Biologia molekularna ćwiczenia Zakład Wirusologii

Biologia molekularna ćwiczenia Zakład Wirusologii Warszawa 2012

Zakład Wirusologii Instytut Mikrobiologii p. 440 A tel. 55-41-419 lub 55-41-421 Prowadzący: ćwiczenie 1 dr Monika Radlińska ćwiczenie 2 dr Agnieszka Kwiatek ćwiczenie 3 dr Monika Radlińska, dr Monika Adamczyk-Popławska ćwiczenie 4 dr Monika Adamczyk-Popławska 2

Część teoretyczna ĆWICZENIE 1 Enzymy restrykcyjne i rekombinacja DNA in vitro Zjawisko restrykcji modyfikacji Zjawisko restrykcji i modyfikacji (RM) zostało po raz pierwszy opisane w latach pięćdziesiątych zeszłego wieku (Luria i Human, 1952; Bertani i Weigle, 1953). Zaobserwowano, Ŝe namnaŝanie się bakteriofagów bywa w pewnym stopniu hamowane w zaleŝności od rodzaju szczepu bakteryjnego podlegającego infekcji. Biochemiczne podłoŝe i enzymy odpowiedzialne za to zjawisko scharakteryzowali Arber i Dussoix (1962). W 1978 r. Werner Arber, Hamilton O. Smith i Daniel Nathans otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyna za odkrycie enzymów restrykcyjnych, które doprowadziło do rozkwitu technologii rekombinacji DNA. MTaza MTaza CH 3 CH 3 REaza REaza Chromosom prokariotyczny CH 3 REaza MTaza fragmenty zdegradowanego fagowego DNA CH 3 MTaza Ryc. 1.1 Zjawisko restrykcji-modyfikacji. W systemie RM wyróŝnia się dwie aktywności enzymatyczne: endonukleolityczną (endonukleaza restrykcyjna, ang. restriction endonuclease, REaza) oraz modyfikującą (metylotransferaza DNA, metylaza DNA, ang. methyltransferase, MTaza), które rozpoznają w DNA tę samą, specyficzną sekwencję. MTaza modyfikuje określoną zasadę w sekwencji rozpoznawanej. Jeśli sekwencja docelowa nie jest zmetylowana, REaza przeprowadza cięcie endonukleolityczne DNA (Ryc. 1.1 i 1.2). Zmodyfikowany genomowy DNA, w komórce posiadającej system RM, nie jest substratem dla REazy z tego systemu. Natomiast obcy DNA (np. infekującego faga) zostaje rozpoznany przez REazę i strawiony. Mechanizm obronny komórek bakteryjnych przed obcym DNA np. bakteriofagowym jest główną postulowaną funkcją systemów RM (Arber i Dussoix, 1962). Według innej hipotezy są one samolubnymi elementami genetycznymi, których utrzymanie w genomie jest warunkiem przetrwania - rodzaj systemu trucizna-odtrutka (Kobayashi, 2001). Sugeruje się teŝ ich udział w utrzymywaniu toŝsamości gatunkowej bakterii (Jeltsch, 2003) oraz, to, Ŝe przez indukowanie rearanŝacji genomowych przyczyniają się do zróŝnicowania genetycznego (Arber, 2000). 3

