 5 OH zostanie wprowadzony do nadmiaru równomolowej mieszaniny H 2 O i D 2 O w roztworze pojawią się zbliżone liczby molekuł C 2 H 5 OH i C 2 H 5 OD (atomy wodoru połączone z atomami węgla nie ulegają wymianie). Proces wymiany izotopowej można śledzić wszelkimi metodami, które są czułe na masy jąder (a więc m.in. spektroskopią absorpcyjną w podczerwieni i Ramana), masy całych czasteczek (spektrometria mas) i na inne zmieniające się wraz z zamianą izotopu tego samego pierwiastka właściwości fizyczne (np. właściwości magnetyczne jąder atomowych przy pomocy spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego, czy też różne trwałości tych jąder (np. para H i T) metodami radioizotopowymi). W przypadku białek rozpuszczonych w D 2 O wymianie ulegają wszystkie atomy wodoru, które tworzą wiązania z elektroujemnymi atomami (a więc atomy wodoru wiązań peptydowych, aminokwasowych reszt bocznych takich jak NH 2, -COOH, -OH, -CONH 2, etc.) pod warunkiem, że są dostępne dla rozpuszczalnika. Tak więc pierwsze ulegają wymianie protony zlokalizowane na powierzchni cząsteczki białka, a później te ukryte w jego głębi, co ilustruje Rys. 3a. Im stabilniejsza i silniej upakowana struktura III-rzędowa białka tym wolniej zachodzi penetracja jego molekuł przez wodę ciężką i tym wolniej przebiega proces wymiany H/D. Deuteracja białka będzie w różnym stopniu przesuwać (ale zawsze w kierunku niższych energii) poszczególne pasma amidowe 3
w zależności od tego, jaką rolę odgrywa w danym drganiu masa atomu wodoru. I tak podstawienie białka deuterem w pozycji wiązania peptydowego przesuwa pasmo amid I jedynie o 5-10 cm -1 (pasmo to jest zdominowane przez drgania rozciągające C=O), ale o około 100 cm -1 pasmo amid II, w którym zginające drgania N-H mają duży udział. Pasmo amid A jest natomiast przesuwane o kilkaset cm -1. Zróżnicowany wpływ wymiany H/D na pasma amid I i amid II przedstawia Rys. 3b. (a) (b) O C N H O C N D Amidowe I + D 2 O HDO Amidowe II 1800 1700 1600 1500 1400 1300 Liczba falowa [cm -1 ] Rys. 3. (a) Powolna penetracja molekuły białka przez wodę jest najwolniejszym etapem procesu wymiany H/D. Wymienialne atomy wodoru zlokalizowane na powierzchni białka pierwsze wchodzą w kontakt z wodą ciężką i jako pierwsze ulegaja podstawieniu deuterem. (b) Deuteracja białka w różnym stopniu wpływa na przesunięcie pasm amidowych I i II. Przedstawione widma odpowiadają kolejnym etapom wymiany H/D pomiędzy włóknami insuliny wołowej a wodą ciężką, w której zostały zawieszone. Opisu ilościowego wpływu podstawienia izotopowego na położenie pasma wibracyjnego można w najprostrzy sposób dokonać stosując model oscylatora harmonicznego: podstawienie izotopowe zmienia masę zredukowaną, ale pozostaje praktycznie bez wpływu na stałą siłową. Jedno z głównych zastosowań wymiany H/D w badaniach białek wiąże się z faktem, iż upakowanie struktur III-rzędowych (spowalniajace deuterację) zależy od temperatury, ciśnienia, obecności czynników denaturujących, takich jak mocznik, czy też destabilizujących mutacji punktowych. Szybsza wymiana H/D jest obserwowalna już na przy lekkiej destabilizacji białka (np. w temperaturze nieco niższej od temperatury denaturacji), tj. w warunkach, w których wciąż 4
