PEŁNOMOCNIK REKTORA ds. specjalizacji dla diagnostów laboratoryjnych Adres do korespondencji: Katedra Biochemii Klinicznej Zakład Medycyny Laboratoryjnej Gdański Uniwersytet Medyczny ul. Dębinki 7, 80-211 Gdańsk tel. 349 27 70, email: aszut@gumed.edu.pl, kbk@gumed.edu.pl strona www.diagnostalaboratoryjny.gumed.edu.pl Prof. dr hab.med. Andrzej Szutowicz Ocena pracy doktorskiej mgr Anny Jaworskiej pt. Investigation of cellular processes involved in Alzheimer s disease: gamma-secretase activity and calcium homeostasis maintenance Ocenę przeprowadzono na podstawie uchwały Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk z dnia 7 grudnia 2016r., pismo RN / SPD 12 597/2016. Rozprawa doktorska mgr Anny Jaworskiej została wykonana w Laboratory of Neurodegeneration at International Institute of Molecular and Cell Biology w Warszawie pod kierunkiem profesora Jacka Kuźnickiego. Stanowi ona kolejny etap szeroko zakrojonych, wieloletnich badań nad mechanizmami homeostazy wapnia w warunkach fizjologicznych i patologicznych, prowadzonych pod kierunkiem jej Promotora. Sygnał wapniowy jest uznawany za najbardziej pierwotny/podstawowy element utrzymania homeostazy wewnątrzkomórkowej w warunkach fizjologicznych, a jednocześnie za wielokierunkowo działający sygnał patogenny. Na początku dysertacji brak jest informacji, że część danych została już opublikowana w dwóch pracach: Jaworska i wsp. BBA 2013 i Brendel, Jaworska i wsp. 2015. Fakt ten zwiększa wartość rozprawy dowodząc, że część wyników została już poddana wcześniejszej weryfikacji. Przedstawiona praca stanowi próbę połączenia limfocytarnego modelu zaburzeń homeostazy wapnia u ludzi z chorobą Alzheimera (AD) z badaniami amyloidozy i struktury mózgu AD transgenicznych myszy traktowanych związkami hamującymi amyloidogenezę. W przedstawionym kształcie dysertacja stanowi raczej luźne połączenie dwóch odległych modeli doświadczalnych, w których badane były różne aspekty patomechanizmów tej choroby. Badania na jednolitych modelach doświadczalnych wykazują, że amyloid beta powoduje zarówno ostre jak i przewlekłe zaburzenia transportu i dystrybucji Ca. Wiadomo również, że pierwotna dysfunkcja homeostazy wapnia wywołuje zmiany w procesach amyloidogenezy. Dlatego próba połączenia wspólnym mechanizmem zmian w limfocytach w przebiegu, sporadycznej AD, gdzie patologia amyloidowa 1
nie jest obecna na obwodzie, ze zmianami w mózgach zwierząt z genetyczną uogólnioną postacią tej choroby trudno uznać za trafione. W konsekwencji oba podejścia doświadczalne należałoby traktować, jako dotyczące dwóch oddzielnych postaci tej choroby genetycznie uwarunkowanej i sporadycznej. Ta rozdzielność zawarta jest w tytule, jak również można ją zauważyć w różnych miejscach dysertacji. Jest to jednak sprzeczne z deklarowanymi dążeniami autorki do połączenia, za wszelka cenę, wspólnym patomechanizmem obu modeli doświadczalnych. We wstępie można wyraźnie wyodrębnić trzy części. Pierwsza z nich to jasno opisane, dobrze znane fakty dotyczące cech klinicznych, epidemiologicznych i diagnostyczno-biochemicznych AD. Druga prezentuje w sposób zwięzły dwie hipotezy AD: amyloidową i wapniową oraz zmiany strukturalne elementów neuronów mózgu wiązane przyczynowo z tymi sygnałami neurodegeneracyjnymi, które również są skorelowane z ubytkami funkcji poznawczych. Hipoteza wapniowa AD jest opisana dość ogólnie tak, że trudno jest na tej podstawie znaleźć racjonalne uzasadnienie samej chęci powtórzenia i weryfikacji istniejących wyników (In my work, I wanted to reproduce and verify.). Należałoby sprecyzować, jakie elementy