5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 REaza MTaza CH 3 CH 3 Ryc. 1.2 Ta sama substratowa sekwencja w DNA dla endonukleazy restrykcyjnej i metylotransferazy DNA róŝne produkty reakcji przeprowadzanych przez te enzymy. Ze względu na róŝnorodność i mnogość przedstawicieli REaz oraz towarzyszących im MTaz, systemy RM zostały podzielone na cztery typy (Roberts i wsp., 2003; Tabela 1). Do Typu I zaliczono kompleksy białkowe złoŝone z trzech rodzajów podjednostek: rozpoznających specyficzną sekwencję (S), endonukleolitycznych (R) i modyfikacyjnych (M). Enzym do cięcia wymaga obecności ATP. Sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna i składa się z dwóch krótkich odcinków zasad o określonej specyficzności, przedzielonych kilkoma niespecyficznymi parami nukleotydów (np. EcoKI AACN 6 GTGC). Systemy Typu II stanowi najliczniejszą grupę, składającą się najczęściej z dwóch oddzielnych białek: monomerycznej MTazy i dimerycznej ENazy. Sekwencja docelowa jest krótka (4 do 8 par zasad) i często palindromiczna. Systemy Typu III RM składając się z dwóch rodzajów podjednostek: modyfikacyjnej (Mod) i endonukleolitycznej (Res). Miejsce rozpoznawane przez te enzymy, o długości 5-6 par zasad, jest niepalindromiczne (do cięcia wymagane są jego dwie kopie), a takŝe ATP. Natomiast do Typu IV zaliczono REazy, które trawią tylko zmetylowany DNA. Tabela 1. NajwaŜniejsze charakterystyczne cechy róŝnych typów enzymów restrykcyjnych i metylaz DNA. Cecha Typ I Typ II Typ III Typ IV Podjednostki Trzy Dwie Dwie Dwie (lub jedna) strukturalne Aktywność enzymatyczna Kofaktory niezbędne do cięcia Kofaktory niezbędne do metylacji DNA Rozpoznawana sekwencja Miejsce cięcia Zdolność do translokacji DNA Endonukleaza Metylotransferaza ATPaza ATP AdoMet Mg 2+ ATP AdoMet Mg 2+ Endonukleaza Metylotransferaza Mg 2+ AdoMet Endonukleaza Metylotransferaza ATPaza ATP Mg 2+ Endonukleaza GTPaza GTP AdoMet Mg 2+ AdoMet Mg 2+ - Asymetryczna dwuczęściowa Zwykle symetryczna Asymetryczna Dwuczęściowa zmetylowana Losowe, co W obrębie, albo 25-27 pz od W róŝnych najmniej 1000 pz tuŝ obok miejsca miejscach pomiędzy od sekwencji sekwencji rozpoznawanego zmodyfikowanymi rozpoznawanej rozpoznawanej zasadami Tak Nie Tak Tak 4

Typ I i III charakteryzuje brak ścisłej kontroli nad połoŝeniem miejsca cięcia względem rozpoznawanej sekwencji. Natomiast enzymy Typu II przecinają DNA w sekwencji rozpoznawanej albo blisko niej. Wynikiem trawienia określonej sekwencji DNA jest powtarzalny zestaw fragmentów o przewidywanej długości. Właściwość ta spowodowała szerokie wykorzystanie enzymów restrykcyjnych Typu II jako narzędzi w manipulacjach DNA. Endonukleazy restrykcyjnye typu II Obecnie w bazie danych REBASE (http://rebase.neb.com), katalogującej enzymy restrykcyjne, metylotransferazy DNA i pokrewne białka, znajduje się ponad 3890 ENaz Typu II rozpoznających 305 rodzajów specyficznych sekwencji (dane z 09.2012). Komercyjnie dostępnych jest 241 róŝnych specyficzności REaz. Enzymy naleŝące do tej grupy są najczęściej homodimerami lub tetramerami, wymagającymi tylko jonów Mg 2+ jako kofaktora. Nić DNA jest cięta wewnątrz krótkiej sekwencji rozpoznawanej lub w pewnej stałej odległości od niej. Mimo wspólnych cech, przedstawiciele tego typu są dość róŝnorodną grupą endonukleaz i dlatego wprowadzono podział na podtypy, uwzględniając przy tym budowę białek, rodzaj sekwencji docelowej, sposób cięcia DNA i inne cechy (Tabela 2). To samo białko moŝe naleŝeć do róŝnych podtypów, gdyŝ nie wykluczają się one wzajemnie (Roberts i wsp., 2003). Tabela 2. Podział enzymów restrykcyjnych Typu II na podtypy. Podtyp Opis Przykładowe enzymy A niepalindromiczna sekwencja rozpoznawana; często jeden gen koduje REazę a dwa geny kodują MTazy FokI, HphI B dwuniciowe cięcia po obu stronach sekwencji docelowej AloI, HaeIV C E obie domeny, endonukleolityczna i metylująca, w jednym polipeptydzie do cięcia potrzebne dwie kopie sekwencji docelowej, jedna cięta, druga działa jako efektor allosteryczny GsuI, HaeIV FokI, Sau3AI F interakcja z dwiema kopiami sekwencji rozpoznawanej i obie cięte BspMI, Cfr10I G obie domeny, endonukleolityczna i metylująca, w jednym polipeptydzie; AdoMet działa stymulująco na aktywność AloI, Eco57I H podobna struktura genów do Typu I AhdI, BcgI M sekwencja rozpoznawana cięta gdy zmetylowana BisI, DpnI P palindromiczna sekwencja rozpoznawana EcoRI, NgoPII S cięcie poza niepalindromiczną sekwencją rozpoznawaną FokI, Eco57MI T heterodimery Bpu10I, MlyI Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych: stosowane są literowe skróty (np. HindIII, EcoRI). Pierwsza litera oznacza rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, druga i trzecia - gatunek, a kolejna z nich pochodzi od szczepu lub typu bakterii. Następujące po niej cyfry rzymskie odpowiadają kolejnym enzymom wyizolowanym z określonego szczepu. HindIII - Haemophilus influenzae Rd Mph1103I - Moraxella phenylpyruvica RFL1103 Izoschizomery enzymy restrykcyjne izolowane z róŝnych bakterii rozpoznające tę samą sekwencję w DNA i wprowadzające identyczny typ cięcia. Przykład: HaeIII, BsuRI, BshFI, PhoI, BsnI - GG CC CC GG 5

