PL 213925 B1. ABBOTT BIOTECHNOLOGY Ltd., Hamilton, BM

PL 213925 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 213925 (21) Numer zgłoszenia: 374865 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 18.07.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 18.07.2003, PCT/US03/022566 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 29.01.2004, WO04/009776 (51) Int.Cl. A61K 39/395 (2006.01) C07K 16/00 (2006.01) A61P 1/00 (2006.01) A61P 19/00 (2006.01) (54) Przeciwciało anty-tnf lub jego część wiążąca antygen, ich zastosowanie oraz zestaw (73) Uprawniony z patentu: ABBOTT BIOTECHNOLOGY Ltd., Hamilton, BM (30) Pierwszeństwo: 19.07.2002, US, 60/397,275 16.09.2002, US, 60/411,081 10.10.2002, US, 60/417,490 18.03.2003, US, 60/455,777 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 14.11.2005 BUP 23/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.05.2013 WUP 05/13 (72) Twórca(y) wynalazku: SUBHASHIS BANERJEE, Shrewsbury, US LORI K. TAYLOR, Wadsworth, US CLIVE E. SPIEGLER, Reading, GB DANIEL EDWARD TRACEY, Harvard, US ELLIOT KEITH CHARTASH, Randolph, US REBECCA S. HOFFMAN, Wilmette, US WILLIAM T. BARCHUK, Madison, US PHILIP YAN, Vernon Hills, US ANWAR MURTAZA, Westborough, US JOCHEN G. SALFELD, North Grafton, US STEVEN FISCHKOFF, Short Hills, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Marciniak

2 PL 213 925 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest neutralizujące o wysokim powinowactwie izolowane ludzkie przeciwciało anty-tnf lub jego część wiążąca antygen do zastosowania w leczeniu. Wynalazek dotyczy także ich zastosowania w leczeniu choroby wybranej z łuszczycy, łuszczycowego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów (JRA) i ropnego zapalenia gruczołów potowych. Wynalazek obejmuje również zestaw zawierający kompozycję farmaceutyczną, która zawiera neutralizujące o wysokim powinowactwie izolowane ludzkie przeciwciało anty-tnf lub jego część wiążąca antygen. Cytokiny takie jak interleukina-1 (IL1) i czynnik martwicy nowotworów (TNF) są cząsteczkami wytwarzanymi przez różnorodne komórki, takie jak monocyty i makrofagi, zidentyfikowanymi jako mediatory procesów zapalnych. Cytokiny, włączając w to TNF, regulują intensywność i czas trwania odpowiedzi zapalnej, która pojawia się w wyniku zranienia lub infekcji. TNF (także nazywany TNF) bierze udział w patofizjologii różnych ludzkich chorób i zaburzeń, włączając w to zakażenie ogólne, choroby autoimmunologiczne, odrzucanie przeszczepu i chorobę przeszczep przeciw gospodarzowi (patrz np.: Moeller i wsp., (1990) Cytokine 2:162; U.S. Patent No. 5 231 024 Moeller i wsp., Europejska Publikacja Patentowa No. 260 610 B1 Moeller A. i wsp., Vasili (1992) Annu. Rev. Immonol. 10:411; Tracey i Cerami (1994) Annu. Rev. Med. 45:491). Streszczenie wynalazku Istnieje potrzeba leczenia w sposób bezpieczny i skuteczny związanych z TNF chorób, w których aktywność TNF jest szkodliwa. Obecny wynalazek zawiera sposoby bezpiecznego i skutecznego leczenia związanych z TNF chorób, w których aktywność TNF jest szkodliwa. Przedmiotem wynalazku jest neutralizujące o wysokim powinowactwie izolowane ludzkie przeciwciało anty-tnf lub jego część wiążąca antygen do zastosowania w leczeniu choroby wybranej z łuszczycy, łuszczycowego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów i ropnego zapalenia gruczołów potowych przez stosowanie przeciwciała lub jego części wiążącej antygen potrzebującemu tego osobnikowi, w taki sposób, że wspomniana choroba ulega wyleczeniu, przy czym ludzkie przeciwciało anty-tnf lub jego część wiążącą antygen dysocjuje z ludzkiego TNF z K d wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej i stałą szybkości K off wynoszącą 1 x 10-3 lub mniej, oba parametry wyznaczone przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego, oraz neutralizuje cytotoksyczność ludzkiego TNF w standardowym badaniu in vitro L929 z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 lub mniej. Korzystnie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen posiada następującą charakterystykę: a) dysocjuje z ludzkiego TNF ze stałą szybkości K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, jak oznaczono przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego; b) posiada domenę CDR3 lekkiego łańcucha zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; i c) posiada domenę CDR3 ciężkiego łańcucha zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4 lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11, lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12. Korzystnie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen; a) posiada region zmienny lekkiego łańcucha (LCVR) posiadający domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; oraz domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID No: 5 i domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 7; i b) posiada region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) posiadający domenę CDR3 zawierająca sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 8, 9 10 lub 11, lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8 9, 10, 11 i/lub 12 oraz domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID No: 6 i domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 8.

PL 213 925 B1 3 Korzystnie, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen zawiera region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 i region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2. Korzystnie, przeciwciałem jest adalimumab. Korzystnie, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen jest przystosowane do podskórnego podawania go osobnikowi. Korzystnie, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen jest przystosowane do podskórnego stosowania go osobnikowi w dawce około 40 mg jeden raz tygodniowo. Korzystnie, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen jest do podskórnego podawania go osobnikowi z co najmniej jednym dodatkowym czynnikiem terapeutycznym do leczenia choroby. Korzystnie, łuszczycę stanowi przewlekła łuszczyca plackowata. