Badanie asocjacyjne wybranych polimorfizmów genów

4 Badanie asocjacyjne wybranych polimorfizmów genów kandydujących w DHD ssociation study of selected candidate genes polymorphisms in DHD gnieszka Słopień 1, Monika DmitrzakWęglarz 1,2*, Filip Rybakowski 1, Natalia Pytlińska 1, Renata Komorowska-Pietrzykowska 1, nna ndrzejewska 1, omasz Wolańczyk 3, neta R. Borkowska 4, ndrzej Rajewski 1, Joanna Hauser 2 Wiadomości Psychiatryczne 12 (3): 4122 *equal contribiution 1 Klinika Psychiatrii Dzieci i Młodzieży, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu; kierownik: prof. dr hab. ndrzej Rajewski 2 Pracowna Diagnostyki Laboratoryjnej i enetycznej UM w Poznaniu, kierownik: prof. dr hab. J. Hauser 3 Klinika Psychiatrii Wieku Rozwojowego UM w Warszawie, kierownik: prof. dr hab. omasz Wolańczyk 4 Zakład Psychologii Klinicznej i Neuropsychologii UMS w Lublinie, kierownik: prof. dr hab. nna Herzyk dres do korespondencji/ ddress for correspondence: Dr n. med. gnieszka Słopień Klinika Psychiatrii Dzieci i Młodzieży ul. Szpitalna 27/33 60-572 Poznań tel. 061 841 358, 061 841 531 fax. 061 8480 32 e-mail: asrs@wp.pl Praca została sfinansowana z projektu MNiSW 2P05E 131 2 Streszczenie Zespół nadpobudliwości psychoruchowej (DHD) jest jednym z najczęściej występujących zaburzeń wśród dzieci i młodzieży, o wysokiej odziedziczalności. hociaż udział czynników genetycznych jest istotny, uzyskiwane wyniki są nadal niejednoznaczne. el pracy: elem prezentowanych badań było porównanie częstości występowania genotypów i alleli wybranych polimorfizmów genów, DRD3, DRD4, D, OM oraz BDNF u pacjentów z DHD. Osoby badane: Badaniem objęto 205 pacjentów w wieku 7-17 lat z rozpoznaniem DHD postawionym przez dwóch niezależnych psychiatrów na podstawie kryteriów diagnostycznych ID oraz DSMIV. rupa kontrolna liczyła 155 zdrowych osób obojga płci w wieku 717 lat. Rodzice osób uczestniczących w badaniu oraz one same wyraziły świadomą zgodę na udział w badaniu. Projekt badań uzyskał akceptację Komisji Bioetyki przy UM w Poznaniu. Metoda: Oznaczenia genetyczne dla polimorfizmów typu SNP wykonano metodą iplex old przy zastosowaniu systemu Sequenom. rs180055 genu DRD4 analizowano techniką PR-RLFP. Badany polimorfizm VNR genu D analizowano metodą PR-VNR. Wyniki: W pracy stwierdzono istotną statystycznie różnicę w występowaniu allelu (p<0,05) polimorfizmu (SNP rs180047) genu pomiędzy grupą pacjentów z DHD a grupą kontrolną. Stwierdzono też znamiennie częstsze występowanie homozygoty (Val/Val) genu BDNF w podtypie DHD z przewagą zaburzeń koncentracji uwagi w porównaniu z podtypem z przewagą nadruchliwości i impulsywności. Wnioski: Wyniki niniejszych badań mogą wskazywać na niewielką rolę polimorfizmu w etiologii DHD oraz na modyfikację obrazu choroby poprzez polimorfizm genu BDNF. Słowa kluczowe: DHD, genetyka, etiologia,, BDNF Summary ttention-deficit/hyperactivity disorder (DHD) is a common psychiatric disorder among children and adolescents with high heritability. lthough a genetic contribution to higher risk of DHD is evident, predisposing genetic determinants remain largely unknown despite extensive research. im: he aim of the study was the assessment of genotypes and alleles of, DRD3, DRD4, D, OM and BDNF polymorphisms in patients with DHD. Subjects: We studied 205 patients aged 717 years old diagnosed with DHD according to ID and DSM IV criteria. ontrol group consisted of 155 healthy subjects aged 717 years. he parents and patients gave written informed consent to this study. he study was approved by Ethical ommittee. Methods: he SNPs in genes were analyzed by iplex old method using Sequenom system. he DRD4 gene polymorphism rs180055 was analyzed by PR-RFLP method. he D gene VNR polymorphism of was analyzed by PR-VNR method. Results: We obtained statistically significant differences in the frequency of allele of gene (SNP rs180047) (p<0,05) between DHD and healthy controls. We observed (Val/Val) genotype of BDNF gene statistically more frequent in the subgroup with inattentive type than in the subgroup with hyperactive/impulsive type of DHD. onclusion: he results of the present study suggest that SNP rs180047 in gene may be related to the pathogenesis of DHD. However, this effect seems to be weak and the polymorphism of BDNF gene may modify clinical symptoms of DHD. Key words: DHD, genetics, etiology,, BDNF Wiadomości Psychiatryczne, tom 12, nr 3, lipiecwrzesień 200