Neoschizomery - restrykcyjne izolowane z róŝnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję w DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia. Przykład: SmaI Cfr9I Acc65I KpnI CCC GGG C CCGGG G GTACC GGTAC C GGG CCC GGGCC C CCATG G C CATGG Jedna jednostka enzymu restrykcyjnego oznacza taką jego ilość, która katalizuje kompletną hydrolizę wiązań w markerowego DNA o masie 1µg w czasie 1 godziny i w temperaturze i warunkach właściwych dla danego enzymu. REazy pozostawiają w rozciętej cząsteczce DNA dwa rodzaje końców (Ryc. 1.3): tępe końce - obie nici rozcięte są naprzeciwko siebie - nukleotydy znajdujące się na końcach są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnej nici; 5 -GG CC-3 5 -GG 3 5 -CC-3 3 -CC GG-5 3 -CC 5 3 -GG-5 lepkie końce - 3` lub 5` - jednoniciowe odcinki występujące na obu końcach przeciętej niesymetrycznie cząsteczki (Rys. 3). HindIII A AGCTT TTCGA A Mph1103I ATGCA T T ACGTA 5 -A 3 5 -AGCTT-3 5 -ATGCA T-3 3 -TTCGA-5 3 -A-5 3 -T ACGTA 5 Ryc. 1.3 Enzym restrykcyjny HindIII generuje jednoniciowe wystające (lepkie) końce 5 a enzym Mph1103I jednoniciowe wystające (lepkie) końce 3. Rodzaj pozostawianych końców ma znaczenie przy manipulacjach przeprowadzanych przy klonowaniu: warunkuje połączenie końców zgodnych (kompatybilnych) wymusza konieczność przekształcenia lepkich końców w tępe, np. przez zastosowaniu polimerazy DNA Sekwencja palindromiczna sekwencja czytana w kierunku od 5 do 3 końca jest taka sama jak na nici komplementarnej. 5 - AAGCTT -3 3 - TTCGAA -5 Czynniki wpływające na aktywność enzymu restrykcyjnego 1. Bakterie, z których izolowane są enzymy restrykcyjne bytują w róŝnych, często ekstremalnych, środowiskach. Stąd wynikają róŝne preferencje warunków reakcji związane np. z temperaturą inkubacji. Inne elementy, które róŝnią bufory wykorzystywane do przeprowadzenia reakcji z danym enzymem to: siła jonowa (stęŝenie soli), główny kation (sód lub potas) i ph. KaŜdy enzym restrykcyjny wymaga obecności kofaktora Mg 2+! 2. Czasami w buforach do reakcji dostarczane są dodatkowe związki chemiczne, które wspomagają działanie niektórych enzymów restrykcyjnych - np. detergent (Triton-X-100 do 6