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie neutralizującego o wysokim powinowactwie izolowanego ludzkiego przeciwciała anty-tnf lub jego części wiążącej antygen do zastosowania w leczeniu choroby wybranej z łuszczycy, łuszczycowego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów (JRA) i ropnego zapalenia gruczołów potowych, przy czym ludzkie przeciwciało anty-tnf lub jego część wiążąca antygen dysocjuje z ludzkiego TNF z K d wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej i stałą szybkości K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, oba parametry wyznaczone przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego, oraz neutralizuje cytotoksyczność ludzkiego TNF w standardowym badaniu in vitro L929 z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 lub mniej. Wynalazek dotyczy również zestawu zawierającego: (a) kompozycję farmaceutyczną zawierającą neutralizujące o wysokim powinowactwie izolowane ludzkie przeciwciało anty-tnf lub jego część wiążąca antygen jak zdefiniowano powyżej 1 i farmaceutycznie akceptowalny nośnik; (b) instrukcję do podawania kompozycji farmaceutycznej osobnikowi do leczenia choroby wybranej z łuszczyc. Ten wynalazek dotyczy leczenia zaburzeń związanych z TNF, w których aktywność TNF, np. aktywność ludzkiego TNF, jest szkodliwa. Leczenie obejmuje podawanie osobnikowi leczonemu, terapeutycznie skutecznych ilości inhibitora TNF, tak, że związane z TNF zaburzenie jest leczone. Inhibitor TNF może być podawany w połączeniu z innym środkiem terapeutycznym, w celu leczenia związanego z TNF zaburzenia. Różne aspekty wynalazku związane są z leczeniem przeciwciałami i fragmentami przeciwciał oraz farmaceutycznymi kompozycjami zawierającymi inhibitor TNF i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik do leczenia związanych z TNF zaburzeń. Aby niniejszy wynalazek był łatwiej zrozumiały, na początku zostaną zdefiniowane pewne terminy. Termin ludzki TNF " (używany tutaj skrót htnf lub prościej htnf) tak jak to jest używane tutaj, jest przeznaczony do określenia ludzkiej cytokiny, która występuje w formie 17k D, która jest wydzielana i w połączonej z błoną formie 26 kd. Biologicznie aktywna forma jest trimerem niekonwalencyjnie powiązanych cząsteczek 17 kd. Strukturę htnf dodatkowo opisano, na przykład w Pennica, D., i wsp., (1984) Nature 312: 724-729; Davis J.M., i wsp., (1987) Biochemistry 26: 1322-1326; i Jones E.Y., i wsp., (1989) Nature 338: 225-228. Termin ludzki TNF obejmuje ludzki zrekombinowany TNF (rhtnf ), który może być otrzymany standardowymi metodami ekspresji produktów rekombinacji lub zakupiony komercyjnie (R&D Systems, Nr Katalogowy 210-TA, Minneapolis, MN). TNF jest także określany jako TNF. Termin inhibitor TNF " obejmuje środki, które hamują TNF. Przykłady inhibitorów TNF obejmują etanercept (Enbrel, Amgen), infliksimab (Remicade, Johnson and Johnson), ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-tnf (D2E7/HUMIRA, Abbott Laboratories), CDP 571 (Celltech) i CDP 870 (Celltech) i inne związki, które hamują aktywność TNF tak, że kiedy są podawane podmiotowi cierpiącemu na zaburzenie lub objętemu ryzykiem cierpienia na zaburzenie, w którym aktywność TNF jest szkodliwa, zaburzenie to jest leczone. W jednej z postaci, inhibitor TNF jest związkiem, wyłączając etanercept i infliksimab, który hamuje aktywność TNF. W innej postaci, inhibitory TNF będące przedmiotem wynalazku są stosowane do leczenia związanego z TNF zaburzenia, jak to bardziej szczegółowo opisano w sekcji II. W jednej z postaci, inhibitor TNF, wyłączając etanercept i infliksimab, jest stosowany do leczenia związanego z TNF zaburzenia. W innej postaci, inhibitor TNF, wyłączając etanercept i infliksimab, jest stosowany do leczenia zapalenia zesztywniającego stawów kręgosłupa. Ten termin także obejmuje każde ludzkie przeciwciało antytnf i części prze-

4 PL 213 925 B1 ciwciała opisane tutaj oraz w Patencie Stanów Zjednoczonych Nr 6 090 382; 6 258 562; 6 509 015; i Zgłoszeniu Patentowym Stanów Zjednoczonych Seria Nr 09/801185 i 10/302356. Termin przeciwciało", tak jak użyto tutaj, ma odnosić się do cząsteczek immunoglobulin, które zawierają cztery polipeptydowe łańcuchy, dwa ciężkie (H) i dwa lekkie (L) łańcuchy połączone wzajemnie mostkami dwusiarczkowymi. Każdy ciężki łańcuch zawiera region zmienny ciężkiego łańcucha (tutaj w skrócie określany jako HCVR lub VH) i region stały ciężkiego łańcucha. Region stały ciężkiego łańcucha zawiera trzy domeny, CH1 CH2 i CH3. Każdy lekki łańcuch zawiera region zmienny lekkiego łańcucha (tutaj w skrócie określany jako LCVR lub VL) i region stały lekkiego łańcucha. Region stały lekkiego łańcucha zawiera jedną domenę, CL. Regiony VH i VL mogą być następnie podzielone na regiony nadzmienne określane jako regiony determinujące dopasowanie (CDR), przeplatane regionami, które są bardziej zachowawcze, nazywanymi regionami zrębowymi (FR). Każdy VH i VL składa się z trzech CDRÓw i czterech FRów uporządkowanych od końców amino do końców karboksy w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Dalsze szczegóły dotyczące przeciwciał będących przedmiotem wynalazku opisano w Patentach Stanów Zjednoczonych o Nr 6 090 382; 6 258 562; i 6 509 015 i w Serii Zgłoszeń Patentowych Nr 09/801185 i 10/302356. Każdy z nich jest włączony tutaj całościowo przez odnośniki. Termin wiążąca antygen część" przeciwciała (lub prościej część przeciwciała ), tak jak użyto tutaj odnosi się do jednego lub więcej fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność do specyficznego wiązania do antygenu (np. htnf ). Wykazano, że czynność wiązania antygenu przez przeciwciało może być wykonana przez fragmenty przeciwciała pełnej długości. Przykłady wiążących fragmentów przeciwciała, zawarte w terminie wiążąca antygen część" obejmują (i) fragment Fab, monowalentny fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab') 2, biwalentny fragment zawierający dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd zawierający domeny VH i CH1; (iv) fragment Fv zawierający domeny VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała; (v) fragment dab (Ward i wsp., (1989) Nature 341:544-546), który zawiera domenę VH; i (vi) izolowany region determinujący dopasowanie (CDR). Co więcej, chociaż dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH są kodowane przez dwa oddzielne geny, mogą być one połączone przy użyciu metod rekombinacji, przy zastosowaniu syntetycznego linkera, który pozwala im na utworzenie pojedynczego białkowego łańcucha w którym regiony VL i VH łączą się, żeby utworzyć monowalentną cząsteczkę (znaną jako pojedynczy łańcuch Fv (scfv); patrz np. Bird i wsp., (1988) Science 242: 423-426; i Huston i wsp., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Takie przeciwciała jednołańcuchowe są także obejmowane terminem część przeciwciała wiążąca antygen". Są w nim zawarte inne postacie jednołańcuchowych przeciwciał, takie jak podwójne fragmenty przeciwciała (ang. diahodies) Podwójne fragmenty przeciwciała są biwalentnymi bispecyficznymi przeciwciałami, w których domeny VH i VL są wyrażone jako pojedynczy polipeptydowy łańcuch ale użycie linkera, który jest za krótki, by umożliwić sparowanie dwóch domen w ten sam łańcuch, zmusza domeny do parowania z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzenia dwóch miejsc wiążących antygen (patrz np., Holliger P i wsp., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak