RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211661 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 379395 (51) Int.Cl. A23L 1/052 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 06.04.2006 (54) Suplement dietetyczny posiadający profilaktyczne właściwości przeciwnowotworowe (43) Zgłoszenie ogłoszono: 15.10.2007 BUP 21/07 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.06.2012 WUP 06/12 (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL (72) Twórca(y) wynalazku: JÓZEF OLEKSYSZYN, Siechnice, PL LESZEK PURZYC, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Halina Winohradnik PL 211661 B1
2 PL 211 661 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest suplement dietetyczny posiadający profilaktyczne właściwości przeciwnowotworowe, oparty na naturalnych związkach. Chemioterapia i radioterapia stosowane w leczeniu chorób nowotworowych są metodami, których skutki uboczne bywają niebezpieczne dla zdrowia pacjenta. Komórki nowotworowe, szczególnie te, które są odporne na radioterapię czy chemioterapię, na skutek mutacji genetycznych utraciły zdolność do apoptozy. Apoptoza, inaczej genetycznie programowana śmierć komórki jest naturalnym procesem na drodze którego wielokomórkowy organizm pozbywa się nieustannie, niepotrzebnych lub uszkodzonych komórek. Komórki rakowe niezdolne do apoptozy są szczególnie odporne na leki przeciwnowotworowe. Taka odporność często jest indukowana podczas chemoterapii. O wiele skuteczniej można zwalczać choroby nowotworowe poprzez zapobieganie im poprzez odpowiednią dietę, co zostało opisane między innymi w publikacji Manson, MM., et.al, Recent Results Cancer Res., 2005, 166, 257. Za efekty te odpowiedzialne są naturalne związki zawarte w roślinnych produktach żywnościowych, co zostało obszerniej omówione w publikacji Cao G., et.al. Am. J. Clin. Nutr., 1998, 68, 1081. Znany ze zgłoszenia międzynarodowego PCT/EP96/00739 preparat odżywczy zawiera w swoim składzie naturalne związki występujące w produktach żywnościowych, takie jak kazeina, glicyna, alanina lub seryna, w połączeniu z olejem lnianym lub rybnym oraz z np. z drożdżami. W publikacji Leu T.H., et.al., Curr. Med. Chem. Anti-Canc. Agents. 2002, 2, 557 opisano cały szereg antyrakowych własności kurkuminy (E-100), zbadanych in vivo i in vitro. Generalnie, w badaniach in vitro, kurkumina indukuje apoptozę komórek rakowych przy stężeniach 20-40 mikromoli. Jest również efektywnym inhibitorem angiogenezy in vivo co zostało opisane w Arbiser, J.H., et.al, Mol Med. 1998, 4, 376. Była sugerowana jako efektywna terapia dla raka prostaty w publikacji Dorai T., et.al. Mol. Urol 2000, 4 1). Jako związek zdolny zapobiegać indukcji choroby nowotworowej w wielu modelach zwierzęcych została przedstawiona w publikacji Surh, Y.J., Food, Chem. Toxicol, 2002, 40, 1091; Deshpande S.S., et.al, Cancer Lett, 1997, 118, 79; Cheng, A.L., et.al, Anticancer Res., 2001, 21, 2895. W publikacji Gribel N.V., et.al, Vopr. Onkol, 1990, 36, 704; Rao, C.V., Cancer Res., 1993, 53, 1482 opisano własności przeciwrakowe estru 2-fenyloetyłowego kwasu kawowego (CAPE), występującego w kicie pszczelim i miodzie. Watabe M., et.al, J. Biol Chem., 2004, 279, 6017 przedstawia przydatność tego związku do indukcji apoptozy komórek raka piersi (MCF-7), poprzez inhibicje aktywacji nuklearnego