5 Wstęp Rozpowszechnienie zespołu nadpobudliwości psychoruchowej (attention-deficit hyperactivity disorder, DHD) w populacji ogólnej wynosi 3%, co powoduje, że jest on jednym z najczęstszych dziecięcych zaburzeń psychicznych. Badania populacyjne wskazują na rolę czynników genetycznych w etiologii tego zespołu, z odziedziczalnością w zakresie od 60 do 0% [1]. Badania biochemiczne oraz farmakologiczne wskazują na związek DHD z nieprawidłowościami układu dopaminergicznego, noradrenergicznego, serotoninergicznego i glutaminergicznego. Dlatego badaniom podlegają geny kodujące enzymy syntetyzujące lub rozkładające odpowiednie neuroprzekaźniki, neuromodulatory oraz geny kodujące ich transportery i receptory. Zainteresowanie badaczy wzbudzają też białka zaangażowane w procesy rozwoju ośrodkowego układu nerwowego (neurorozwojowa hipoteza powstawania zaburzeń psychicznych). Neurorozwojowa hipoteza powstawania zaburzeń psychicznych postuluje nieprawidłowości rozwoju mózgu, których podłożem mogą być zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe, wpływające na ekspresję genów odpowiedzialnych za jego rozwój. Wielu badaczy uważa, że DHD należy do chorób o złożonej etiologii, w której istotny jest zarówno udział czynników genetycznych (w tym kilku a nawet kilkunastu genów) oraz czynników środowiskowych. Jednak nadal stosunkowo niewiele wiadomo na temat ich wzajemnego oddziaływania. Jedną z metod wykorzystywanych w badaniach genetycznych jest analiza genu kandydującego. Polega ona na wybraniu a priori genu, który zgodnie z hipotezą patogenezy choroby mógłby mieć z nią związek. W badaniach tych porównuje się częstość występowania określonych alleli danego genu w grupie osób chorych i zdrowych. Dany allel może mieć związek z chorobą, gdy występuje znacznie częściej u osób chorych. naliza asocjacji jest stosowana w przypadku genów o małym wpływie na badany fenotyp i stąd jej duża przydatność w badaniach chorób wielogenowych. el pracy elem prezentowanych badań było porównanie częstości występowania genotypów i alleli wybranych polimorfizmów genów, DRD3, DRD4, D, OM oraz BDNF (tab. 1) w całej grupie pacjentów z DHD i w grupie kontrolnej, a także w poszczególnych podgrupach pacjentów z DHD wyodrębnionych na podstawie kryteriów diagnostycznych klasyfikacji DSM-IV. Materiał i metody Osoby badane Badaniem objęto 205 niespokrewnionych pacjentów polskiego pochodzenia w wieku 7z17 lat z rozpoznaniem DHD. Rozpoznanie zostało postawione przez dwóch niezależnych psychiatrów na podstawie kryteriów diagnostycznych ID oraz DSMIV w Przyklinicznej Poradni Psychiatrycznej oraz w Klinice Psychiatrii Dzieci i Młodzieży UM w Poznaniu, a także w Klinice Psychiatrii Wieku Rozwojowego UM w Warszawie. Średnia wieku chorych wynosiła,±2,7 lat. W badanej grupie 147 pacjentów spełniało kryteria podtypu mieszanego DHD (podtyp 3; średnia wieku:,6±2,5 lat), 45 podtypu z przewagą zaburzeń koncentracji uwagi (podtyp 1; średnia wieku: 12,0±2, lat) oraz 13 podtypu z przewagą nadruchliwości i impulsywności (podtyp 2; średnia wieku:,1±2, lat). rupa kontrolna liczyła 155 zdrowych osób obojga płci w wieku 717 lat o tym samym pochodzeniu etnicznym (średnia wieku:,3±2,3 lat) i składała się z dzieci uczęszczających do jednej z poznańskich szkół podstawowych oraz jednego z poznańskich gimnazjów. Osoby te nie były spokrewnione z pacjenta- abela 1. Informacje dotyczące badanych polimorfizmów en SNP ID Pozycja chromosomowa llele Lokalizacja Informacje dodatkowe rs180047 chr: 2776038 / ekson rs177 chr: 2851462 : 2851463 ins/del promotor -141 ins/del DRD3 rs6280 chr3: 5373505 / ekson Serly DRD4 rs180055 chr: 626784 / promotor -521/ D rs27072 chr5: 1447522 / 3 UR D rs46337 chr5: 1484164 / intron D VNR / powtórzeń motywu 40pz 3 UR OM rs4680 chr22: 18331271 / ekson Val(8)158Met BDNF rs6265 chr : 2763642 / ekson 16=Val66Met Wiadomości Psychiatryczne, tom 12, nr 3, lipiecwrzesień 200