R.J., i wsp., (1994) Structure 2: 1121-1123). Dalsze szczegóły dotyczące będących przedmiotem wynalazku części przeciwciała opisano w Patentach Stanów Zjednoczonych Nr 6 090 382, 6,258,562, 6,509,015 i Serii Zgłoszeń Patentowych Stanów Zjednoczonych Nr 09/801185 i 10/302356 z których każdy z nich jest włączony całościowo przez odnośniki. Fragmenty wiążące są otrzymywane technikami rekombinacji DNA albo przez enzymatyczne lub chemiczne rozszczepienie nienaruszonych immunoglobulin. Fragmenty wiążące obejmują Fab, Fab', F(ab') 2, Fabc, Fv, pojedyncze łańcuchy i przeciwciała będące pojedynczym łańcuchem. Inaczej niż dla bispecyficznych" lub bifunkcjonalnych" immunoglobulin lub przeciwciał, immunoglobulina lub przeciwciało jest rozumiane, że ma każde ze swoich miejsc wiążących identyczne. Bispecyficzne" lub bifunkcjonalne przeciwciało" jest sztucznym przeciwciałem hybrydowym mającym dwie różne pary łańcuchów ciężki/lekki i dwa różne miejsca wiążące. Bispecyficzne przeciwciała mogą być produkowane różnymi sposobami włączając w to fuzję hybrydomów lub łączenie fragmentów Fab'. Patrz np., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny i wsp., J Immunol. 148: 1547-1553 (1992). Tak jak to użyto tutaj, podstawienie aminokwasu konserwatywnego" jest takim podstawieniem, w którym reszta jednego aminokwasu jest zastąpiona przez resztę innego aminokwasu mającą podobny boczny łańcuch. Rodziny reszt aminokwasów mających podobne łańcuchy boczne są określone w tej dziedzinie, obejmując zasadowe boczne łańcuchy (np.: lizynę, argininę, histydynę) kwasowe

PL 213 925 B1 5 boczne łańcuchy (np.: kwas asparaginianowy, kwas glutaminowy) polarne boczne łańcuchy bez ładunku (np.: glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina) niepolarne boczne łańcuchy (np.: alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), rozgałęzione boczne łańcuchy beta (np. treonina, walina, izoleucyna) i aromatyczne łańcuchy boczne (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Tak jak użyto tutaj, termin ludzkie przeciwciała" ma obejmować przeciwciała mające zmienne i stałe regiony pochodzące od sekwencji immunoglobulin linii zarodków ludzkich. Będące przedmiotem wynalazku ludzkie przeciwciała mogą obejmować reszty aminokwasów nie kodowane przez sekwencję immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej (np., mutacje wprowadzone przez losową lub miejscowo specyficzną mutagenezę in vitro albo przez somatyczną mutację in vivo), na przykład w CDRach i w szczególności w CDR3. Jednak termin ludzkie przeciwciało", tak jak to użyto tutaj, nie jest użyty z zamiarem objęcia nim przeciwciał, w których sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowych innych gatunków ssaków, takich jak myszy, były przeszczepione do ludzkich sekwencji zrębowych. Termin ludzkie zrekombinowane przeciwciało", tak jak użyto to tutaj, ma obejmować wszystkie ludzkie przeciwciała, które są otrzymywane, wyrażane, tworzone lub izolowane metodami rekombinacji, takie jak przeciwciała powstałe w wyniku ekspresji przy użyciu zrekombinowanego wektora ekspresji transfekowanego do komórki gospodarza (opisano poniżej), przeciwciała izolowane z biblioteki ludzkich zrekombinowanych kombinatoryjnych przeciwciał (opisano poniżej), przeciwciała izolowane od zwierzęcia (np., myszy), które jest transgeniczne w stosunku do genów ludzkiej immunoglobuliny (patrz np. Taylor L.D. i wsp., (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287) lub przeciwciała otrzymywane, wyrażane, tworzone lub izolowane jakąś inną techniką, która obejmuje splajsing sekwencji genu ludzkiej immunoglobuliny do innej sekwencji DNA. Takie zrekombinowane ludzkie przeciwciało ma regiony zmienny i stały, pochodzące od sekwencji immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej. W pewnych postaciach wszelako, takie zrekombinowane ludzkie przeciwciała są poddawane mutagenezie in vitro (lub kiedy używane są zwierzęta transgeniczne w stosunku do sekwencji ludzkiej Ig, mutagenezie somatycznej in vivo) i w ten sposób sekwencje aminokwasów regionów VH i VL zrekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które kiedy pochodzą od i odpowiadają sekwencji VH i VL ludzkiej linii zarodkowej mogą naturalnie nie występować in vivo w repertuarze linii zarodkowej ludzkich przeciwciał. Izolowane przeciwciało", tak jak użyto to tutaj ma odnosić się do przeciwciała, które jest istotnie wolne od innych przeciwciał mających odmienną antygenową specyficzność (np. izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże htnf jest istotnie wolne od przeciwciał, które specyficznie wiążą antygeny inne niż htnf ). Izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże htnf może wykazywać krzyżową reaktywność z innymi antygenami, takimi jak cząsteczki TNF pochodzące od innych gatunków (dyskusja dalszych szczegółów poniżej). Co więcej, izolowane przeciwciało może być istotnie wolne od innego komórkowego materiału i/lub chemikalii. Przeciwciało neutralizujące", tak jak użyto to tutaj (lub przeciwciało, które neutralizowało aktywność htnf "), ma odnosić się do przeciwciała, które wiążąc się do htnf powoduje hamowanie biologicznej aktywności htnf. Takie hamowanie biologicznej aktywności htnf może być badane przez pomiar jednego lub więcej wskaźników biologicznej aktywności htnf, takich jak indukowana htnf cytotoksyczność (albo in vitro albo in vivo), indukowana htnf aktywacja komórkowa i wiązanie htnf do receptorów dla htnf. Te wskaźniki biologicznej aktywności htnf mogą być badane przez jedno lub więcej spośród kilku znanych w tej dziedzinie standardowych badań in vivo i in vitro (patrz Patent Stanów Zjednoczonych 6,090,382). Wskazane jest badanie zdolności przeciwciał do neutralizowania aktywności htnf przez badanie hamowania indukowanej htnf cytotoksyczności komórek L929. Jako dodatkowy lub alternatywny wskaźnik aktywności htnf, może być badana zdolność przeciwciała do hamowania indukowanej htnf ekspresji ELAM-1 w HUVEC, będącej miarą indukowanej htnf aktywacji komórkowej. Termin "powierzchniowy rezonans plazmowy", tak jak użyto to tutaj, odnosi się do optycznego zjawiska, które pozwala na analizę biospecyficznych reakcji w czasie rzeczywistym, poprzez detekcję zmian w stężeniu białka wewnątrz biosensorowej matrycy, na przykład używając systemu BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Upsala, Sweden and Piscataway, NJ). Dalsze szczegóły, patrz Przykład 1 Patentu Stanów Zjednoczonych Nr 6 258 562 i Jönsson i wsp., (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19; Jönsson i wsp., (199) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson i wsp., (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125; Johnnson i wsp., (1991) Anal. Biochem. 198: 268.