faktora kappab. W publikacji Chen, Y.J., et. al, J. Agric. Food Chem., 2001, 49, 5615 opisano przydatność CAPE do indukcji apoptozy komórek (HL-60) ludzkiej leukemii. W modelach zwierzęcych, jak to wynika z publikacji Liao, H.F., et.al, J. Agric. Food Chem., 2003, 51 7907; Nagaoka T., et.al, Biol Pharm. Buli, 2003, 26, 638; Carrasco-Legleu CE., et. al, Int. J. Cancer 2004, 108, 488, CAPE hamuje angiogenezę i przerzutowanie nowotworów. Aplikowany lokalnie zapobiega powstawaniu i wzrostowi tkanek nowotworowych (Orsolic N., et.al., Biol. Pharm. Bull., 2005, 28, 1928). Własności przeciwrakowe posiada 3,3'-Diindolylometan (DIM) z publikacji Chang X., et. al, Carcinogenesis 2005, 26, 771 wiadomo, że już przy stężeniach na poziomie 5 mikromoli inhibituje angiogenezę i wzrost ludzkiego raka piersi, wszczepionego myszom. Mechanizm działania jako skomplikowany i różnorodny opisano w publikacji Kim Y.S., et. al, J. Nutr. Blochem., 2005, 16, 65. Obejmuje on indukcje apoptozy u komórek rakowych poprzez inhibicję aktywacji nuklearnego faktora kappb (Rahman K.W., et. al., Nutr. Cancer 2004, 48, 84; Rahman K.W., et. al., Cancer Res., 2005, 65, 364). Znane są lecznicze właściwości betuliny i kwasu betulinowego, a w publikacji Sarek J., et. al., Bioorg. Med. Chem., 2005,15, 4196 opisano, że indukuje apoptozę różnych komórek rakowych przy stężeniach 5-10 mikromoli. Betulina jest składnikiem wielu naturalnych preparatów leczniczych opartych na ekstraktach z kory brzozy białej np. sok brzozowy. Przeciwrakowe własności kwercetyny-flawanoidu występującego w wielu owocach i jarzynach są dobrze znane. Z publikacji Nair H.K., et. al, Clin. Diagn. Lab. Immunol, 2004, 11, 63 wynika, że przy stężeniach 50 i 100 mikromoli kwercetyna inhibituje wzrost kolonii komórek raka prostaty i przy takich samych stężeniach indukuje apoptozę komórek raka prostaty, co zostało opisane w Vijayababu M.R., et. al, J. Cancer Res. Clin. Oncol, 2005, 131 765. Suplement dietetyczny według wynalazku jest mieszaniną naturalnych związków roślinnych obejmującą kurkuminę, ester 2-fenyloetylowy kwasu kawowego, 3,3'-Diindolylometan, betulinę, kwercetynę, która jest flawanoidem występującym w wielu owocach i jarzynach oraz ester dodecylowy kwasu galowego.
PL 211 661 B1 3 Istotę wynalazku stanowi suplement dietetyczny zawierający 5-40% wagowych kurkuminy, 5-40% wagowych estru 2-fenyloetylowego kwasu kawowego (CAPE), 5-45% wagowych 3,3'-Diindolylometanu (DIM), 5-45% wagowych betuliny, 5-40% wagowych kwercetyny i 5-40% wagowych galanu dodecylu. Dokładnie zmieszane składniki aktywne suplementu, aplikuje się w syropie uzyskanym z jednej części objętościowej miodu i z jednej części objętościowej oleju oliwkowego z pierwszego tłoczenia z udziałem typowych dodatków stabilizujących emulsję, takich jak skrobia, stearynian magnezu, octan celulozy, celuloza hydroksypropylometylową i podobne, stosowanych pojedynczo lub w mieszaninie. Suplement nadaje się również do aplikacji w postaci kapsułek zawierających korzystnie 30 mg zawiesiny składnika aktywnego w kapsułce. Alternatywnie mieszaninę składników aktywnych suplementu miesza się z olejem rybnym, wzbogaconym w kwasy omega-3-nienasycone i aplikuje w postaci kapsułek. Zmieszane dokładnie składniki aktywne suplementu, w postaci homogennej stałej mieszaniny, o wyglądzie proszku