6 mi, nie miały rozpoznanych zaburzeń psychicznych, a wśród krewnych I stopnia (rodzice i rodzeństwo) nie stwierdzano obciążeń zaburzeniami psychicznymi. Informacje uzyskano na podstawie wywiadu wypełnianego przez rodziców. Nie oceniano stanu psychicznego osób z grupy kontrolnej. Kryterium wykluczającym z obu badanych grup było istnienie udokumentowanych organicznych uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego oraz poważnych zaburzeń somatycznych, stosowanie farmakoterapii mogącej wpływać na zachowanie i funkcje poznawcze oraz współistniejąca schizofrenia i choroba afektywna dwubiegunowa. Opiekunowie prawni, pacjenci oraz osoby z grupy kontrolnej udzielili pisemnej zgody na udział w badaniu. Projekt badań uzyskał akceptację Komisji Bioetyki przy UM w Poznaniu i stanowi element projektu KBN dotyczącego badania asocjacyjnego genów kandydujących w DHD z wybranymi funkcjami poznawczymi oraz czynnikami klinicznymi. Metoda enomowy DN został wyizolowany z leukocytów krwi obwodowej metodą wysalania wg Millera i wsp. [2]. Oznaczenia genetyczne dla polimorfizmów typu SNP wykonano metodą iplex old przy zastosowaniu systemu Sequenom w Katedrze enomiki Uniwersytetu w Bonn. Wykorzystana metoda umożliwiła wykorzystanie systemów zrobotyzowanych i inspekcję jakości oznaczeń (kontrola pozytywna 1,5%, negatywna 1,5% oraz duplikaty prób 1,5%). naliza wykorzystywana w systemie Sequenom jest oparta o multipleksową reakcję PR i spektrometrię mas [3]. rs180055 genu DRD4 analizowano techniką PR-RLFP. mplifikacji poddano rejon promotora genu DRD4 [4]. Badany polimorfizm VNR genu D analizowano metodą PR-VNR. harakteryzuje się on zmienną liczbą powtórzeń tandemowych (VNR) w 3 -nieulegającym translacji (3 -UR) rejonie genu. Pojedynczy motyw ma wielkość 40 par zasad i może występować w liczbie od 3 do 13 [5]. Obliczenia statystyczne przeprowadzono przy użyciu pakietu statystycznego Statistica v 8. nalizę częstości genotypów przeprowadzono z wykorzystaniem testu c2 Pearsona a alleli z wykorzystaniem testu dokładnego prawdopodobieństwa Fishera. Dla analiz statystycznych przyjęto jako znaczący poziom istotności (p) mniejszy od 0,05. W przypadku grup o liczebności mniejszej niż 5, zastosowano test dokładnego prawdopodobieństwa Fishera-Frimana-Haltona. Zgodność rozkładu genotypów z prawem Hardy ego-weinberga analizowano przy użyciu programu Utility Programs For nalysis Of enetic Linkage (opyright 188 J. Ott). Wartość p > 0,05 oznacza zgodność z prawem Hardy ego-weinberga. naliza mocy badań asocjacyjnych została wykonana z wykorzystaniem kalkulatora mocy przygotowanego przez dr José Osorio`y Fortéa z Institut Pasteur Immunophysiologie et Parasitisme Intracellulaire [6]. Wyniki zęstości genotypów i alleli poszczególnych genów analizowano w całej grupie pacjentów z rozpoznaniem DHD i w grupie osób zdrowych oraz z uwzględnieniem podziału na poszczególne podtypy DHD. Rozkład wszystkich genotypów był zgodny z prawem Hardy ego-weinberga (HWE) (p>0,05). Wyniki analizy mocy badań asocjacyjnych poszczególnych polimorfizmów wynosiły od 4,4 do 38%. W pracy stwierdzono statystycznie istotną różnicę w występowaniu allelu (p=0,023) polimorfizmu (SNP rs180047) genu w grupie pacjentów z rozpoznaniem DHD w porównaniu z osobami zdrowymi. Stwierdzono również istotną statystycznie różnicę w częstości występowania genotypów dla genu BDNF pomiędzy pacjentami z podtypem 1 i podtypem 2 DHD (p=0,041). Istotnie częściej w podgrupie z podtypem 1 DHD (75%) niż w podtypie 2 (40%) występowała homozygota (Val/Val). W pozostałych przypadkach nie wykazano asocjacji genotypowych i allelowych badanych polimorfizmów genów, zarówno w grupie pacjentów z DHD, jak i przy podziale na poszczególne jego podtypy. Wyniki przedstawiono w tabeli 2, 3, 4, 5a oraz 5b. Omówienie wyników nalizę wybranych polimorfizmów genów prowadzono w oparciu o wcześniejsze doniesienia dotyczące ich roli w etiologii DHD, zarówno w całej grupie badanej, jak i przy podziale na poszczególne podtypy DHD. Podział pacjentów na podgrupy służy wyodrębnieniu pacjentów bardziej jednorodnych pod względem obrazu klinicznego choroby i tym samym jest próbą stwierdzenia czy tak definiowane fenotypy zaburzenia charakteryzują się określonym układem genotypów. Uzyskane rezultaty wykazały asocjację allelową pomiędzy