redukcji napięcia powierzchniowego), BSA (ang. bovine serum albumin, albumina z grasicy cielęcej) zwiększa ogólne stęŝenie białka. 3. Obecność zanieczyszczeń pozostałych po preparatyce izolacji DNA (EDTA, fenol, etanol, proteinazy itd.) moŝe inaktywować enzym restrykcyjny. 4. W wyniku zastosowania nieodpowiednich warunków reakcji moŝe pojawić się niespecyficzna aktywność enzymu - tzw. star activity. Czynniki sprzyjające: zbyt długi czas reakcji (zmiana stęŝenia buforu w wyniku odparowywania wody z mieszaniny reakcyjnej) nieoptymalna temperatura reakcji, zbyt wysokie stęŝenie enzymu, nieoptymalne stęŝenie soli, nieoptymalne ph, obecność w mieszaninie reakcyjnej jonów Mn 2+, zamiast Mg 2+ (jony Mg 2+ są niezbędne dla aktywności endonukleaz); obecność rozpuszczalników organicznych, zbyt wysokie stęŝenie glicerolu (enzymy przechowuje się w temp -20 C w 50% glicerolu jednak, aby enzym działał prawidłowo końcowe stęŝenie glicerolu nie powinno przekraczać 5%). Endonukleazy restrykcyjne są wraŝliwe na obecność zmetylowanej zasady w obrębie sekwencji DNA przez nie rozpoznawanej, co wyraŝa się nie rozpoznaniem jako substratu sekwencji docelowej. Zmetylowane zasady występujące w DNA to: N6-metyloadenina, N6mA, m 6 A), N4-metylocytozyna (N4mC, m 4 C) i 5-metylocytozyna (5mC, m 5 C) (Ryc. 1.4) AdoMet adenina cytozyna N6-metyloadenina N4-metylocytozyna 5mC -metylocytozyna Ryc. 1.4 Zmetylowane zasady w DNA oraz kofaktor grup metylowych S-adenozylometionina (AdoMet). 7

Nieomal wszystkie szczepy Escherichia coli uŝywane w laboratoriach zawierają, co najmniej dwie metylotransferazy DNA: Dam metylazę (M.Dam), która dodaje grupę metylową do adeniny w sekwencji GATC (produkt Gm 6 ATC) Dcm metylazę (M.Dcm), która modyfikuje wewnętrzną cytozynę w sekwencji CCWGG (W=A lub T) CC(A/T)GG do Cm 5 C(A/T)GG Praktyczną konsekwencją tego zjawiska jest fakt, Ŝe wiele endonukleaz nie będzie trawić DNA zmetylowanego przez w/w metylazy DNA. PoniŜej kilka przykładów. Metylaza Dam E.coli, modyfikując w DNA adeninę w sekwencjach GATC, czyni je nie wraŝliwymi na trawienie enzymem MboI, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie wciąŝ substratem dla enzymu Sau3AI. Metylaza Dcm E.coli, modyfikując w DNA drugą cytozynę w sekwencjach CCWGG, czyni je nie wraŝliwymi na trawienie enzymem EcoRII, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie wciąŝ substratem dla enzymu MvaI. Miejsca rozpoznawane przez niektóre enzymy mogą zawierać się lub pokrywać się częściowo z sekwencją GATC np TCGA (TaqI), ATCGA (ClaI). Gdy sekwencje te zostaną zmetylowane przez M.Dam, staną się niewraŝliwe na trawienie w/w enzymami. Podobna sytuacja ma miejsce w przypadku nakładania się sekwencji docelowej danego enzymu z sekwencją CCWGG modyfikowaną przez M.Dcm np AGGCCT (StuI); TGGCCA (MscI). Gdy sekwencje te zostaną zmetylowane przez M.Dcm, staną się niewraŝliwe na trawienie w/w enzymami. nntgatcann nnactagtnn nntcgatcnn nnagctagnn nnatcgatcnn nntagctagnn nnaggcctggnn nntccggaccnn nntggccaggnn nnaccggtccnn Jeśli (nieoczekiwanie) DNA nie został pocięty przez uŝyty przez Ciebie enzym restrykcyjny lub trawienie jest tylko częściowe, sprawdź, czy ten enzym nie jest wraŝliwy na metylację! 8