o złocistym kolorze aplikuje się również w postaci tabletek, po zmieszaniu z standartowymi środkami pomocniczymi, stosowanymi pojedynczo lub w mieszaninie, wybranymi z grupy obejmującej, sacharozę, skrobię, stearynian magnezu, talk, parafinę, laktozę, skrobię zżelatynizowaną, kwas askorbinowy, celulozę hydroksypropylometylową, glikol propylenowy, dwutlenek tytanu (E-171), dwutlenek krzemu, ftalany octanu celulozy, poliwinylopirolidon, żelatynę, laurylosiarczan sodowy lub sorbinian potasu. Korzystnie tabletka o masie 80 mg zawiera 40 mg mieszaniny. Wszystkie składniki nowego suplementu występują w naturalnych produktach żywieniowych. Kurkumina, mająca masę cząsteczkową 368.39 jest żółtym barwnikiem o własnościach przeciwutleniacza (E-100) i występuje w przyprawie korzennej - turmeric", która jest głównym składnikiem kuny. Ester 2-fenyloetylowy kwasu kawowego CAPE, mający masę cząsteczkową 284.3 jest aktywnym składnikiem kitu pszczelego i naturalnego miodu pszczelego. 3,3'-Diindolylometan, mający masę cząsteczkową 266 (DIM) jest produktem dimeryzacji naturalnego indolylo-3-karbinolu występującego w kapuście, brokułach, kalafiorach i brukselce. Indolylo-3-karbinol w kwaśnych warunkach, jakie występują w ludzkim żołądku, spontanicznie dimeryzuje do DIM, który jest substancją aktywną. Betulina, mająca masę cząsteczkową 456.7 jest roślinnym triterpenoidem występującym w wielu roślinach, a izolowanym głównie z kory brzozy białej, gdzie jej zawartość jest od 4 do 25%. Kwercetyna jest flawanoidem występującym w wielu owocach i jarzynach. Z przeprowadzonych badań in vitro, wynika, że zastosowanie mieszaniny kurkuminy, CAPE, DIM, betuliny, kwercetyny, galanu dodecylu, według wynalazku do różnego typu komórek rakowych, w tym również komórek opornych na chemoterapeutyki, hamuje wzrost tych komórek na drodze indukcji apoptozy przy stężeniach 0.5-3 mikromola. Są to stężenia znacznie niższe niż wymagane dla poszczególnych substancji. Występuje tu efekt synergiczny, który nie jest oczywisty i nie mógł być przewidziany w świetle istniejących danych literaturowych. Udział galanu dodecylu (E-312), który to ester ma przeciwbakteryjne własności w składzie nowego suplementu pozwala na utrwalenie i wydłużenie terminu przydatności produktu. I tak mieszanina składająca się z 400 mg kurkuminy, 400 mg CAPE, 200 mg DIM, 400 mg betuliny, 300 mg kwercetyny i 300 mg galanu dodecylu hamowała wzrost komórek rakowych w 50% przy stężeniu ok. 2 mikromoli. Suplement dietetyczny według wynalazku służy do zapobiegania chorobom nowotworowym, a optymalna jednorazowa dawka dla dorosłej osoby wynosi 30-50 mg suplementu, co stanowi jedną tabletkę lub drażetkę lub jedną małą łyżeczkę syropu dziennie. Zaletą suplementu jest fakt, że specyficznie indukuje apoptozę komórek rakowych, nie uszkadzając komórek zdrowych jest przy tym absolutnie nietoksyczny. Populacja ludzka przez tysiąclecia spożywała produkty roślinne zawierające te związki, stąd też pewność, że nie dają one jakichkolwiek niepożądanych skutków ubocznych. Przedmiot wynalazku został objaśniony w przykładach wykonania, które w żaden sposób nie ograniczają składu suplementu według wynalazku. P r z y k ł a d 1 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera równomolową mieszaninę następujących składników: 368.38 gramów kurkuminy, 284.3 