DHD a polimorfizmem (SNP, single nucleotide polimorphism, rs180047) genu w całej grupie badanej oraz asocjację genotypową pomiędzy polimorfizmem genu BDNF a DHD przy podziale na poszczególne podtypy zaburzenia. Wyniki niniejszych badań mogą wskazywać na niewielką rolę polimorfizmu w etiologii DHD oraz na modyfikację obrazu choroby poprzez polimorfizm genu BDNF. Pozostałe wyniki nie wykazują asocjacji genotypowych ani allelowych pomiędzy DHD a polimorfizmami wybranych genów w całej grupie badanej oraz przy podziale na podtypy zaburzenia. Moc dla większości badanych polimorfizmów jest niezbyt wysoka, co może utrudniać interpretację uzyskanych wyników negatywnych. Wiadomości Psychiatryczne, tom 12, nr 3, lipiecwrzesień 200

7 abela 2. Rozkład częstości alleli w całej grupie pacjentów w porównaniu do grupy kontrolnej rs180047 rs177 DRD3 rs6280 DRD4 rs180055 D rs27072 D rs46337 D VNR OM rs4680 BDNF rs6265 25 (82,5) ins 287 (1,4) 2 (74,4) 144 (46,5) 24 (7,8) 238 (74,4) 76 (28,8) 152 (48,4) 264 (84,6) % - wartości w nawiasach, test dokładny Fishera Pacjenci llele 55 (17,5) del 27 (8,6) 80 (25,6) 166 (53,5) 63 (20,2) 82 (25,6) 188 (71,2) 162 (51,5) 48 (15,4) 226 (74,8) ins 281 (3,7) 205 (68,4) 126 (44,4) 251 (82,6) 230 (75,7) 52 (25,5) 138 (45,3) 240 (80,0) Kontrola llele 76 (25,2) del 1 (6,3) 5 (31,6) 158 (55,6) 53 (17,4) 74 (24,3) 152 (74,5) 166 (54,6) 60 (20,0) p 0,023 0,357 0,7 0,621 0,4 0,781 0,464 0,468 0,13 abela 3. Rozkład częstości genotypów w całej grupie pacjentów w porównaniu do grupy kontrolnej rs180047 rs177 DRD3 rs6280 DRD4 rs180055 D rs27072 D rs46337 D VNR OM rs4680 BDNF rs6265 Pacjenci Kontrola n enotypy n enotypy 157 157 156 155 156 157 1 157 156 8 (68,8) ins/ins 131 (83,4) 86 (55,1) 33 (21,3) 7 (62,2) 85 (54.1) / (8,3) (Val/Val) (20,4) (Val/Val) 1 (71,2) 43 (27,4) ins/del 25 (15,) 60 (38,5) 78 (50,3) 55 (35,2) 68 (43,3) / 54 (40,) (Val/Met) 88 (56,0) (Val/Met) 42 (26,) 6 (3,8) ins/del 1 (0,7) (6,4) 44 (28,4) 4 (2,6) 7 (2,6) / 67 (50,8) (Met/Met) 37 (23,6) (Met/Met) 3 (1,) 151 150 150 142 152 152 2 152 8 (58,) ins/ins 1 (88,0) 6 (46,0) 23 (16,2) 3 (67,8) 85 (55,) / (8,8) (Val/Val) 35 (23,0) (Val/Val) 5 (63,3) % wartości w nawiasach; test chi 2 Pearsona dla komórek >5; test Fishera-Freemana-Haltona dla komórek <5 150 48 (31,8) ins/del 17 (,3) 67 (44,7) 80 (56,3) 45 (2,6) 60 (3,8) / 34 (33,3) (Val/Met) 68(44,7) (Val/Met) 50 (33,3) 14 (,3) ins/del 1 (0,7) 14 (,3) 3 (27,5) 4 (2,6) 7 (4,6) / 5 (57,8) (Met/Met) 4 (,2) (Met/Met) 5 (3,3) p 0,07 0,50 0,242 0,477 0,546 0,533 0,43 0,5 0,301 W przypadku chorób wieloczynnikowych o złożonym modelu dziedziczenia i niewielkim wpływie pojedynczych SNP, dla uzyskania odpowiedniej mocy badania konieczne jest niekiedy analizowanie grup o liczebności >00 osób. W praktyce jest to możliwe jedynie w przypadku badań wieloośrodkowych. Zaburzenia neurotransmisji w układzie dopaminergicznym są uważane za jeden z czynników pre- Wiadomości Psychiatryczne, tom 12, nr 3, lipiecwrzesień 200

8 abela 4. Rozkład częstości alleli w podgrupach pacjentów DHD podtyp1 llele DHD podtyp 2 llele DHD podtyp 3 llele P 1 vs 2 P 1 vs 3 P 2 vs 3 rs180047 53 (82,8) (17,2) 18 (81,8) 4 (18,2) 187 (82,7) 3 (17,2) 1,000 1,000 1,000 rs177 ins 58 (0,6) del 6 (,4) ins (0,0) del - ins 205 (0,7) del 21 (,3) 0,583 1,000 0,605 DRD3 rs6280 46 (71,8) 18 (28,2) 17 (77,2) 5 (22,8) 168 (75,0) 56 (25,0) 0,782 1,000 1,000 DRD4 rs180055 28 (43,8) 36 (56,3) (50,0) (50,0) 5 (46,8) (53,2) 0,77 0,672 0,818 D rs27072 53 (82,8) (17,2) 13 (65,0) 7 (35,0) 181 (80,1) 45 (1,) 0, 0,721 0,14 D rs46337 48 (75,0) 16 (25,0) 16 (72,7) 6 (27,2) 174 (77,0) 52 (23,0) 1,000 0,740 0,606 D VNR 16 (2,6) 38 (70,4) 6 (42,8) 8 (57,2) 55 (28,3) 13 (71,7) 0,355 0,865 0,360 OM rs4680 36 (56,3) 28 (43,8) (40,) 13 (5,1) 6 (46,) 120 (53,1) 0,228 0,204 0,658 BDNF rs6265 54 (84,4) (15,6) 14 (70,0) 6 (30,0) 15 (86,3) 31 (13,7) 0,13 0,687 0,03 % wartości w nawiasach, test dokładny Fishera abela 5a. Rozkład częstości genotypów w podgrupach pacjentów rs180047 rs177 DRD3 rs6280 DRD4 rs180055 D rs27072 D rs46337 D VNR OM rs4680 BDNF rs6265 DHD typ1 DHD typ2 n enotypy n enotypy 27 23 (71,) ins/ins 27 (84,4) 17 (53,1) 7 (21,) 21 (65,6) 17 (53.1) / 2 (7,4) (Val/Val) (28,1) (Val/Val) 