Inaktywacja enzymów restrykcyjnych po reakcji enzymatycznej Nieodwracalna: inaktywacja termiczna (zwykle w temperaturze 65 C lub 80 C); denaturacja białek poprzez dodanie mieszaniny fenol:chloroform lub kaŝdego z nich oddzielnie (po odbiałczeniu preparatu naleŝy poddać go precypitacji); denaturacja białek poprzez dodanie HCl Odwracalna: dodanie EDTA do stęŝenia końcowego 12,5 mm (następuje wymiareczkowanie jonów Mg 2+ ) Połączenie fragmentów DNA w reakcja ligacji Ligacja jest przeprowadzana przez enzymy ligazy, które łączą dwa fragmenty DNA poprzez wytworzenie wiązania kowalencyjnego - fosfodiestrowego między końcem hydroksylowym 3' jednego nukleotydu a końcem 5' z grupą fosforanową drugiego nukleotydu przy wykorzystaniu energii z hydrolizy ATP (adenozynotrifosforanu). np ligaza faga T4 lub NAD + np ligaza E.coli. Dezaktywację ligazy przeprowadza się w temperaturze 65 o C przez 20 minut. Analiza zrekombinowaneo DNA - elektroforeza Elektroforeza jest techniką, w której wymusza się ruch cząsteczek za pomocą pola elektrycznego. W przypadku DNA słuŝy do identyfikacji, rozdziału i izolacji. Cząsteczki kwasów nukleinowych posiadają ładunek negatywny wynikający z ich szkieletu fosforanowego i migrują w kierunku anody (+). Agaroza - polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy otrzymywany z glonów. Agaroza zawieszona w wodzie w temperaturze pokojowej tworzy koloid - Ŝel. SłuŜy do rozdziału nawet bardzo duŝych cząsteczek, ale posiada relatywnie małą rozdzielczość. Typowe stęŝenia do rozdziału DNA to 0,5-2%. W standardowych warunkach poprzez uŝycie róŝnych stęŝeń agarozy mogą być rozdzielone fragmenty DNA między 50 a 20000 pz (Tabela 3). Tabela 3. ZaleŜność pomiędzy stęŝeniem Ŝelu agarozowego a zakresem długości rozdzielanego liniowego DNA. StęŜenie agarozy (%) Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA (kpz) 0,3 5-60 0,6 1-20 0,7 0,8-10 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3 2,0 0,1-2 Elektroforeza w Ŝelach agarozowych prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze: TBE 1 (90 mm Tris-base, 90 mm kwas borowy, 2 mm EDTA, ph 8) lub TAE 1 (40 mm Tris-base, 40 mm lodowy kwas octowy, 1 mm EDTA, ph 8. Akryloamid - polimer z grupy poliakrylanów otrzymywany przez polimeryzację akryloamidu. Ma niską zdolność rozdziału (fragmenty DNA do ok. 500 pz), ale bardzo wysoką rozdzielczość. Do uwidaczniania DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek etydyny (EtBr), który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). Obecność związku interkalującego w Ŝelu agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. EtBr to bardzo silny 9

mutagen prawdopodobnie takŝe karcynogen i teratogen! Dzięki właściwościom fluorescencyjnym EtBr moŝliwa jest wizualizacja DNA w świetle UV (300 nm). Innym odczynnikiem stosowanym do wizualizacji DNA jest np. SYBR Green, którego czułość jest 25 większa niŝ EtBr. Z reguły nakładając próbkę DNA na Ŝel agarozowy mieszamy ją uprzednio z tzw. barwnikiem do nakładania na Ŝel, lub krótko barwnikiem (ang. loading dye). Przyczyn jego uŝycia jest kilka: próbka DNA, która ma kolor jest wygodna w nakładaniu (łatwość wizualizacji), glicerol (lub sacharoza, ficoll 400) będący składnikiem tego barwnika zwiększa gęstość próbki i zapewnia, Ŝe znajdzie się ona na dnie dołka, negatywnie naładowany barwnik migruje przez Ŝel w tym samym kierunku co DNA i stąd ułatwia śledzenie postępu rozdziału elektroforetycznego (Tabela 4). Najpopularniejsze barwniki: błękit bromofenolowy (ang. bromophenol blue) cyjanian ksylenu (ang. xylene cyanol) orange G RóŜnią się kolorem, tempem migracji w danym Ŝelu (stęŝenie agarozy, rodzaj buforu). Tabela 4. Przykładowe tempo migracji w Ŝelu z buforem1 TAE. StęŜenie agarozy % Xylene cyanol Bromophenol blue 0,3 24800 2900 0,5 11000 1650 0,75 10200 1000 1 6100 500 1,25 3560 370 1,5 2800 300 1,75 1800 200 2 1300 70 Literatura: Arber W. Genetic variation: molecular mechanisms and impact on microbial evolution. FEMS Microbiol Rev. 2000. 24:1-7 Arber W, Dussoix D. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. I. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J Mol Biol. 1962. 5:18-36 Bertani G, Weigle JJ. Host controlled variation in bacterial viruses. J Bacteriol. 1953. 65:113-21 Ishikawa, K., Fukuda, E., Kobayashi, I. Conflicts targeting epigenetic systems and their resolution by cell death: novel concepts for methyl-specific and other restriction systems. 2010. DNA Res. 17: 325-342 Jeltsch A. Maintenance of species identity and controlling speciation of bacteria: a new function for restriction/modification systems? Gene. 2003. 317:3-6 Luria SE, Human ML. A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses. J Bacteriol. 1952. 64:557-69 Kobayashi I.Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome evolution. Nucleic Acids Res. 2001. 29:3742-56 Orlowski, J., Bujnicki, J.M. Structural and evolutionary classification of Type II restriction enzymes based on theoretical and experimental analyses. 2008. Nucleic Acids Res. 36: 3552-3569 Roberts RJ et. al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 2003. 31:1805-12 10