poprzednich badań są niejasne/kontrowersyjne i wymagają ponownego przetestowania. A takich jest wiele. W podrozdziale 7 został opisany w sposób ogólny stan wiedzy dotyczący doświadczalnych terapii z zastosowaniem inhibitorów amyloidogenezy. Wyodrębnienie tego zagadnienia jest jak najbardziej uzasadnione w związku z tematem wiodącym dysertacji. Jednak tutaj zabrakło, do pełnego obrazu state of art, danych dotyczący licznych badań przedklinicznych różnych inhibitorów beta i gamma sekretaz. Stwarza to problem z wyartykułowaniem odpowiedniego jasnego celu pracy mającej wykazać, jak się wydaje, unikalne właściwości badanych inhibitorów. Podrozdział 8 w sposób zwięzły, lecz wyczerpujący przestawia problematykę kolców dendrytycznych w AD, i jednocześnie uzasadnia ich badanie, jako wskaźnika skuteczności antyamyloidowej RO5506284 i FRM-18588. Pewne zaskoczenie wzbudza trzecia część wstępu zawarta w podrozdziale 9. Dotyczy ona historycznych i technicznych aspektów oraz cech użytkowych mikroskopii fluorescencyjnej oraz dwufotonowej mikroskopii in vivo. Jest to opis narzędzi badawczych, a nie problemów naukowych związanych z zaburzeniami białkowo-wapniowymi w AD. W żadnym stopniu nie przybliża to czytelnika do racjonalnego wyjaśnienia celu pracy. Jest on więc niepotrzebny. Mógłby natomiast być umieszczony w materiałach lub metodach czy też w dyskusji przy interpretacji jakości i zawartości obrazów mikroskopowych. Taki układ wstępu powoduje, że autorka nie podaje w pełni racjonalnego zunifikowanego celu badań oraz podjętych w związku tym prac doświadczalnych. Materiały i metody. Część zawierająca opis doświadczeń na zwierzętach transgenicznych może być uznana za wzorcową ze względu na przejrzysty układ, zwięzłość oraz informatywność opisów 2
metod badawczych. W podrozdziałach 11.2, 11.3, 11.4 zwracają uwagę końcowe zdania: All experiments were done in Forum Pharmaceuticals. Czy oznacza to, że badania te wykonali pracownicy tej firmy czy, że zostały one wykonane przez doktorantkę na terenie w/w? Natomiast w części 21 opisującej doświadczenia na limfocytach ludzkich za niewystarczające należy uznać dane dotyczące probantów. W opisach poszczególnych pacjentów w Tabeli 1 brakuje informacji o lekach powszechnie stosowanych u ludzi w wieku bardzo dojrzałym takich jak: beta blokery, moczopędne, niesterydowe leki przeciwzapalne, przeciwzakrzepowe, a u chorych z AD dodatkowo inhibitory acetylocholinesterazy, antagoniści receptorów NMDA, które w różny sposób mogą modyfikować dystrybucję Ca w przedziałach komórkowych organizmu. I tak np. antagoniści receptorów NMDA hamują transport Ca 2+ w limfocytach B (Simma i wsp. 2014, Cell Commun Signal) itp. Oczywiście, 24 godz. hodowla w RPMI mogła spowodować usunięcie części leków, lecz niekoniecznie spowodowanych przez nie modyfikacji adaptacyjnych tych komórek. Należałoby przedyskutować ten problem przy interpretacji wyników, lub przynajmniej podać w Tabeli 1 jakie leki przyjmowali pacjenci. Opisy izolacji limfocytów B, ich hodowli oraz pomiarów parametrów wapniowych związanych z SOCE i receptorem IP 3, i ich opracowania, są w pełni zadowalające. Pojawiają się sporadycznie błędy literowe np. str. 54, l. 17 methylene zamiast ethylene itp. W rozdziale Aims of Work dwa cele badawcze pracy wydają się oczywiste. Jednakże uzasadnienie dla ich podjęcia w kontekście znanych bogatych danych literaturowych na te tematy, nie zostało we wstępie podane. Można się domyślać, że element nowości stanowią dwa nowo wynalezione związki przeciw-amyloidowe. Po raz pierwszy spotkałem się z celem pracy umieszczonym