24 (75,0) 7 (2,) ins/del 4 (12,5) 12 (37,5) 14 (43,7) (34,4) 14 (43,8) / 12 (44,4) (Val/Met) 18 (56,2) (Val/Met) 6 (18,8) 2 (6,2) ins/del 1 (3,1) 3 (,4) (34,4) 1 (3,1) / 13 (48,2) (Met/Met) 5 (15,7) (Met/Met) 2 (6,2) 7 7 (63,6) ins/ins (0,0) 6 (54,6) 3 (30,0) 3 (30,0) 5 (45,4) / (Val/Val) 2 (18,2) (Val/Val) 4 (40,0) 4 (36,4) ins/del 5 (45,4) 4 (40,0) 7 (70,0) 6 (54,6) / 6 (85,7) (Val/Met) 5 (45,5) (Val/Met) 6 (60,0) ins/del 3 (30,0) / 1 (14,3) (Met/Met) 4 (36,3) (Met/Met) dysponujących do wystąpienia DHD. transportera dopaminy stał się przedmiotem zainteresowania badań nad etiologią DHD, gdy u 70% dzieci z DHD leczonych lekami psychostymulującymi (inhibitory transpotera dopaminy) stwierdzono szybką poprawę kliniczną [7]. Najczęściej badany polimorfizm jest zlokalizowany w eksonie 15, w nieulegającym translacji regionie 3`genu transportera Wiadomości Psychiatryczne, tom 12, nr 3, lipiecwrzesień 200

abela 5b. (cd) Rozkład częstości genotypów w podgrupach pacjentów rs180047 rs177 DRD3 rs6280 DRD4 rs180055 D rs27072 D rs46337 D VNR OM rs4680 BDNF rs6265 n 2 2 7 78 (6,0) ins/ins 2 (81,4) 63 (56,3) 23 (20,5) 72 (63,7) 64 (56,6) / (,3) (Val/Val) 21 (18,6) (Val/Val) 83 (73,4) DHD typ3 enotypy 31 (27,4) ins/del 21 (18,6) 42 (37,5) 5 (52,7) 37 (,7) 46 (40,7) / 35 (36,1) (Val/Met) 64 (56,6) (Val/Met) 2 (25,6) 4 (3,6) ins/del 7 (6,2) 30 (26,8) 4 (3,6) 3 (2,7) / 52 (53,6) (Met/Met) 28 (24,8) (Met/Met) 1 (1,0) % wartości w nawiasach; test chi 2 Pearsona dla komórek >5; test Fishera-Freemana-Haltona dla komórek <5 P 0,73 0,181 0,3 0,781 0,187 0,846 0,184 0,534 0,041 dopaminy i charakteryzuje się zmienną liczbą powtórzeń tandemowych (VNR). Powtarzalny motyw jest zbudowany z 40 par zasad. Najczęściej występują allele z i powtórzeniami. Do chwili obecnej opublikowano ponad 0 doniesień badających rolę powyższego polimorfizmu genu D z DHD. Badacze stwierdzili znacząco częstsze przekazywanie choremu potomstwu allelu z powtórzeniami [8]. W innych badaniach, podobnie jak w prezentowanej pracy, nie opisano istotnej statystycznie różnicy w występowaniu allelu z powtórzeniami pomiędzy grupą badaną a grupą kontrolną []. Badania ostatnich lat sugerują także funkcjonalne znaczenie polimorfizmu VNR genu D. Wykazano, że allel z powtórzeniami zwiększa ekspresję genu, a tym samym wiąże się ze wzrostem aktywności transportera dopaminy w mózgu, i w konsekwencji kliniczną odpowiedzią na leczenie metylofenidatem []. W kolejnych badaniach autorzy wskazują na związek DHD z polimorfizmem VNR, o powtarzalnym motywie 30 par zasad, zlokalizowanym w intronie 8 genu D. Badacze stwierdzili preferencyjne przekazywanie pacjentom z DHD allelu z 6 powtórzeniami []. Inne badania wskazują też na możliwość związku SNP rs27072, rs40184, rs255046 oraz rs564750 genu D z DHD [12]. Znacznie mniej opublikowano doniesień dotyczących roli genów i DRD3 w DHD. en receptora D2 dopaminy () zlokalizowany jest na chromosomie q23.1. Jego ekspresję obserwujemy w jądrach podstawy oraz korze przedczołowej, regionach mózgu związanych z DHD. Pełni on też kluczową rolę w regulacji mezolimbicznego szlaku nagrody. W jednej z teorii rozwoju DHD za podstawowy deficyt uznaje się zaburzenia w funkcjonowaniu układu sygnalizującego związek pomiędzy danym rodzajem zachowania, a nagrodą. Potwierdzać to mogą obserwacje, że u dzieci z DHD obserwuje się zarówno trudności w oczekiwaniu, jak i problemy z podtrzymywaniem działania przez dłuższy czas. Niezdolność do odraczania nagrody może prowadzić w trakcie rozwoju dziecka do unikania wszelkich zadań, w których występuje opóźniona nagroda i do angażowania się w zachowania wzmacniane bezpośrednio po ich wystąpieniu. We wcześniejszych badaniach nad asocjacją genu z DHD nie uzyskano pozytywnych wyników, jednak analizie poddawano polimorfizmy zlokalizowane w jego rejonach niekodujących [13]. Badania genu w DHD dotyczą najczęściej polimorfizmu aqi (rs180047), który wydaje się interesujący ze względu na związek z poziomem ekspresji genu oraz poziomem metabolitu dopaminy kwasu homowanilinowego [12]. W odróżnieniu od prezentowanych wyników, w literaturze wskazywano raczej na częstsze występowanie allelu w grupie pacjentów z DHD. Rozbieżność ta może być między innymi wynikiem prowadzania badań w odmiennych grupach etnicznych, różniących się pod względem liczebności. Ze względu na niejednoznaczne wyniki przedstawione przez różnych autorów konieczne są dalsze badania dotyczące związku DHD z badanym polimorfizmem genu. Wiadomości Psychiatryczne, tom 12, nr 3, lipiecwrzesień 200