Część eksperymentalna Materiały: DNA faga λ (stęŝenie 0,3 µg/µl) enzymy restrykcyjne HindIII (10 U/µl), Mph1103I (10 U/µl) bufor do trawienia enzymami restrykcyjnymi (10 stęŝony): 10 mm TrisCl (ph 8,5 w 37 C), 10 mm MgCl 2, 100 mm KCl, 0,1mg/ml BSA bufor TBE (10 stęŝony): 1M Tris, 0,9 M kwas borowy, 0,01 M EDTA bufor do nakładania na Ŝel (6 stęŝony): 15% glicerol, 0,25% błękit bromofenolowy, 0,25% xylene cyanol FF bromek etydyny 10 mg/ml ATP 10 mm. Wykonanie: Mapę restrykcyjną faga λ z zaznaczonymi pozycjami miejsc dla enzymów Mph1103I oraz HindIII prezentuje Ryc. 1.5. Kolejne etapy prowadzonego eksperymentu zostały przedstawione w formie schematu (Ryc. 1.6). 1. Nastawienie trawienia DNA faga λ enzymem HindIII Wykonanie: zmieszać 12,5 µl mieszaniny H (zawiera bufor i enzym HindIII) z 12,5 µl mieszaniny λ1 (zawiera DNA faga λ). Inkubacja w temperaturze 37 C, 10 min. Skład mieszaniny reakcyjnej (trawienie enzymem HindIII): 2,5 µl buforu do trawienia 2,5 µl (0,9 µg) DNA faga 19,5 µl H 2 O 0,5 µl enzymu restrykcyjnego HindIII 2. Nastawienie trawienia DNA faga λ enzymem Mph1103I Wykonanie: zmieszać 5µl mieszaniny M (zawiera bufor i enzym Mph1103I) z 5µl mieszaniny λ2 (zawiera DNA faga λ). Inkubacja w temperaturze 37 C, 40 min. Skład mieszaniny reakcyjnej (trawienie enzymem Mph1103I): 1 µl buforu do trawienia 0,5 µl (0,15 µg) DNA faga λ 8,3 µl H 2 O 0,2 µl enzymu restrykcyjnego Mph1103I 3. Inaktywacja termiczna enzymu restrykcyjnego HindIII Inkubacja próbki w temperaturze 65 C, 20 min. 4. Przygotowanie reakcji ligacji pobrać 20 µl pociętego enzymem HindIII DNA faga λ (4/5 reakcji trawienia z pkt.1) dodać 5 µl mieszaniny ligacyjnej Reakcję inkubować w temperaturze pokojowej 15 min. Skład mieszaniny ligacyjnej: bufor do trawienia 0,5 µl, 10 mm ATP - 2 µl, H 2 O - 2,2 µl, ligaza 0,3 µl. 11