gramów estru 2-fenyloetylowego kwasu kawowego (CAPE), 266 gramów 3,3'-Diindolylometanu (DIM), 457,7 gramów betuliny, 338.6 gramów kwercetyny i 338.45 gramów galanu dodecylu. Dokładnie zhomogenizowaną mieszaninę o wyglądzie proszku o złocistym kolorze w ilości 50 gramów miesza się z 500 ml płynnego miodu i 500 ml oleju z oliwek z pierwszego tłoczenia oraz octanem celulozy, jako dodatkiem stabilizującym emulsję. Sugerowana dawka - mała łyżeczka syropu dziennie. Z przeprowadzonych badań in vitro, wynika, że zastosowanie
4 PL 211 661 B1 równomolowej mieszaniny kurkuminy:cape:dim:betuliny:kwercetyny:galanu dodecylu do różnego typu komórek rakowych, w tym również komórek opornych na chemoterapeutyki, daje efekt synergiczny w hamowaniu wzrostu tych komórek. P r z y k ł a d 2 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 20% wagowych (400 mg) kurkuminy, 20% (400 mg) wagowych CAPE, 10% (200 mg) wagowych DIM, 20% wagowych (400 mg) betuliny, 15% wagowych (300 mg) kwercetyny i 15%) wagowych (300 mg) galanu dodecylu. Po zmieszaniu z sacharozą, parafiną, skrobią zżelatynizowaną i kwasem askorbinowym sporządza się tabletki. Tabletka o masie 75 mg zawiera 38 mg mieszaniny. Efekt hamowania wzrostu komórek rakowych uzyskano w 50% przy stężeniu ok. 2 mikromoli. P r z y k ł a d 3 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 25% wagowych kurkuminy, 20% wagowych CAPE, 15% wagowych betuliny, 10% wagowych DIM, 5% wagowych kwercetyny i 5% wagowych galanu dodecylu. Po zmieszaniu z skrobią, stearynianem magnezu, laktozą, i glikolem propylenowym, uzyskuje się drażetkę, zawierającą 30 mg składników aktywnych w jednej drażetce. P r z y k ł a d 4 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 25% wagowych kurkuminy, 15% wagowych CAPE, 15% wagowych betuliny, 15% wagowych DIM, 15% wagowych kwercetyny i 15% wagowych galanu dodecylu. Po zmieszaniu z talkiem, skrobią zżelatynizowaną i sorbinianem potasu uzyskuje się tabletkę o masie 80 mg zawiera 40 mg mieszaniny. P r z y k ł a d 5 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 20% wagowych kurkuminy, 15% wagowych CAPE, 15% wagowych betuliny, 15% wagowych DIM, 15% wagowych kwercetyny i 20% wagowych galanu dodecylu. Po zmieszaniu z dwutlenkiem krzemu, ftalanem octanu celulozy, poliwinylopirolidonem i laurylosiarczanem sodowym uzyskuje się drażetki. P r z y k ł a d 6 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 25% wagowych kurkuminy, 20% wagowych CAPE, 15% wagowych betuliny, 15% wagowych DIM, 15% wagowych kwercetyny i 10% wagowych galanu dodecylu. Po zmieszaniu z talkiem, celulozą hydroksypropylometylową, dwutlenkiem tytanu (E-171) i żelatyną uzyskuje się drażetkę. P r z y k ł a d 7 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 30% wagowych kurkuminy, 10% wagowych CAPE, 15% wagowych betuliny, 20% wagowych DIM, 20% wagowych kwercetyny i 10% wagowych galanu dodecylu. Mieszaninę aplikuje się w syropie uzyskanym z jednej części objętościowej miodu i z jednej części objętościowej oleju oliwkowego z pierwszego tłoczenia z dodatkiem stabilizującym emulsję w postaci skrobi. P r z y k ł a d 8 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 30% wagowych kurkuminy, 10% wagowych CAPE, 20% wagowych betuliny, 5% wagowych DIM, 25% wagowych kwercetyny i 10% wagowych galanu dodecylu. Mieszaninę aplikuje