120 Badany dotychczas w DHD funkcjonalny polimorfizm (Serly; rs6280) genu DRD3 dotyczy kodonu w 1 egzonie. Zamiana nukleotydu w kodonie prowadzi do zastąpienia seryny (Ser) glicyną (ly) w N-końcowej domenie receptora. U osób o genotypie ly/ly, posiadających wariant białka zawierający glicynę w miejscu seryny, receptor wykazuje większe powinowactwo do dopaminy [14]. W dotychczasowych badaniach, podobnie jak w przypadku prezentowanych wyników, nie wykazano związku powyższego polimorfizmu z DHD [12]. Wielu badaczy wskazało również na związek polimorfizmu genu DRD4 z DHD. Jednym z częściej badanych polimorfizmów genu jest polimorfizm typu VNR w egzonie 3, o powtarzalnym motywie długości 48 pz (allele o 2 powtórzeniach tego motywu). Z różnorodnością alleliczną polimorfizmu DRD4 wiążą się różne właściwości farmakologiczne receptora. W literaturze odnajdujemy wiele doniesień stwierdzających asocjację pomiędzy allelem z 7 powtórzeniami a DHD. W kolejnych badaniach wykazano asocjację allelu z 7 powtórzeniami u chłopców z większym nasileniem objawów DHD [15]. Mill i wsp. [16] przeprowadzili wieloośrodkowe badania u pacjentów z DHD, które nie potwierdziły jednak wcześniejszych doniesień. Badacze ci opierając się na wynikach Okuyamy i wsp. wnioskują także, że wpływ DRD4 na nadpobudliwość jest również wynikiem funkcjonalnego polimorfizmu promotora DRD4 [17]. ten, polegający na substytucji -521/ (rs180055) w rejonie promotora, ma charakter funkcjonalny, gdyż allel charakteryzuje się mniejszą aktywnością transkrypcyjną. Przeprowadzili oni analizę asocjacji 5 polimorfizmów genu DRD4 (duplikacji 120 par zasad w promotorze, SNP -616 /, -521 /, powtórzenia poli- w intronie 1 oraz VNR 48 par zasad w egzonie 3). nalizując wymienione polimorfizmy z osobna nie stwierdzili asocjacji żadnego z nich na poziomie istotności statystycznej, co jest zgodne z wynikami uzyskanymi w prezentowanej pracy. Interesujące okazały się jednak analizy haplotypu składającego się z 3 wymienionych polimorfizmów. Haplotyp składający się z allelu 2 duplikacji 120 par zasad, allelu -616 oraz allelu -512 wiąże się ze zwiększoną podatnością na DHD [18]. W chorobach determinowanych wielogenowo znaczenie ma wiele genów o relatywnie niewielkim wpływie na fenotyp o addytywnym działaniu z innymi genami, zatem coraz częściej analizuje się interakcję dwóch lub trzech genów. Qian i wsp. przedstawili wyniki badań asocjacyjnych dwóch polimorfizmów genu DRD4 i D w populacji chińskiej [1]. W badaniu pojedynczych polimorfizmów nie uzyskali istotnej statystycznie asocjacji, natomiast analizując jednocześnie kilka polimorfizmów, wykazali znacząco częstsze występowanie allelu krótkiego (26 powtórzeń polimorfimu VNR egzonu 3 genu DRD4) oraz allelu długiego ( powtórzeń polimorfizmu VNR D) u dzieci z DHD w porównaniu do grupy kontrolnej. Katechol-O-metyl-transferaza (OM) jest enzymem odpowiedzialnym za rozkład katecholamin, dopaminy i noradrenaliny. Odgrywa istotną rolę w regulacji poziomu dopaminy w płacie czołowym, na którego udział w etiologii DHD wskazują badania neuropsychologiczne [12]. Badania asocjacji pomiędzy OM i DHD są w większości skupione na funkcjonalnym polimorfizmie (SNP rs4680) w eksonie 4, który polega na występowaniu guaniny lub adeniny w 158 kodonie (a w przypadku formy niezwiązanej z błoną w kodonie 8), co w efekcie na poziomie białka objawia się zastąpieniem aminokwasu waliny (Val) przez metioninę (Met). Zamiana ta prowadzi do zmiany aktywności enzymu, allel OM Val odpowiada za wysoką aktywność enzymu, natomiast allel Met za jego obniżoną aktywność [20]. W większości badań nie uzyskano pozytywnej asocjacji DHD z wymienionym polimorfizmem, co jest zgodne z wynikami uzyskanymi w prezentowanej pracy [12]. W kilku pracach zwrócono jednak uwagę na to, że dopiero podział badanej grupy ze względu na płeć modyfikuje uzyskane wyniki. Zaobserwowano preferencyjną