5. Inaktywacja termiczna ligazy Inkubacja próbek w temperaturze 65 C, 20 min. 6. Trawienie mieszaniny ligacyjnej (z pkt. 4) enzymem restrykcyjnym HindIII i Mph1103I (oddzielnie). Wykonanie: zmieszać 10 µl reakcji ligacji z pk.4 z 5µl mieszaniny z enzymem HindIII zmieszać 10 µl reakcji ligacji z pk.4 z 5µl mieszaniny z enzymem Mph1103I Inkubacja próbek w temperaturze 37 o C, 10 min. Skład mieszaniny reakcyjnej: 10 µl reakcji ligacji (2/5 reakcji z pkt. 4) 0,5 µl buforu do trawienia 4,2 µl H 2 O 0,3 µl enzymu restrykcyjnego HindIII lub Mph1103I 7. Elektroforeza DNA w Ŝelu agarozowym przygotowanie Ŝelu agarozowego (0,7% w buforze 1 TBE) przygotowanie próbek DNA do naniesienia na Ŝel (pobrać 10 µl mieszaniny reakcyjnej i dodać 2 µl barwnika; nanieść na Ŝel) rozwijać elektroforezę przez 1 h, a następnie barwić Ŝel w roztworze bromku etydyny wizualizacja Ŝelu w świetle UV (dł. fal 300 nm) Próbki na Ŝel: N.C = Nie trawiony DNA faga λ L = Próbka z ligacją (zligowane fragmenty DNA faga λ po cięciu enzymem HindIII) LH = HindIII λ lig = Próbka z ligacją strawiona enzymem HindIII H = HindIII λ = Próbka strawionego DNA faga λ enzymem HindIII (z pkt. 1) M = Mph1103I λ = Próbka strawionego DNA faga λ enzymem Mph1103I (z pkt. 1) LM = Mph1103I λ lig = Próbka z ligacją strawiona enzymem Mph1103I Ryc. 1.5 Mapa restrykcyjna faga λ z zaznaczonymi pozycjami miejsc dla enzymów Mph1103I oraz HindIII. 12

Trawienie DNA enzymem HindIII 25 µl Trawienie enzymem Mph1103I 10 µl M Dezaktywacja termiczna 65 o C 20 min 5µl zachować 20 µl +5 µl Ligacja H =25 µl 5 µl zachować L 20 µl Dezaktywacja termiczna 65 o C 20 min nc L H LH m M LM 10 µl +5 µl HindIII LH 10 µl +5 µl Mph1103 LM Próbki DNA na Ŝel Ryc. 1.6 Schemat doświadczeń przeprowadzanych w trakcie ćwiczenia 1. m - marker wielkości; nc - nie cięty DNA faga λ; L produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII; H - DNA faga λ strawiony enzymem HindIII; LH - produkty ligacji fragmentów DNA (po cięciu HindIII) strawione enzymem HindIII; M - DNA faga λ strawiony enzymem Mph1103I; LM - produkty ligacji fragmentów DNA (po cięciu HindIII) strawione enzymem Mph1103I. 13

N.C L. HindIII NdeI BamHI Eco130I BglII MphI1103I λh LigH M λ Lig λ Lig λ Lig λ Lig λ Lig Ryc. 1.7 Obraz rozdziału DNA w Ŝelu agarozowym 0,7%. N.C nie cięty DNA faga λ; L produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII; λ - DNA faga λ strawiony określonym enzymem (nazwa uŝytego enzymu znajduje się nad symbolem λ); Lig - produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII (patrz tor L), które strawiono określonym enzymem (nazwa uŝytego enzymu znajduje się nad symbolem λ). Zwróć uwagę, Ŝe wzór restrykcyjny zrekombinowanego DNA faga λ (tory L) jest inny niŝ wzór restrykcyjny natywnych cząsteczek DNA faga λ. (tory λ). Wyjątkiem jest trawienie enzymem HindIII (tor LigH), który wygenerował substratowe fragmenty restrykcyjne do ligacji (tor λh). M marker wielkości 14

Przygotowanie do Ćwiczenia 2 1. Nastawienie trawienie DNA wektora puc19 Wykonanie: zmieszać 10 µl mieszaniny Pst_pUC (zawiera bufor i enzym PstI) z 10 µl mieszaniny puc (zawiera DNA wektora puc19). Inkubacja w temperaturze 37 C, 60 min. Skład mieszaniny reakcyjnej (objętość końcowa 20 µl): 2 µl buforu 1 µl DNA puc19 0,2 µl enzymu PstI 16,8 µl H 2 O 2. Nastawienie trawienia DNA bakteriofaga HP1 Wykonanie: zmieszać 5 µl mieszaniny Pst_HP1 (zawiera bufor i enzym PstI) z 5 µl mieszaniny HP1 (zawiera DNA faga HP1). Inkubacja w temperaturze 37 C, 60 min. Skład mieszaniny reakcyjnej (objętość końcowa 10 µl): 1 µl buforu 2 µl DNA faga HP1 0,2 µl enzymu PstI 6,8 µl H 2 O 3. Nastawienie trawienie DNA wektora pmpma4ω Wykonanie: zmieszać 10µl mieszaniny PstΩ (zawiera bufor i enzym PstI) z 10 µl mieszaniny pmpma4ω (zawiera DNA wektora pmpma4ω). Inkubacja w temperaturze 37 C, 60 min. Skład mieszaniny reakcyjnej (objętość końcowa 20 µl): 2 µl buforu 2 µl DNA pmpma4ω 0,2 µl enzymu PstI 16,8 µl H 2 O 15