po Metodach. To tylko uwaga redakcyjna, nie mająca wpływu na treści merytoryczne dysertacji. W rozdziale Wyniki kandydatka w sposób przejrzysty zaprezentowała dwa oddzielne zestawy danych doświadczalnych. W podrozdziale 29 przedstawiła ona własne, już opublikowane, dane dotyczące biodostępności RO5506284, u myszy Tg, zalecając zapoznanie się ze szczegółami w publikacji [72] (Brendel, Jaworska i wsp. 2013). Wykazano, że podawanie 30mg/kg RO przez 6 miesięcy wyraźnie obniża poziom amyloidu beta 1-42 w mózgach myszy Tg mierzonego % powierzchni i liczbą płytek amyloidowych. Związek zwiększał gęstość kolców postsynaptycznych (PSD-95), lecz nie presynaptycznych (synapsyna) w korze wzrokowej, ruchowej i hipokampie zarówno zwierząt Tg jak i WT. Dane te wskazują na potencjalną aktywność anty-amyloidogenną RO5506284 przy podawaniu droga doustną. Publikacja stanowiąca podstawę większości danych zamieszczonych w dysertacji ma 15 współautorów. Należałoby podać udział kandydatki, jako drugiego autora, w powstaniu tych danych. 3
Badania biodostępności FRM18588 zostały wykonane w ramach dysertacji. Przedstawiają one szybkość wchłaniania i eliminacji z mózgu jednej wybranej dawki związku. Jednakże brak jest badań zależności od dawki, która jest równie ważnym elementem w badaniu biodostępności i toksyczności nowych związków o potencjale terapeutycznym. Dlatego należałoby wyjaśnić, dlaczego wybrano dawkę 80 mg/kg? Brak jest również jakiejkolwiek wzmianki czy były to myszy Tg czy WT? Z ryc. 19B można wnioskować, że były to jednak myszy Tg. Czy informacja w legendzie tej ryciny: Data obtained by Forum Pharmaceuticals oznacza, że były one wykonane przez pracowników firmy i przekazane doktorantce? W tytule podrozdziału 29.2.2. podano, że FRM18588 nie zmienia gęstości kolców dendrytycznych. W tekście (str 71/72), że badano to zarówno u zwierząt Tg jak i WT. Jednakże w dalszej części tekstu jak również na Ryc. 21, 23 występuje tylko jedna grupa zwierząt podzielona na podgrupy otrzymujące i nieutrzymujące FRM. Jakie to są zwierzęta Tg czy WT, a może połączone w jedną grupę? Należy zgodzić się z wnioskiem, że związek nie wywiera działania neurotoksycznego, przynajmniej w zakresie liczby i plastyczności kloców dendrytycznych w trzech regionach kory mózgowej. Ale nie wiadomo, czy dotyczy to zwierząt Tg. W związku tym wniosek końcowy na str. 72: This study show that GSM (chodzi chyba o FRM-18588) does not alter the spine density while reducing Aβ level significantly nie jest uprawniony. Autorka nie mierzyła poziomu amyloidu w tych doświadczeniach. Doświadczenie na ryc. 19 nie może być brane pod uwagę, bo dotyczy kilkugodzinnej obserwacji na myszach Tg podczas gdy eksperymenty na Ryc. 21, 23 prowadzono w wielotygodniowym przedziale czasowym prawdopodobnie na myszach WT. Taka rozbieżność powinna być ewentualnie przedyskutowana, czego nie uczyniono. Druga część wyników, już opublikowana (Biochim Biophys Acta, (2013) 1833, 1892-1899), poza wymienionymi wyżej zastrzeżeniami dotyczącymi informacji o probantach (Materiały i Metody), jest zaprezentowana bardzo dobrze. Istnieje bardzo mało doniesień dotyczących zaburzeń transportu i kompartmentacji Ca w limfocytach w starzeniu, a jeszcze mniej (około 10) w chorobie Alzheimera. Stąd doświadczenia te dostarczają oryginalnych/nowatorskich danych na temat obwodowego elementu patomechanizmu tej choroby. Oprócz tego, wyjaśnia zarówno sposób pomiarów fukcjonalnych puli wewnątrz limfocytarnego Ca 2+ jak i ich matematycznej interpretacji. Przedstawienie wyników za pomocą scattergramów dla poszczególnych grup