6 PL 213 925 B1 Termin K off " tak jak to użyto tutaj, ma odnosić się do stałej szybkości dysocjacji oddysocjowywania przeciwciała z kompleksu przeciwciało - antygen. Termin,,K d tak jak użyto to tutaj, ma odnosić się do stałej dysocjacji specyficznej interakcji przeciwciało-antygen. Termin IC 50 " tak jak użyto to tutaj, ma odnosić się do stężenia inhibitora wymaganego do zahamowania będącego przedmiotem zainteresowania biologicznego punktu końcowego, np. zneutralizowania cytotoksycznej aktywności. Termin cząsteczka kwasu nukleinowego" tak jak użyto to tutaj, ma obejmować cząsteczki DNA i cząsteczki RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa lub dwuniciowa, ale wskazane, żeby była dwuniciowym DNA. Termin izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego", tak jak użyto to tutaj w odniesieniu do kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała lub części przeciwciał (np. VH, VL, CDR3), które wiążą htnf, ma odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego, w której sekwencje nukleotydów kodujące przeciwciało lub część przeciwciała są wolne od innych nukleotydowych sekwencji kodujących przeciwciała lub części przeciwciał, które wiążą antygen inny niż htnf, które to inne sekwencje mogą naturalnie flankować kwas nukleinowy w ludzkim genomowym DNA. Tak więc na przykład, izolowany kwas nukleinowy, będący przedmiotem niniejszego wynalazku koduje region VH przeciwciała antyhtnf i nie zawiera innych sekwencji kodujących inne regiony VH, które wiążą antygeny inne niż htnf. Termin wektor", tak jak użyto to tutaj, ma odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego, zdolnej do transportowania innego kwasu nukleinowego, do którego została przyłączona. Pewnym typem wektora jest plazmid", nazwa ta odnosi się do kolistej dwuniciowej pętli DNA, do której dodatkowy segment DNA może być ligowany. Innym typem wektora, jest wektor wirusowy, w którym dodatkowe segmenty DNA mogą być ligowane do genomu wirusowego. Pewne wektory są zdolne do niezależnej replikacji w komórce gospodarza, do której zostaną wprowadzone (np., wektory bakteryjne, mające bakteryjny sposób replikacji i episomalne wektory ssaków). Inne wektory (np. nieepisomalne wektory ssaków) mogą być scalane z genomem komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza i w wyniku tego są replikowane razem z genomem gospodarza. Co więcej, pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, do których są operacyjnie przyłączone. Takie wektory są określane tutaj jako zrekombinowane wektory ekspresyjne" (lub po prostu wektory ekspresyjne"). Ogólnie, wektory ekspresyjne, mające zastosowanie w technikach rekombinacji DNA często są w formie plazmidów. W obecnej specyfikacji, plazmid" i wektor" mogą być używane wymiennie, jako że plazmid jest najbardziej rozpowszechnioną w użyciu formą wektora. Jednakże, wynalazek ma obejmować także inne formy wektorów ekspresyjnych, takie jak wektory wirusowe (np., wadliwe retrowirusy replikacyjne, adenowirusy i wirusy związane z adeno), które służą równoważnymi funkcjami. Termin zrekombinowana komórka gospodarza" (lub po prostu komórka gospodarza") ma odnosić się do komórki, do której został wprowadzony zrekombinowany wektor ekspresyjny. Powinno być zrozumiałe, że taki termin ma odnosić się nie tylko do konkretnej komórki ale też do potomstwa takiej komórki. Ponieważ w następnych pokoleniach mogą pojawić się pewne modyfikacje związane albo z mutacją albo z wpływem środowiska, w rzeczywistości, takie potomstwo może nie być identyczne z komórką rodzicielską, ale ciągle jest włączone w zakres objęty terminem komórka gospodarza", tak jak to użyto tutaj. Termin dawkowanie", tak jak to użyto tutaj, odnosi się do podawania substancji (np., przeciwciała anty TNF ) żeby osiągnąć cel terapeutyczny (np., leczenie zaburzeń związanych z TNF ). Termin dwutygodniowa procedura dawkowania" dwutygodniowe dawkowanie" i dwutygodniowe podawanie" dotyczą zależności czasowej podawania substancji (np., przeciwciała anty-tnf ) aby osiągnąć terapeutyczne działanie (np., leczenie związanych z TNF zaburzeń). Dwutygodniowa procedura dawkowanie nie obejmuje tygodniowej procedury dawkowania. Wskazane, żeby substancja była podawana raz w którymś spośród dni 9-19, lepiej w którymś spośród dni 11-17 jeszcze lepiej w którymś spośród dni 13-15 i najlepiej co 14 dni. Termin połączenie" tak jak w wyrażeniu pierwszy środek w połączeniu z drugim środkiem" obejmuje wspólne podawanie pierwszego środka z drugim środkiem, który na przykład może być rozpuszczony lub razem zmieszany z tym samym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, albo po podaniu pierwszego środka podawany jest drugi, albo po podaniu drugiego środka podawany jest

PL 213 925 B1 7 środek pierwszy. Niniejszy wynalazek obejmuje więc sposoby łączenia terapeutycznych działań i łączenie farmaceutycznych kompozycji. Termin towarzyszące" w wyrażeniu towarzyszące terapeutyczne leczenie" obejmuje podawanie środka w obecności drugiego środka. Towarzyszący sposób terapeutycznego leczenia obejmuje sposoby, w których pierwszy, drugi, trzeci lub dodatkowe środki są wspólnie podawane. Towarzyszący sposób terapeutycznego leczenia także obejmuje sposoby, w których pierwszy lub dodatkowe środki są podawane w obecności drugiego lub dodatkowych środków, w których na przykład, drugi lub dodatkowe środki, mogły być podane poprzednio. Sposób towarzyszącego terapeutycznego leczenia może być wykonywany stopniowo przez różnych wykonawców. Na przykład jeden wykonawca może podawać leczonemu pierwszy środek i drugi wykonawca może podawać leczonemu drugi środek i etapy podawania mogą być wykonywane w tym samym czasie, lub prawie w tym samym czasie, albo w odległym czasie, tak długo, jak długo pierwszy środek (i dodatkowe środki) są obecne po podaniu drugiego środka (i dodatkowych środków). Wykonawca i leczony mogą być tą samą istotą (np., człowiekiem). Termin terapia łączona" tak jak to użyto tutaj odnosi się do podawania dwóch lub więcej terapeutycznych substancji, np. przeciwciała anty TNF i innego leku takiego jak DMRD lub NSAID. Inny lek (leki) może być podawany jednocześnie z, przed lub po podaniu przeciwciała dla TNF. Termin stan kliniczny z udziałem TNF lub związane z TNF zaburzenie" odnosi do miejscowych i/lub ogólnoustrojowych zaburzeń, w których TNF jest głównym mediatorem wiodącym do manifestowania się zaburzenia. Termin zaburzenie zapalne" lub choroba zapalna" tak jak wymiennie używa się tutaj dotyczy chorób przenoszonych przez stany zapalne, które także mają lub nie podłoże immunologiczne. Zaburzenia zapalne są zaburzeniami, w których nadmierna lub nieregulowana odpowiedź zapalna prowadzi do nadmiernych objawów zapalenia, niszczenia tkanki gospodarza lub utraty funkcji tkanki. Przykłady obejmują reumatyczny artretyzm, i artropatię kręgosłupa. W jednej z postaci, zaburzenia zapalne dotyczą chorób przenoszonych przez zapalenie, wyłączając zapalenie kości i stawów i reumatyczne zapalenie kręgosłupa. Termin choroby płucne", tak jak użyto to tutaj, dotyczy samoistnej śródmiąższowej choroby płuc i/lub chronicznej niedrożności dróg oddechowych. W jednej z postaci, termin choroba płucna obejmuje jakąś chorobę płuc i/lub chroniczną niedrożność dróg oddechowych wyłączając płuco wstrząsowe, chroniczne zapalenie płuc, sarkoidozę płucną, zwłóknienie