transmisję allelu Met w podgrupie chłopców z DHD, natomiast allel Val występował częściej wśród dziewcząt z DHD [21]. W kolejnych doniesieniach autorzy zwracają uwagę na rolę genów biorących udział w dojrzewaniu ośrodkowego układu nerwowego w etiologii DHD. Na możliwość związku DHD z polimorfizmem genu kodującego BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) zwraca uwagę ai [22]. BDNF jest członkiem rodziny białkowej neurotrofin i wpływa na rozwój neuronów dopaminergicznych, cholinergicznych i serotoninergicznych, a także odgrywa istotną rolę w rozwoju kory czołowej i hipokampa. BDNF wywiera wpływ na proliferację komórek nerwowych i plastyczność synaptyczną oraz bierze udział w procesach uczenia się i pamięci. Leki psychostymulujące mogą powodować wzrost mrn BDNF oraz immunoreaktywności BDNF w ciele migdałowatym i jądrze przykomorowym podwzgórza. W badaniach prowadzonych na zwierzętach, u których zinaktywowano gen BDNF, wykryto między innymi cieńszą korę mózgu i zaburzenia mielinizacji. e odkrycia korelują z badaniami neuroobrazowymi (MRI) przeprowadzonymi u osób z DHD, u których wykazano o około 5% mniejszą objętość mózgu, w porównaniu z grupą kontrolną oraz możliwość ośrodkowej demielinizacji. Dlatego wysunięto hipotezę, że BDNF odgrywa rolę w patogenezie DHD. Najczęściej badanym polimorfizmem jest Val66Met (rs6265) genu BDNF. W kilku pracach zwraca się uwagę na jego związek z DHD, podkreślając, że allel Val może być allelem ryzyka [23]. W cytowanej powyżej metaanalizie nie uzyskano jednak wyników wskazujących na Wiadomości Psychiatryczne, tom 12, nr 3, lipiecwrzesień 200

121 istotną rolę badanego polimorfizmu w DHD [12]. Niemniej, działanie BDNF na wiele białek potencjalnie mogących brać udział w patogenezie DHD nadal nie jest dobrze poznane. W prezentowanej pracy stwierdzono istotnie częstsze występowanie homozygoty (Val/Val) genu BDNF u pacjentów z podtypem 1 DHD, w porównaniu z podtypem 2. Wyniki te wskazują na możliwy związek badanego polimorfizmu BDNF z DHD. W większości badań podkreśla się udział czynników genetycznych w etiologii DHD, jednak uzyskane wyniki są niejednoznaczne. Może to być związane ze zbyt małą liczebnością grup objętych analizą, stosowaniem odmiennych kryteriów diagnostycznych rozpoznawania DHD oraz kryteriów włączających i wykluczających z badania, brakiem oceny stanu psychicznego osób z grupy kontrolnej, efektem stratyfikacji grupa badana i kontrolna różnią się pod względem etnicznym, niewielką ilością badań uwzględniających udział zarówno czynników genetycznych, jak i środowiskowych, stosowaniem różnych metod statystycznych, brakiem potwierdzenia wyników badań metodą D, wykluczającą grupę kontrolną oraz niewielką ilością metaanaliz. Wnioski 1. W grupie pacjentów z DHD w porównaniu z grupą kontrolną istotnie częściej występował allel polimorfizmu (SNP rs180047) genu. 2. W podtypie DHD z przewagą zaburzeń koncentracji uwagi w porównaniu z podtypem z przewagą nadruchliwości i impulsywności istotnie częściej stwierdzano homozygotę (Val/Val) genu BDNF. 3. Nie wykazano asocjacji genotypowych i allelowych badanych polimorfizmów genów, DRD3, DRD4, D, OM oraz BDNF zarówno w grupie pacjentów z DHD, jak i przy podziale na poszczególne jego podtypy. Piśmiennictwo: 1. Doyle E, Faraone SV, DuPre EP, Biederman J. Separating attention deficit hyperactivity disorder and learning disabilities in girls: a familial risk analysis. m J Psychiatry 2001; 158(): 166672. 2. Miller S, Dykes D, Plesky HF. simple salting out procedure for extracting DN from human nucleated cells. Nucleic cids Res 188; 16: 1215. 3. Ross P, Hall L, Smirnov I, Haff L. High level multiplex genotyping by MLDI-OF mass spectrometry. Nat Biotechnol 18; 16(13): 134751. 4. Jonsson E, Ivo R, Forslund K, Mattila-Evenden M, Rylander, ichon S, Propping P, Nothen MM, sberg M, Sedvall. No association between a promoter dopamine D(4) receptor gene variant and schizophrenia. m J Med enet 2001; 5(6): 5258. 5. Vandenbergh DJ, Persico M, Hawkins L, riffin, Li X, Jabs EW, Uhl R. Human dopamine transporter gene (D1) maps to chromosome 5p15.3 and displays a VNR. enomics 12; 14(4): 146. 