stabilne pozostają struktury II-rzędowe (a zatem nie obserwowane są jeszcze jakiekolwiek zmiany w obszarze pasma amid I). Kolagen i żelatyna Wymiana H/D oraz spektroskopia w podczerwieni mogą być wykorzystane do badania utraty zwartości konformacyjnej, jaka następuje w toku przemiany kolagenu w żelatynę. Kolagen jest jednym z najważniejszych białek strukturalnych tkanek łącznych o dość nietypowej konformacji. Podstawowym II-rzędowym motywem włókien kolagenowych jest potrójna helisa zbudowana z trzech oplatających się ze sobą łańcuchów polipeptydowych o takiej samej, powtarzającej się sekwencji aminokwasowej: glicyna, prolina, hydroksyprolina. Helisa włókien kolagenowych jest w przeciwieństwie do α-helisy lewoskrętna, nieco od niej luźniejsza, i ma zupełnie inny układ wiązań wodorowych. We włóknach kolagenu sąsiednie helisy są ze sobą miejscami kowalencyjnie połączone (via crosslink), co pozwala na budowanie bardzo elastycznych, a przy tym wytrzymałych superstruktur. Wielogodzinna inkubacja kolagenu w wysokiej temperaturze i silnie denaturującym środowisku niszczy jego strukturę, czego końcowym efektem jest powstanie żelatyny. Proces ten ilustruje Rys. 4. Rys. 4. Przemiana kolagenu w żelatynę wiąże się z nieodwracalnym zniszczeniem struktury potrójnej helisy. Wykonanie ćwiczenia: 1. Na pojedyncze szkiełko CaF 2 nanieść, a następnie wysuszyć bardzo cienką warstwę roztworu żelatyny w H 2 O. Zarejestrować widmo FT-IR otrzymanego filmu. Po rejestracji pierwszego widma nakroplić nań D 2 O i po krótkiej inkubacji ponownie wysuszyć, po czym zarejestrować widmo. 2. Powtórzyć operacje opisane w punkcie 1 stosując roztwór żelatyny w D 2 O, oraz H 2 O do nakraplania na film białka. 3. Przygotować zawiesinę kolagenu w H 2 O poprzez ok. 20 minutowe energiczne rozcieranie szczypty liofilizowanego białka z wodą w moździerzu. Kilka kropli zawiesiny należy nanieść na pojedyncze szkiełko CaF 2, a następnie przygotować cienki, suchy i w miarę możliwości jednorodny film w celu późniejszej rejestracji widm FT-IR przed i po nakraplaniu H 2 O. 5
4. Powtórzyć operacje opisane w punkcie 3 stosując zawiesinę kolagenu w D 2 O, oraz późniejsze zwilżanie za pomocą H 2 O. Opracowanie wyników i ich dyskusja: Wskaż pasma amid I, II, III oraz A w widmie niedeuterowanej żelatyny. Jak bardzo proces deuteracji wpływa na przesunięcia spektralne tych pasm? Przeprowadź dyskusję obserwowanych efektów w kontekście natury drgań związanych z poszczególnymi pasmami. Czy natywny kolagen przechodzi proces wymiany H/D w podobnym do żelatyny stopniu? Jak wytłumaczyć obserwowane różnice w świetle odmiennych struktur kolagenu i żelatyny? Wymagania kolokwialne: 1)Ogólne podstawy spektroskopii molekularnej - formy energii molekuł - kwantowanie energii - rozkład energii w stanie równowagi termicznej - prawdopodobieństwo absorpcji i emisji promieniowania - rodzaje spektroskopii 2)Widmo oscylacyjne - model oscylatora harmonicznego; oscylator anharmoniczny - energia oscylacji molekuł - rodzaje drgań normalnych - oddziaływanie promieniowania z oscylującymi molekułami - aparatura do rejestracji widm oscylacyjnych - zastosowanie spektroskopii oscylacyjnej Literatura 1) Zbigniew Kęcki "Podstawy spektroskopii molekularnej" Wydawnictwo Naukowe PWN lub Joanna Sadlej "Spektroskopia molekularna" Wydawnictwa Naukowo-Techniczne 2) Artykuły i materiały dodatkowe- dostępne u prowadzącego Oprac. dr hab. Wojciech Dzwolak 6