płuc i silikozę. Termin samoistna śródmiąższowa choroba płuc" lub samoistne śródmiąższowe zaburzenie płucne" jak to jest tutaj używane wymiennie dotyczy którejkolwiek z kilku chorób o nieznanej etiologii z podobnymi cechami klinicznymi, powodującej rozprzestrzenianie się patologicznych zmian przede wszystkim w otworach międzypęcherzykowych płuc. Przykłady samoistnej śródmiąższowej choroby płuc obejmują, ale nie są ograniczone do, śródmiąższowego zwłóknienia płuc (IPF). W jednej z postaci, samoistne śródmiąższowe choroby płuc obejmują którąkolwiek z kilku chorób o nieznanej etiologii z podobnymi cechami klinicznymi powodującej rozprzestrzenianie się patologicznych zmian początkowo w otworach międzypęcherzykowych płuc, wyłączając płuco wstrząsowe, chroniczne zapalenie płuc, sarkoidozę płucną, zwłóknienie płuc i silikozę. Termin chroniczna niedrożność dróg oddechowych" tak jak użyto tutaj, odnosi się do chorób płucnych, które spowodowane są fizjologicznie zdeterminowaną chroniczną niedrożnością dróg oddechowych, bez względu na etiologię. Przykłady zaburzeń chronicznej niedrożności dróg oddechowych obejmują, ale nie są ograniczone do, astmę i chorobę chronicznej niedrożności płuc (COPD). W jednej z postaci zaburzenie chronicznej niedrożności dróg oddechowych obejmuje choroby spowodowane fizjologicznie zdeterminowaną chroniczną niedrożnością dróg oddechowych z wyłączeniem płuca wstrząsowego, choroby chronicznego zapalenia płuc, sarkoidozy płuc, zwłóknienia płuc i silikozy. Termin niedrożność dróg oddechowych" dotyczy zwiększonej oporności dla przepływu powietrza wykazywanej przy użyciu spirometrii. Termin zaburzenie sercowo-naczyniowe" lub zaburzenie wieńcowe" jak użyto tutaj wymiennie, dotyczy jakiejś choroby, zaburzenia lub stanu obejmującego układ sercowo-naczyniowy np., serce, naczynia krwionośne i/lub krew. Ogólnie, chorobę wieńcową, charakteryzuje się zwężeniem naczyń krwionośnych, które dostarczają krew i tlen do serca (tętnice wieńcowe). Choroba wieńcowa jest zazwyczaj wynikiem gromadzenia się złogu i materiału tłuszczowego. Gdy tętnice zwężają się, dopływ krwi do serca może się zmniejszyć lub ustać. Zaburzenia wieńcowe w odniesieniu do wynalazku, można stosować do jakiejkolwiek nieprawidłowości tętnic, strukturalnej, histologicznej, biochemicznej

8 PL 213 925 B1 lub jakiejś innej nieprawidłowości. Przykładem wieńcowej choroby serca jest nawrót zwężenia. W jednej z postaci, zaburzenie wieńcowe odnosi się do jakiejś choroby, zaburzenia lub stanu, który obejmuje układ sercowo-naczyniowy z wyłączeniem niedokrwienia serca i niewydolności serca. Termin nawrót zwężenia" tak jak użyto tutaj, odnosi się do powtarzającego się zwężenia, które jest zwężeniem lub ograniczeniem tętnicy. Nawrót zwężenia często pojawia się jako przedokluzyjna zmiana, która rozwija się w następstwie procesu rekonstrukcji w chorych naczyniach krwionośnych. Termin jest stosowany nie tylko do nawrotu uprzednio istniejącego zwężenia, ale także do poprzednio normalnych naczyń, które zostają częściowo okludowane w następstwie pomostu naczyniowego. W innej postaci, leczenia nawrotowego zwężenia obejmuje podawanie będącego przedmiotem wynalazku przeciwciała albo jego części wiążącej antygen podmiotowi, u którego występuje nawrót zwężenia lub ryzyko jego wystąpienia. Termin stent" tak jak użyto to tutaj dotyczy urządzenia, które jest włożone w światło anatomicznego naczynia, np., tętnicy, szczególnie w celu utrzymania otwarcia uprzednio blokowanej drogi przejścia. Stent jest używany do utrzymania przepływu płynów (np., krwi) z jednej części naczynia do drugiej i endogenne rusztowanie lub stent utrzymuje otwartą drogę przepływu w naczyniu podtrzymując przeszczep lub otoczkę. Stent jest często stosowany po angioplastyce balonowej, chociaż może być on użyty także jako bezpośrednia terapia leczenia nawrotu zwężenia. W jednej z postaci, stent jest stentem, z którego wymywa się lek. Termin wymywający lek" dotyczy stentu, który jest pokryty formułą leku, który uwalnia się w tempie wolnym do umiarkowanego. Terminy wymywający lek", uwalniający lek" lub pokryty lekiem" są tutaj używane wymiennie. Stent może być pokryty jakimś lekiem, który leczy chorobę wieńcową serca, włączając w to np., będące przedmiotem wynalazku przeciwciało lub jego część wiążącą antygen. W innej postaci stent dostarcza D2E7. W kolejnej postaci stent zawiera D2E7 w połączeniu z innym lekiem stosowanym w leczeniu choroby wieńcowej włączając w to deksametazon, alkeran, cytoksan, leukeran, cis-platynę, BiCNU, adriamycynę, doksyrubicynę, cerubidynę, idamycynę, mitracyna, mutamycynę, fiuorouracyl, metotreksat, tioguanina, toxotere, etopozyd, vincristin, irinotecan, hycamptin, matulane, vumon, heksalin, hydroksymocznik, gemzar, oncovin, etophophos, takrolimus (FK506) i następujące analogi sirolimusus'a: SDZ-RAD, CCI-779, 7-epirapamycyna, 7-tiometylo-rapamycyna, 7-epitrimetoxyfenyl-rapamycyna, 7-epi-tiometylo-rapamycyna, 7-demetoxy-rapamycyna, 32-demetoxy, 2-desmetyl i prolina. Termin zaburzenie metaboliczne" tak jak użyto tutaj, dotyczy chorób lub zaburzeń, które wpływają na to jak w organizmie zachodzą przemiany substancji potrzebnych do przenoszenia fizjologicznych funkcji. Przykłady chorób metabolicznych obejmują, choć nie są ograniczone do, cukrzycę i otyłość. W jednej z postaci wynalazku, termin zaburzenie metaboliczne", odnosi się do zaburzeń, które zmieniają w organizmie przemiany substancji potrzebnych do przenoszenia fizjologicznych funkcji z wyłączeniem cukrzycy autoimmunologicznej. Termin cukrzyca" lub zaburzenie cukrzycowe" lub cukrzyca" jak używane jest tutaj wymiennie, dotyczy choroby, która charakteryzuje się podwyższonym poziomem cukru (glukozy) we krwi. Cukrzyca może być powodowana albo zbyt małą ilością insuliny (związek chemiczny produkowany przez trzustkę potrzebny do regulacji poziomu cukru we krwi), opornością na insulinę lub oboma tymi czynnikami. Określenie choroby związane z cukrzycą", jak użyto to tutaj, odnosi się do stanów i innych chorób, które są zwykle związane z, lub odnoszą się do cukrzycy. Przykład zaburzeń związanych z cukrzycą obejmuje, na przykład hiperglikemię, hiperinsulinemię, hiperlipidemię, oporność na insulinę, upośledzony metabolizm glukozy, otyłość, retynopatię cukrzycową, zwyrodnienie plamki żółtej, kataraktę, nefropatię cukrzycową, stwardnienie kłębków nerkowych, neuropatię cukrzycową, dysfunkcję erekcji, syndrom przedmenstruacyjny, nawrót zwężenia naczyń, zapalenie okrężnicy wrzodziejące, chorobę wieńcową serca, nadciśnienie, anginę pektoris, zawał mięśnia sercowego, udar, zaburzenia skóry i tkanki łącznej, owrzodzenie stóp, kwasicę metaboliczną, artretyzm i osteoporozę. Termin otyłość", tak jak użyto tutaj, odnosi się do stanów, w których podmiot ma nadmiar tłuszczu w stosunku do beztłuszczowej masy ciała. W jednej z postaci, otyłość odnosi się do sytuacji, w której waga podmiotów przekracza przynajmniej o 20% lub więcej maksymalną wagę pożądaną dla ich wzrostu. Kiedy dorosły (on lub ona) ma ponad 100 funtów nadwagi, jest to uważane za chorobliwą otyłość. W innej postaci, otyłość jest zdefiniowana jako BMI (indeks masy ciała) przekraczający 30 kg/m 2. Termin niedokrwistość", tak jak użyto to tutaj, odnosi się do nienormalnie małej liczby krążących czerwonych krwinek lub obniżonego stężenia hemoglobiny we krwi.