6. Bayer, Schramm M, Feldmann N, Knable MB, Falkai P. ntidepressant drug exposure is associated with mrn levels of tyrosine receptor kinase B in major depressive disorder. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2000; 24: 881888. 7. Roman, Szobot, Martins S, Biederman J, Rohde L, Hutz MH. Dopamine transporter gene and response to methylphenidate in attention-deficit/hyperactivity disorder. Pharmacogenetics 2002; 12(6): 47. 8. arrasco X, Rothhammer P, Moraga M, Henriquez H, hakraborty R, boitiz F, Rothhammer F. enotypic interaction between DRD4 and D1 loci is a high risk factor for attention-deficit/hyperactivity disorder in hilean families. m J Med enet B 2006; 141B: 5154. Banoei MM, Majidizadeh, Shirazi E, Moghimi N, hadiri M, Najmabadi H, Ohadi M. No association between the D1-repeat allele and DHD in the Iranian population. m J Med enet B 2008; 147B:.. Kirley, Lowe N, Hawi Z, Mullins, Daly, Waldman I, Mcarron M, O Donnell D, Fitzgerald M, ill M. ssociation of the 480 bp D1 allele with methylphenidate response in a sample of Irish children with DHD. m J Med enet 2003; 121B: 5054.. enro JP, Polanczyk V, Zeni, Oliveira S, Roman, Rohde L, Hutz MH. common haplotype at the dopamine transporter gene 5_ region is associated with attentiondeficit/hyperactivity disorder. m J Med enet B 2008; 147B: 15681575. 12. izer I, Ficks, Waldman ID. andidate gene studies of DHD: a meta-analytic review. Hum enet 200; 126: 510. 13. Rowe D, Van den Oord EJ, Stever, iedinghagen LN, ard JM, leveland HH, ilson M, erris S, Mohr JH, Sherman S, bramowitz, Waldman ID. he aqi polymorphism and symptoms of attention deficit hyperactivity disorder. Mol Psychiatry 1; 4(6): 580586. 14. Lundstrom K, urpin MP. Proposed schizophrenia-related gene polymorphism: expression of the Serly mutant human dopamine D3 receptor with the Semliki Forest virus system. Biochem Biophys Res ommun 16; 225(3): 6872. 15. El-Faddagh M, Laucht M, Maras, Vohringer L.Schmidt MH. ssociation of dopamine D4 receptor (DRD4) gene with attention-deficit/hyperactivity disorder (DHD) in a highrisk community sample: a longitudinal study from birth to years of age. J Neural ransm 2004; 1(7): 883. 16. Mill JS, aspi, Mclay J, Sugden K, Purcell S, sherson P, raig I, Mcuffin P, Braithwaite, Poulton R, Moffitt E. he dopamine D4 receptor and the hyperactivity phenotype: a developmental-epidemiological study. Mol Psychiatry 2002; 7(4): 3831. Wiadomości Psychiatryczne, tom 12, nr 3, lipiecwrzesień 200

122 17. Okuyama Y, Ishiguro H, Nankai M, Shibuya H, Watanabe, rinami. Identification of a polymorphism in the promoter region of DRD4 associated with the human novelty seeking personality trait. Mol Psychiatry 2000; 5(1): 64. 18. Lowe N, Kirley, Mullins, Fitzgerald M, ill M, Hawi Z. Multiple marker analysis at the promoter region of the DRD4 gene and DHD: evidence of linkage and association with the SNP -616. m J Med enet 2004; 131B(1): 337. 1. Qian Q, Wang Y, Zhou R, Yang L, Faraone SV. Familybased and case-control association studies of DRD4 and D1 polymorphisms in hinese attention deficit hyperactivity disorder patients suggest long repeats contribute to genetic risk for the disorder. m J Med enet 2004; 128B(1): 84. 20. Kirov, Murphy K, rranz MJ, Jones I, Mcandles F, Kunugi H, Murray RM, Mcuffin P, ollier D, Owen MJ, raddock N. Low activity allele of catechol-omethyltransferase gene associated with rapid cycling bipolar disorder. Mol Psychiatry 18; 3(4): 3425. 21. Biederman J, Kim J, Doyle, Mick E, Fagerness J, Smoller J, Faraone S. Sexually dimorphic effects of four genes (OM, SL62, MO, SL64) in genetic associations of DHD: a preliminary study. m J Med enet B 2008, 147:151518. 22. sai SJ. ttention-deficit hyperactivity disorder and brainderived neurotrophic factor: a speculative hypothesis. Med Hypotheses 2003; 60(6): 84851. 23. Kent L, reen E, Hawi Z, Kirley, Dudbridge F, Lowe N, Raybould R, Langley K, Bray N, Fitzgerald M, Owen MJ, O Donovan M, ill M, hapar, raddock N. ssociation of the paternally transmitted copy of common Valine allele of the Val66Met polymorphism of the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) gene with susceptibility to DHD. Mol Psychiatry 2005; : 343. Wiadomości Psychiatryczne, tom 12, nr 3, lipiecwrzesień 200