probantów NDS, MCI i SAD charakteryzuje je zarówno pod względem ilościowym jak i jakościowym, indywidualnie oraz jako grupę. Wykazują one, że limfocyty B osób bez upośledzenia funkcji poznawczych zawierały większą niż SAD frakcję komórek wykazujących oscylacje spontaniczne Ca 2+, lecz mniejszą frakcję komórek odpowiadających influksem Ca 2+ zewnątrzkomórkowego na stymulację IgM, w środowisku wysoko-wapniowym. Oryginalną obserwacją jest wykazanie jednakowej/prawidłowej sekwestracji Ca w reticulum endoplazmatycznym we wszystkich grupach, 4
demonstrowanej jego uwalnianiem przez tapsigarginę. Natomiast trudnym do wytłumaczenia, bez dodatkowych doświadczeń, jest izolowany wzrost bazowego poziomu Ca i SOCE w limfocytach B pacjentów z MCI. W Tabeli 2 wartość w rubryce Fold change w pierwszej linijce powinna wynosić 0.7, ponieważ wartość SAD jest mniejsza od NDS. Układ dyskusji wyraźnie odzwierciedla dwa dość odległe zagadnienia będące przedmiotem dysertacji. Dużym utrudnieniem jest brak odnośników do rycin i tabel będących przedmiotem interpretacji. Duża część tekstu dyskusji powinna znaleźć się we wstępie. I tak cała str. 85 bardzo dobrze uzasadnia cel pracy, lecz nie ma nic wspólnego z interpretacją uzyskanych wyników. Podobne fragmenty przynależne do wstępu można znaleźć w dalszych podrozdziałach dyskusji. Nie można również zgodzić się z tezą, że decyzja połączenia dwóch oddzielnych projektów wynika ze wspólnego punktu uchwytu, jakim jest amyloid-beta. Owszem pierwszy projekt nowatorski, dotyczy modyfikacji genetycznie uwarunkowanej amyloido-genezy przez 1 nowy inhibitor gammasekretazy - RO550624. Przedstawia również wstępne dane dla drugiego wskazując na jego nietoksyczność u myszy WT przy długotrwałym stosowaniu, lecz bez udokumentowanej przewlekłej aktywności anty-amyloidowej. Ani w dyskusji ani we wstępie autorka nie ustosunkowała się do bardzo konkretnych danych dotyczących istniejących już i badanych przedklinicznie i klinicznie związków takich jak: inhibitory BACE 1 : LY2811376, LY2886721, MK-8931 lub inhibitory gamma-sekretazy: LY4501139, BMS-708163, czy też PT 3084014 (IC 50 =1.2 nm) i szereg innych. Bez takiego porównania trudno zorientować się w zaletach czy też wadach nowych związków w stosunku do już zbadanych. Z kolei porównywanie siły działania dwóch własnych związków (str. 90) wydaje się mało uzasadnione w świetle przedstawianych wyników. Stosowano różne dawki związków (30 mg/kg dla RO i 80 mg/kg dla FRM), mierzono poziom amyloidu różnymi metodami dającymi słabo porównywalne wyniki (histochemia i ELISA), oraz model przewlekły z modelem ostrym. Druga część, chociaż bardziej oryginalna w ogóle tej kwestii nie porusza. Bada ona bowiem zaburzenia homeostazy Ca 2+ w limfocytach B u osób ze sporadyczną chorobą Alzheimera. Nie są one w tych przypadkach spowodowane przez amyloid-beta, którego poziom, w obwodowych przedziałach organizmu (w tym w osoczu i komórkach krwi) pacjentów SAD nie ulega zmianie. Zmiany amyloidowe są obecne jedynie w mózgach SAD. Obserwuje się tam akumulację amyloidubeta w przedziałach wewnątrzkomórkowych i jego obniżenie w przedziale zewnątrzkomórkowym (co jest laboratoryjnym markerem diagnostycznym). Tak więc zaburzenia metabolizmu Ca w leukocytach SAD mogą wynikać raczej z patologii zewnątrzmózgowych, które ją inicjują i utrzymują neurodegenerację (epizody niedotlenienia, stany zapalne, hipoglikemie, niedobory pirofosforanu tiaminy itp.). Co więcej, grupy kontrolnej nie stanowili healthy volunteers, o 5
których bardzo trudno w tej grupie wiekowej, lecz chorzy z chorobami układu sercowo- 6