PL 213 925 B1 9 Termin ból, tak jak użyto to tutaj, odnosi się do wszystkich typów bólu. Ten termin powinien odnosić się do bólu ostrego i przewlekłego, takiego jak ból neuropatyczny, pooperacyjny, przewlekły ból odcinka krzyżowego, ból głowy gromadny, neuralgia półpaścowa, bóle fantomowe kończyn, ból ośrodkowy, ból zęba, ból oporny na opioidy, ból wewnętrzny, ból chirurgiczny, ból porodowy, ból będący wynikiem poparzenia, włączając w to poparzenie słoneczne, ból poporodowy, migrena, ból anginowy, ból związany z przewodem moczowo-płciowym włączając w to cystę. Termin ten obejmuje także ból nocyceptywny i nocycepcję. Termin zaburzenia wątroby" tak jak użyto to tutaj, dotyczy chorób wątroby ssaków, lepiej człowieka lub stanów związanych z uszkodzeniem komórek wątrobowych lub zaburzeniem dróg żółciowych. W jednej z postaci, zaburzenia wątrobowe odnoszą się do choroby ludzkiej wątroby, stanów związanych z uszkodzeniem komórek wątrobowych lub zaburzeniem dróg żółciowych, wyłączając w to zapalenie wątroby, poalkoholowe zapalenie wątroby i wirusowe zapalenie wątroby. Termin dolegliwości skórne" lub choroba skóry", jak jest tutaj używane wymiennie, dotyczy innych niż zranienia nieprawidłowości skóry, które wywołały stan zapalny. W jednej z postaci, zapalenie skóry w rozumieniu tego wynalazku, jest zapalną chorobą skóry, gdzie występuje charakterystyczna kapilarna dylatacja, naciekanie leukocytów, zaczerwienienie, gorąco i/lub ból. Przykłady choroby skóry obejmują, ale nie są ograniczone do, łuszczycę, pęcherzycę zwykłą, twardzinę skóry, atopowe zapalenie skóry, sarkoidozę, rumień guzowaty, ropne zapalenie przydatków, liszaj płaski, syndrom Sweet'a i bielactwo nabyte. Termin łuszczyca" tak jak użyto tutaj dotyczy zaburzeń skóry związanych z rozrostem naskórka. Przykład łuszczycy obejmuje, ale nie jest ograniczony do, przewlekłą łuszczycę plackowatą, łuszczycę kroplowatą, łuszczycę odwróconą, łuszczycę trądzikową, łuszczycę zwykłą i łuszczycę z rumieniem skóry. Łuszczyca może także być związana z innymi zapalnymi zaburzeniami, włączając chorobę zapalenia jelit (IBD) i reumatyczne zapalenie stawów. Termin zdrowa skóra" lub normalna skóra" odnosi się do niezranionej skóry, tj., bez widocznego w sposób oczywisty rumienia, obrzęku, hiper-, hipo- lub nierównomiernej pigmentacji, formowania łuski, nadmiernego rogowacenia lub tworzenia pęcherzy. Histologicznie zdrowa, normalna skóra, odnosi się do tkanki skóry morfologicznie zawierającej dobrze zorganizowane warstwy podstawową, kolczystą i ziarnistą oraz spójną wielowarstwową warstwę naskórka. Termin zaburzenie paznokcia" lub choroba paznokcia" tak jak użyto tutaj, dotyczy stanów, gdzie paznokcie palców ręki lub nogi mają nieprawidłowy kolor, kształt, fakturę lub grubość. Termin zapalenie naczyń" jak jest używane tutaj wymiennie dotyczy grupy zaburzeń, która charakteryzuje się zapaleniem naczyń krwionośnych. Wszystkie rozmiary naczyń krwionośnych mogą podlegać zmianie, począwszy od największych naczyń w organizmie (aorta) do najmniejszych naczyń w skórze (kapilar). Rozmiar zmienianych naczyń krwionośnych różni się w zależności od typu zapalenia naczyń. Termin zestaw" tak jak tutaj użyto, dotyczy opakowanego produktu, zawierającego składniki, z którymi będące przedmiotem wynalazku przeciwciało dla TNF jest podawane w celu leczenia związanych z TNF chorób. Dobrze, żeby zestaw zawierał pudełko lub pojemnik, w którym trzymane są składniki zestawu. Do pudełka lub pojemnika jest przymocowane oznaczenie lub protokół zatwierdzony przez Urząd do Spraw Żywności i Leków. Pudełko lub pojemnik zawiera składniki wynalazku, które są umieszczone w naczyniach, wskazane, żeby były z plastiku, polietylenu, polipropyleny, etylenu lub propylenu. Naczynia mogą być zamykanymi probówkami lub butelkami. Zestaw może także zawierać instrukcję podawania będących przedmiotem wynalazku przeciwciał dla TNF. Różne aspekty wynalazku są dalej opisane w szczegółach. I. Inhibitory TNF będące przedmiotem wynalazku Wynalazek ten dostarcza przeciwciała do stosowania w leczeniu związanego z TNF zaburzenia, w którym korzystne jest podawanie inhibitora TNF. Izolowane ludzkie przeciwciała lub ich fragmenty wiążące antygen wiążą się do ludzkiego TNF z wysokim powinowactwem i małą szybkością dysocjacji i mają dużą pojemność neutralizującą. Dobrze, jeżeli przeciwciała będące przedmiotem wynalazku są zrekombinowanymi, neutralizującymi ludzkimi przeciwciałami anty-htnf. Najlepszym, będącym przedmiotem wynalazku ludzkim zrekombinowanym, neutralizującym przeciwciałem jest podawany tu D2E7, określany także jako HUMIRA i adalimumab (sekwencja aminokwasów regionu VL D2E7 jest pokazana w SEQ ID No: 1; sekwencja regionu VH D2E7 jest pokazana w SEQ ID NO: 2). Właściwości D2E7 (HUMIRA ) opisano w Slafeld i wsp., Patencie Stanów Zjednoczonych Nr 6 090 382, który jest tu włączony przez odnośnik.

