Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Cel ćwiczenia Określenie podatności na zakażenie wirusem HIV poprzez detekcję homo lub heterozygotyczności w genie ccr5. Wstęp teoretyczny Gen ccr5, zlokalizowany na 3 chromosomie, występuje w populacji ludzkiej w 2 odmianach (allelach) - ccr5 i ccr5δ32. Allel ccr5 odpowiada za syntezę białka receptorowego CCR5, znajdującego się na powierzchni m. in. makrofagów, monocytów, limfocytów T. Białko to jest jednym z koreceptorów wirusa HIV. Obecność koreceptora CCR5 na powierzchni limfocytu pomocniczego jest konieczna, aby HIV mógł wniknąć do wnętrza komórki i wywołać infekcję. Allel ccr5δ32 jest uszkodzonym wariantem genu ccr5 i różni się od niego delecją (ubytkiem) 32 par zasad. Wynikiem takiej delecji jest zniesienie syntezy białka ko-receptorowego CCR5. Badanie polega na oznaczeniu tzw. genotypu CCR5 i pozwala na określenie czy u osoby badanej występuje genetycznie uwarunkowana oporność na zakażenie wirusem HIV-1. Osoby będące homozygotami typu ccr5δ32 są oporne na zakażenie wirusem HIV-1. Nosicielem takiej mutacji jest tylko ok. 1-2% przedstawicieli rasy białej. Osoby z jedną kopią genu zmutowaną i jedną kopią prawidłową tzw. heterozygoty charakteryzują się zmniejszonym ryzkiem zakażenia wirusem HIV. W przypadku zakażenia postęp choroby u takich osób będzie wolniejszy. Polimorfizm pod względem CCR5 nie objawia się fenotypowo, nie zaobserwowano też, aby zabezpieczał przed innymi chorobami zakaźnymi. Wykazywane w wielu badaniach różnice częstości występowania allelu ccr5δ32 tłumaczyć można ich zmiennym rozkładem w poszczególnych grupach etnicznych. I tak stwierdzono, że częstość allelu ccr5δ32 jest znacznie większa w północnej Europie (15,8% w Finlandii, 14,2% w Szwecji, 14,7% w Irlandii, 11,1% w Wielkiej Brytanii) niż w południowej (5,5% we Włoszech, 2,4% w Grecji, 4,2% na Cyprze), podczas gdy w populacjach pozaeuropejskich polimorfizm ten jest nieobecny lub bardzo rzadki.
Amplifikacja fragmentu genu ccr5 przy użyciu jednej pary starterów, pozwala na uzyskanie fragment o długości 183 pz swoistego dla prawidłowego genu ccr5 i fragmentu 151 pz swoistego dla genu zmutowanego ccr5δ3. Interpretacja możliwych wyników przedstawiona jest w tabeli 10.1. Genotyp ccr5 oznaczany za pomocą reakcji PCR Produkt PCR Oporność na zakażenie wirusem HIV-1 Homozygota typu ccr5 183 pz nie Tabela.1 Heterozygota 183 i 151 pz zmniejszone ryzyko rozwoju choroby Homozygota typu ccr5δ32 151 pz tak Piśmiennictwo 1. Carrington M, Dean M, Martin MP, O'Brien SJ, Genetics of HIV-1 infection: chemokine receptor CCR5 polymorphism and its consequences, Hum Mol Genet. 1999;8(10):1939-45. 2. Wąsik TJ, Smoleń J, Kruszyński P, Bratosiewicz-Wąsik J, Beniowski M, Rola polimorficznych alleli CCR5-Δ32, CCR2-64I i SDF-1-3 w zakażeniu ludzkim wirusem upośledzenia odporności typu 1 (HIV 1 ) w populacji polskiej, Wiadomości Lekarskie, 2005, LVIII, 9-10. Materiały Zestaw do izolacji DNA z wymazówek, postępować zgodnie z procedurą producenta DNA kontrolne typu dzikiego (K1+), DNA kontrolne zawierające zmutowaną formę genu ccr5δ32 (K2+) 10x stężony bufor do reakcji PCR Shark, 20 mm roztwór MgCl 2, 8 mm mieszanina dntps startery CCR51 (CTTCATTACACCTGCAGCTCT) i CCR52 (CACAGCCCTGTCCCTCTTCTTC) polimeraza DNA termostabilna Pwo Hypernova [2 U/µl] (DNA Gdańsk) woda jałowa, agaroza, bufor 1xTAE, termocykler, aparat do elektroforezy poziomej, transilluminator, zimny blok, statywy do probówek
Wykonanie 1. Przeprowadzić izolację DNA z własnych komórek pobranych w formie wymazów ze śluzówki policzka z wykorzystaniem zestawu do izolacji DNA zgodnie z instrukcją postępowania dostarczoną przez producenta. 2. Przygotować 4 probówki 0,2 ml i opisać je symbolami wg tabeli 10.2, uwzględniając kontrole dodatnie i ujemne. 3. W probówce 1,5 ml przygotować mieszaninę Master MIX, zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem matrycy DNA, wymieszać i rozporcjować po 24 µl. Skład mieszaniny reakcyjnej i profil temperaturowo czasowy reakcji PCR Skłąd mieszaniny reakcyjnej Skład Ilość [µl] Temperatura x1 Master 1 K1+ K2+ K- [ C] MIX (x 5) Woda 14,2 Tabela.2 Profil temperaturowo czasowy 10 x bufor Shark 2,5 96 300 MgCl 2 [20 mm] 2,5 96 30 dntps [8 mm] 2,5 24 24 24 24 55 30 CCR51 [10 µm] 1,0 72 30 CCR52 [10 µm] 1,0 72 300 Polimeraza Pwo [2 U/µl] 0,3 4 24 DNA 1,0 X 1,0 1,0 1,0 1,0 [H 2 O] Objetość całkowita 25 25 25 25 25 4. Do próbki 1 dodać 1µl wyizolowanego DNA z wymazówek, do próbki K1+ dodać DNA osobnika z homoalleliczną formę genu ccr5 typu dzikiego, do próbki K2+ dodać DNA zawierające zmutowaną formę genu ccr5δ32 (układ heteroalleliczny), do kontroli ujemnej K- dodać wody jałowej. 5. Umieścić probówki w termocyklerze. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z profilem temperaturowo czasowym, przedstawionym w tabeli 10.2. 6. Produkty PCR rozdzielać w żelu agarozowym 2% z dodatkiem bromku etydyny (0,5 mg/ml), w buforze 1xTAE przy napięciu ok. 7 V/cm długości żelu. Żel analizować w świetle UV. Czas [s] Liczba cykli 40
Wyniki i wnioski Wklej i opisz zdjęcie przedstawiające elektroforetyczny rozdział produktów PCR, zaznacz marker wielkości DNA, próbę z własnego DNA, kontrole dodatnie oraz kontrolę ujemną. Zaznacz wielkości otrzymanych produktów PCR. W oparciu o wyniki amplifikacji określ czy jesteś osobnikiem homozygotycznym czy heterozygotycznym pod względem genu ccr5 oraz czy masz genetycznie uwarunkowaną oporność na wirusa HIV-1.