się w syropie uzyskanym z jednej części objętościowej miodu i z jednej części objętościowej oleju oliwkowego z pierwszego tłoczenia z dodatkiem stabilizującym emulsję w postaci skrobi. P r z y k ł a d 9 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 40% wagowych kurkuminy, 10% wagowych CAPE, 10% wagowych betuliny, 10% wagowych DIM, 10% wagowych kwercetyny i 20% wagowych galanu dodecylu. Mieszaninę rozpuszcza się w jednej części objętościowej miodu i z jednej części objętościowej oleju oliwkowego dodatkiem stabilizującym w postaci stearynianu magnezu i aplikuje w postaci kapsułek zawierających 30 mg zawiesiny w kapsułce. P r z y k ł a d 10 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 15% wagowych kurkuminy, 15% wagowych CAPE, 20% wagowych betuliny, 20% wagowych DIM, 5% wagowych kwercetyny i 15% wagowych galanu dodecylu. Mieszaninę rozpuszcza się w oleju rybnym, wzbogaconym w kwasy omega-3-nienasycone z dodatkiem stabilizującym emulsję w postaci, octanu celulozy i aplikuje w postaci kapsułek zawierających 30 mg zawiesiny w kapsułce.
PL 211 661 B1 5 P r z y k ł a d 11 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 10% wagowych kurkuminy, 10% wagowych CAPE, 30% wagowych betuliny, 30% wagowych DIM, 25% wagowych kwercetyny i 5% wagowych galanu dodecylu. Mieszaninę aplikuje się jak w przykładzie 7, z tą różnicą, że jako dodatek stabilizujący emulsję stosuje się octan celulozy. P r z y k ł a d 12 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 30% wagowych kurkuminy, 10% wagowych CAPE, 20% wagowych betuliny, 10% wagowych DIM, 10% wagowych kwercetyny i 20% wagowych galanu dodecylu. Mieszaninę aplikuje się jak w przykładzie 11, z tą różnicą, że jako dodatek stabilizujący celulozę hydroksypropylometylową. P r z y k ł a d 13 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 20% wagowych kurkuminy, 10%) wagowych CAPE, 20% wagowych betuliny, 10% wagowych DIM, 30% wagowych kwercetyny i 20% wagowych galanu dodecylu. Aplikowany jest jak w przykładzie 1. P r z y k ł a d 14 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 10% wagowych kurkuminy, 10% wagowych CAPE, 10% wagowych betuliny, 40% wagowych DIM, 15% wagowych kwercetyny i 15% wagowych galanu dodecylu. Aplikowany jest jak w przykładzie 2. P r z y k ł a d 15 Suplement dietetyczny jako składnik aktywny zawiera 20% wagowych kurkuminy, 25% wagowych CAPE, 20% wagowych betuliny, 5% wagowych DIM, 20% wagowych kwercetyny i 10% wagowych galanu dodecylu. Aplikowany jest jak w przykładzie 3. Właściwości przeciwnowotworowe suplementu dietetycznego według wynalazku, zostały przetestowane na liniach komórek nowotworowych, wywodzących się ze szczególnie opornych klinicznie na chemioterapię guzów - raka trzustki (EPP181/85P) czerniaka (MeWo-) i żołądka. Badania przeprowadzono na parentalnych liniach wymienionych komórek oraz na następujących ich wariantach opornych na cytostatyki: - EPP181/85 RDB - oporne na daunorubicyne - EPPl81/85 RNOV - oporne na novantron (1) - EPG257/85RDB - oporne na daunorubicyne - EPG257/85RDB - oporne na novantron (2) - MeWoCis - oporne na cisplatyne - MeWoFote - oporne na fotemustyne - MeWoEto - oporne na etopozyd - MeWoVin - oporne na vindesyne (3) Hodowlę komórek prowadzono w standardowych warunkach w medium L-15, zawierającym 10% FCS, ImM L-glutaminy, 6.25 mg/l fetuiny, 