10 PL 213 925 B1 W jednej z postaci leczenie przy użyciu wynalazku, obejmuje podawanie przeciwciał D2E7 lub części przeciwciała, przeciwciał pokrewnych z D2E7 i części przeciwciała oraz innych ludzkich przeciwciał i części przeciwciał z własnościami równoważnymi własnościom D2E7, takimi jak wysokie powinowactwo wiązania do htnf z niską kinetyką dysocjacji i wysoką pojemnością neutralizującą. W jednej z postaci, wynalazek dotyczy izolowanego ludzkiego przeciwciała albo jego części wiążącej antygen. Dysocjuje ono z ludzkiego TNF z K d wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej i stałą szybkości dysocjacji K off 1 x 10-3 s -1 lub mniej, obie wielkości oznaczono przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego. Neutralizuje ono cytotoksyczność ludzkiego TNF w standardowym badaniu in vitro L929 z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub mniej. Lepiej, żeby izolowane ludzkie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen dysocjowała z ludzkiego TNF z K off 5 x 10-4 s -1 lub mniej, jeszcze lepiej z K off 1 x 10-4 s -1 lub mniej. Lepiej, żeby izolowane ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen neutralizowała cytotoksyczność ludzkiego TNF w standardowym badaniu in vitro L929 z IC 50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub mniej, jeszcze lepiej z IC 50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub mniej, a nawet jeszcze lepiej IC 50 wynoszącym 1 x 10-10 M lub mniej. W preferowanej postaci przeciwciało jest izolowanym zrekombinowanym przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen. Jest dobrze znane w tej dziedzinie, że domeny CDR3 ciężkiego i lekkiego łańcucha odgrywają ważną rolę w specyficzności/powinowactwie wiązania przeciwciała do antygenu. Zgodnie z tym, innym aspektem jest leczenie związanego z TNF zaburzenia, w którym aktywność TNF jest szkodliwa, przez podawanie ludzkich przeciwciał, które mają powolną kinetykę dysocjacji dla wiązania z htnf i które mają domeny CDR3 lekkiego i ciężkiego łańcucha, które są strukturalnie identyczne z lub odpowiadają tym w D2E7. Pozycja 9 w CDR3 VL D2E7 może być zajęta przez Ala lub Thr bez istotnej zmiany K off. Zgodnie z tym uzgodniony wzór dla VL CDR3 D2E7 zawiera sekwencję aminokwasów: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO: 3). Dodatkowo Pozycja 12 w CDR3 VH D2E7 może być zajęta przez Tyr lub Asn bez istotnej zmiany K off. Zgodnie z tym uzgodniony wzór dla VH CDR3 D2E7 zawiera sekwencję aminokwasów: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO: 4). Co więcej, tak jak przedstawiono w przykładzie 2 Patentu Stanów Zjednoczonych Nr 6 090 382, domeny CDR3 łańcuchów ciężkiego i lekkiego D2E7 są podatne na podstawienie pojedynczą resztą alaninową (w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 wewnątrz VL CDR3 lub w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 wewnątrz VH CDR3) bez istotnego wpływu na K off. Co więcej, osoby wprawne w tej dziedzinie zdają sobie sprawę, że dana podatność domen CDR3 VL i VH D3E7 na podstawienie przez alaninę, podstawienie innych aminokwasów wewnątrz domen CDR3 może być możliwe przy ciągle zachowanej niskiej stałej szybkości dysocjacji przeciwciała, szczególnie przy podstawieniach konserwatywnymi aminokwasami. Wskazane, żeby nie było więcej niż jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów wewnątrz domen CDR3 VL i/lub VH D2E7. Lepiej żeby nie było więcej niż jedno do trzech podstawień konserwatywnych aminokwasów wewnątrz domen CDR3 VL i/lub VH D2E7. Dodatkowo, podstawienia konserwatywnych aminokwasów nie powinny być robione w pozycjach aminokwasów krytycznych dla wiązania do htnf. Pozycje 2 i 5 VL CDR3 D2E7 i pozycje 1 i 7 VH CDR3 D2E7 są krytyczne dla interakcji z htnf i dlatego wskazane jest, żeby podstawienia konserwatywnych aminokwasów nie były robione w tych pozycjach (chociaż, jak to opisano powyżej, podstawienie alaniny w pozycji 5 VL CDR3 D2E7 jest dopuszczalne) (patrz Patent Stanów Zjednoczonych Nr 6 090 382). Zgodnie z tym, w innej postaci, wynalazek dostarcza przeciwciało lub jego część wiążącą antygen posiadającą następującą charakterystykę: a) dysocjuje z ludzkiego z TNF ze stałą szybkości K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, jak oznaczono przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego; b) ma domenę CDR3 lekkiego łańcucha zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jeden do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, i/lub 9; c) ma domenę CDR3 ciężkiego łańcucha zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10 lub 11 lub przez jeden do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12. Bardziej korzystnie, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen oddysocjowuje z ludzkiego TNF z K off wynoszącą 5 x 10-4 s -1 lub mniej. Jeszcze bardziej korzystnie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen oddysocjowuje z ludzkiego z TNF z K off wynoszącą 1 x 10-4 s -1 lub mniejszą.

PL 213 925 B1 11 W jeszcze innej postaci, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen zawiera zmienny region lekkiego łańcucha (LCVR) mający domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 i zmienny region ciężkiego łańcucha (HCVR) mający domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4 lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11. Wskazane, żeby LCVR miało domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 5, (tzn. D2E7 VL CDR2) i dalej żeby HCVR miało domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO; 6 (tzn. D2E7 VH CDR2). Jeszcze lepiej, żeby LCVR dalej miało domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 7 (tzn. D2E7 VL CDR1) i HCVR miało domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 8 (tzn. D2E7 VH CDR1). Dobrze jeżeli regiony zrębowe dla VL są z rodziny ludzkiej linii zarodkowej V I, jeszcze lepiej z genu Vk ludzkiej linii zarodkowej A20 i najlepiej z pokazanej na Ryc. 1A i 1B Patentu Stanów Zjednoczonych Nr 6 090 382, sekwencji zrębu VL D2E7. Dobrze jeżeli regiony zrębowe dla VH są z rodziny ludzkiej linii zarodkowej V H 3, jeszcze lepiej z genu VH ludzkiej linii zarodkowej DP-31 a najlepiej z pokazanej na Ryc. 2A i 2B Patentu Stanów Zjednoczonych Nr 6 090 382, sekwencji zrębu VH D2E7. Zgodnie z tym, w innej postaci przeciwciało lub jego część wiążąca antygen zawiera zmienny region lekkiego łańcucha (LCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 (tzn. D2E7 VL) i zmienny region ciężkiego łańcucha (HCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2 (tzn. D2E7 VH). W pewnych postaciach, przeciwciało zawiera stały region ciężkiego łańcucha, taki jak stały region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD. Dobrze jeżeli stałym regionem ciężkiego łańcucha jest stały region ciężkiego łańcucha IgG1 lub stały region ciężkiego łańcucha IgG4. Co więcej, przeciwciało może zawierać stały region lekkiego łańcucha albo stały region lekkiego łańcucha kappa albo stały region lekkiego łańcucha lambda. Wskazane, żeby przeciwciało zawierało stały region lekkiego łańcucha kappa. Alternatywnie, część przeciwciała może być na przykład fragmentem Fab lub fragmentem pojedynczego łańcucha Fv. W jeszcze innych postaciach, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen zawiera związane z D2E7 domeny CDR3 VL i VH, na przykład przeciwciała lub ich części wiążące