80 IE/l insuliny, 2.5 mg/l transferyny, 1 g/l glukozy, 1.1 g/l NaHCO 3, 1% podstawowych witamin i 20 000 kie/l trazylolu w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO 2 w temperaturze 37 C. TESTY CYTOTOKSYCZNOŚCI Komórki z badanych linii były nakładane w ilości 800 sztuk do dołków płytek 96-dołkowych. Następnie były hodowane przez dwa dni w medium. Po dwóch dniach do poszczególnych dołków zostały dodane badany suplement w różnych stężeniach (0.1-5 mikromoli, zakładając pozorną masę cząsteczkową mieszaniny 342.07, co jest średnią z mas cząsteczkowych składników) w celu określenia wartości IC 50 dla każdego ze związków. Po trzech dniach inkubacji komórki zostaną utrwalone za pomocą lodowatego 10% kwasu trójchlorooctowego przez 1 godzinę w temperaturze 4 C. Następnie płytki były 5 razy płukane w wodzie, a potem barwione przez dodanie 100 μl do każdego dołka 0.4%) roztworu SRB (Sigma, St. Louis, MO, USA) w 1% kwasie octowym w temperaturze pokojowej. Nadmiar barwnika został usunięty przez pięciokrotne płukanie w 1% kwasie octowym. Po suszeniu w temperaturze pokojowej i dodaniu do każdego dołka 300 μl 10 mm Tris-HCl (ph=8.0) odczytano absorbancję przy długości fal 562 nm w czytniku Elisa-Reader (EL 340 Microplate Bio Kinetics Reader, BIO-TEK Instruments, Winooski, VT, USA) (4). Mieszaniny w stężeniach 0.5 do 3 mikromoli hamują w 50% wzrost wyżej wymienionych komórek rakowych.
6 PL 211 661 B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Suplement dietetyczny posiadający profilaktyczne właściwości przeciwnowotworowe, oparty na naturalnych związkach roślinnych, znamienny tym, że zawiera 5-40% wagowych kurkuminy, 5-40% wagowych estru 2-fenyloetylowego kwasu kawowego (CAPE), 5-45% wagowych 3,3'-Diindolylometanu (DIM), 5-45% wagowych betuliny, 5-40% wagowych kwercetyny i 5-40% wagowych galanu dodecylu. 2. Suplement, według zastrz. 1, znamienny tym, że dokładnie zmieszane składniki aktywne suplementu aplikowane są w syropie uzyskanym z jednej części objętościowej miodu i z jednej części objętościowej oleju oliwkowego z pierwszego tłoczenia, z udziałem dodatków stabilizujących emulsję, zwłaszcza skrobii, stearynianu magnezu, octanu celulozy oraz celulozy hydroksypropylometylowej. 3. Suplement, według zastrz. 1, znamienny tym, że składniki aktywne suplementu miesza się z olejem rybnym, wzbogaconym w kwasy omega-3-nienasycone i aplikuje w postaci kapsułek. 4. Suplement, według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że aplikowany jest w postaci kapsułek zawierających 30 mg zawiesiny w kapsułce. 5. Suplement, według zastrz. 1, znamienny tym, że zmieszane dokładnie składniki aktywne, aplikuje się w postaci tabletek, po zmieszaniu z standartowymi środkami pomocniczymi, wybranymi z grupy obejmującej, sacharozę i/lub skrobię i/lub stearynian magnezu i/lub talk i/lub parafinę i/lub laktozę i/lub skrobię zżelatynizowaną i/lub kwas askorbinowy i/lub celulozę hydroksypropylometylową i/lub glikol propylenowy i/lub dwutlenek tytanu (E-171) i/lub dwutlenek krzemu i/lub ftalan octanu celulozy i/lub poliwinylopirolidon i/lub żelatynę i/lub laurylosiarczan sodowy i/lub sorbinian potasu. 6. Suplement, według zastrz. 5, znamienny tym, że tabletka zawiera co najmniej 30 mg mieszaniny składników aktywnych. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)