antygen zawierające zmienny region lekkiego łańcucha (LCVR) mający domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 i SEQ ID NO: 26, lub zmiennego regionu ciężkiego łańcucha (HCVR) mającego domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO; 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 i SEQ ID NO: 35. W innej postaci, inhibitorem TNF jest etanercept (opisany w WO 91/03553 i WO 09/406476), infliksimab (opisany w Patencie Stanów Zjednoczonych Nr 5 656 272), CDP571 (humanizowane monoklonalne przeciwciało anty TNF- IgG4), CDP 870 (fragment humanizowanego monoklonalnego przeciwciała anty TNF- ), D2E7 (ludzkie mab anty TNF) rozpuszczalny receptor dla TNF typ I, lub pegylowany rozpuszczalny receptor dla TNF typ I (PEG TNF-R1). Będące przedmiotem wynalazku przeciwciało dla TNF może być modyfikowane. W pewnych postaciach, przeciwciało dla TNF albo jego fragment wiążący antygen jest chemicznie modyfikowane w celu otrzymania pożądanych efektów. Na przykład, pegylacja przeciwciał fragmentów przeciwciał będących przedmiotem wynalazku może być przeprowadzana przez jakiekolwiek reakcje pegylacji znane w tej dziedzinie, jak opisano, na przykład w następujących odnośnikach: Focus on Growth Factors 3: 4-10 (1992); EP 054 316; i EP 0 401 384 (każdy z nich jest włączony całościowo przez referencje). Wskazane, żeby pegylacja była przeprowadzana poprzez reakcję acylacji lub reakcję alkilacji z reaktywną cząsteczką glikolu polietylenowego (lub z podobnie reaktywnym rozpuszczalnym w wodzie polimerem). Wskazanym do pegylacji będących przedmiotem wynalazku przeciwciał lub fragmentów przeciwciał, rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy (PEG). Jak użyto tutaj, termin glikol polietylenowy" obejmuje jakiekolwiek formy PEG, które mogą być użyte do derywatyzacji innych białek, takie jak mono (CL-CLO) alkoksy- lub aryloksy- glikol polietylenowy. Ogólnie sposoby otrzymywania pegylowanych, będących przedmiotem wynalazku przeciwciał i fragmentów przeciwciał będą zawierały etapy (a) reakcji przeciwciała lub fragmentu przeciwciała z glikolem polietylenowym, takim jak reaktywny ester lub aldehyd będące pochodnymi PEG, w takich

12 PL 213 925 B1 warunkach, że przeciwciało lub fragment przeciwciała zostaje przyłączone do jednej lub więcej grup PEG i (b) otrzymywanie produktów reakcji. Dla biegłych w tej dziedzinie będzie oczywiste wybranie optymalnych warunków reakcji lub reakcji acylacji w oparciu o znane parametry i pożądany wynik. Ogólnie, pegylowane przeciwciała i fragmenty przeciwciał mogą być używane do leczenia będących przedmiotem wynalazku zaburzeń związanych z TNF, przez podawanie przeciwciał dla TNF i fragmentów przeciwciał, jak to opisano tutaj. Ogólnie, pegylowane przeciwciała i fragmenty przeciwciał mają zwiększony okres półtrwania w porównaniu do niepegylowanych przeciwciał i fragmentów przeciwciał. Pegylowane przeciwciała i fragmenty przeciwciał mogą być stosowane same, razem lub w połączeniu z innymi farmaceutycznymi kompozycjami. W jeszcze innej postaci, przeciwciała dla TNF lub ich fragmenty mogą być zmienione tak, że stały region jest zmodyfikowany w celu zredukowania w stosunku do niezmodyfikowanego przeciwciała, przynajmniej jednej biologicznej efektorowej funkcji przenoszonej przez stały region. W celu zmodyfikowania będącego przedmiotem wynalazku przeciwciała tak, że wykazuje zredukowane wiązanie do receptora Fc, segment stałego regionu immunoglobuliny może być mutowany w konkretnych regionach niezbędnych do interakcji z receptorem Fc (FcR) (patrz Canfield S.M. i S.L. Morrison (1991) J. Exp. Med. 173: 1483-1491; i Lund J. i wsp (1991) J Immunol 147: 2657-2662). Redukcja w zdolności wiązania przeciwciała przez FcR może redukować także inne efektorowe funkcje, które zależą od interakcji FcR, takie jak opsonizacja, fagocytoza i zależna od antygenu komórkowa cytotoksyczność. Będące przedmiotem wynalazku przeciwciało lub część przeciwciała może być derywatyzowane lub przyłączone do innej funkcjonalnej cząsteczki (np. innego peptydu lub białka). Zgodnie z tym, będące przedmiotem wynalazku przeciwciała i części przeciwciał mają obejmować derywatyzowane i w inny sposób zmodyfikowane formy ludzkich przeciwciał anty-htnf tak jak opisano tutaj, włączając immunoadhezyjne cząsteczki. Na przykład będące przedmiotem wynalazku przeciwciało lub część przeciwciała, może być funkcjonalnie połączone (przez chemiczne sparowanie, genetyczną fuzję, niekowalencyjną asocjację lub inne) do jednej lub więcej jednostek molekularnych, takich jak inne przeciwciało (np. bispecyficzne fragmenty przeciwciała lub fragmenty przeciwciała (ang. Diabodies)), czynnik umożliwiający detekcję, czynnik cytotoksyczny, czynnik farmaceutyczny i/lub białko lub peptyd, które może przenosić przeciwciało lub jego część związaną z inną cząsteczką (tak jak region rdzenia streptoavidyny lub polihistydynowy tag). Jeden typ derywatyzowanych przeciwciał jest wytwarzany przez wiązanie krzyżowe dwóch lub więcej przeciwciał (tego samego lub różnych typów, np. żeby utworzyć bispecyficzne przeciwciała). Odpowiednie kroslinkery obejmują te, które są heterobifunkcyjne, mające dwie odmiennie reaktywne grupy rozdzielone przez odpowiedni separator (np. ester m-maleimidobenzoilo-n-hydroksysukcyimidu) lub homobifunkcjonalne (np. disuccinimidylo suberan). Takie linkery są dostępne w Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Użyteczne, pozwalające na detekcję czynniki z którymi może być derywatyzowane będące przedmiotem wynalazku przeciwciało lub część przeciwciała obejmują związki fluorescencyjne. Przykładowo fluorescencyjne, pozwalające na detekcję czynniki obejmują fluresceinę, izocjonian fiuoresceiny, rodaminę, chlorek 5-dimetyloamino-1-naftalenosulfonylu, fikoerytrynę i podobne. Przeciwciało może być także derywatyzowane z dającymi się wykrywać enzymami takimi jak fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa, oksydaza glukozy i temu podobne. Jeżeli przeciwciało jest derywatyzowane z dającym się wykrywać enzymem, jest ono wykrywane poprzez dodanie dodatkowych odczynników, których enzym używa do wytworzenia dającego się wykryć produktu reakcji. Na przykład, kiedy jako pozwalający na detekcję czynnik występuje peroksydaza chrzanowa, dodanie nadtlenku wodoru i dwuaminobenzydyny prowadzi do otrzymania kolorowego produktu reakcji, który może być wykryty. Przeciwciało może także być derywatyzowane z biotyną i wykrywane przez pośredni pomiar związku z awidyną lub streptoawidyną. Będące przedmiotem wynalazku przeciwciało lub część przeciwciała, może być otrzymane przez ekspresję rekombinanta genów lekkiego i ciężkiego łańcucha immunoglobuliny w komórce gospodarza. Dla ekspresji przeciwciała otrzymanego w drodze rekombinacji, komórka gospodarza jest transfekowana jednym lub więcej zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym przenoszącym fragmenty DNA kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy immunoglobuliny tak, że w komórce gospodarza zachodzi ekspresja lekkich i ciężkich łańcuchów i wskazane, żeby były one wydzielane do pożywki, w której komórki gospodarza są hodowane. Z tej pożywki przeciwciała są odzyskiwane. Standardowe techniki rekombinacji DNA, stosowane do otrzymywania genów lekkich i ciężkich łańcuchów przeciwciała włączają te geny do zrekombinowanych wektorów ekspresyjnych i wprowadzają te wektory do komórek