ĆWICZENIE 2 Enzymy słuŝące do modyfikacji DNA Część teoretyczna Obecnie stosuje się wiele róŝnorodnych, komercyjnie dostępnych enzymów słuŝących do modyfikacji i rekombinacji DNA. Są to m.in.: enzymy restrykcyjne (ćwiczenie 1), alkaliczna fosfataza (AP, ang. alkaline phosphatase), kinaza polinukleotydowa, ligaza DNA, polimeraza DNA I, fragment Klenowa, nukleaza S1, odwrotna transkryptaza, terminalna transferaza, RNaza, DNaza, egzonukleazy (I, III), endonukleazy (IV, V), polimeraza DNA (Taq, Pfu), topoizomeraza. Alkaliczna fosfataza (EC 3.1.3.1) jest hydrolitycznym enzymem odpowiedzialnym za usuwanie reszt 5 fosforanowych z DNA, RNA oraz nukleotydów. Wszystkie alkaliczne fosfatazy są metaloenzymami (Zn(II)). Proces usuwania grup fosforanowych nazywany jest defosforylacją i przebiega z wytworzeniem produktu pośredniego zawierającego ufosforylowaną serynę. Enzym ten wykazuje najwyŝszą aktywność w środowisku alkalicznym stąd jego nazwa. MoŜemy wyróŝnić kilka rodzajów alkalicznej fosfatazy, pochodzących z róŝnych źródeł, które odróŝnia między innymi moŝliwość inaktywacji: bakteryjna alkaliczna fosfataza (BAP bacterial alkaline phosphatase) wykazuje najwyŝszą aktywność i jest najbardziej trwała (najtrudniej ją inaktywować po zakończeniu reakcji defosforylacji). BAP jest wydzielana w postaci monomeru (M r = 47 kda) do przestrzeni peryplazmatycznej Escherichia coli, gdzie dimeryzuje i staje się katalitycznie aktywna. W obojętnym lub alkalicznym ph, dimer BAP zawiera do 6 jonów Zn 2+, z których dwa są niezbędne dla aktywności enzymu. Tylko jedno z dwóch miejsc katalitycznych dimeru jest aktywne przy niskim stęŝeniu sztucznego substratu, podczas gdy oba stają się aktywne przy wysokim stęŝeniu. alkaliczna fosfataza z jelita cielęcego (CIAP - calf intestinal alkaline phosphatase) najczęściej uŝywana w laboratoriach biologii molekularnej. Wykazuje niewiele niŝszą aktywność w stosunku do BAP, a moŝna ją efektywnie inaktywować termicznie lub poprzez trawienie proteolityczne. CIAP jest glikoproteiną zbudowaną z dwóch 514- aminokwasowych monomerów. Aktywność enzymu zaleŝy od stęŝenia jonów Mg 2+ i Zn 2+. Zn 2+ wiąŝe się w centrum katalitycznym i jest wymagany do aktywności katalitycznej. Mg 2+ wiąŝe się do róŝnych miejsc enzymu i jest allosterycznym aktywatorem. alkaliczna fosfataza z krewetek (SAP - shrimp alkaline phosphatase) izolowana z krewetek Pandalus borealis, jest stosunkowo łatwa do inaktywacji termicznej. Przy manipulacjach DNA alkaliczna fosfataza uŝywana jest głównie do: usuwania grupy 5 fosforanowej z plazmidów i wektorów bakteriofagowych, które uprzednio zostały strawione enzymami restrykcyjnymi (Ryc. 2.1). Zapobiega to ponownej cyrkularyzacji wektora, a tym samym wydajność klonowania jest większa (Ryc. 2.2). usuwania grupy 5 fosforanowej z fragmentów DNA poprzedzającego radioaktywne znakowanie 32 P (przygotowanie DNA do radioaktywnego znakowania w reakcji z wykorzystaniem polinukleotydowej kinazy faga T4) (Ryc. 2.1). usuwania grupy 5 fosforanowej z RNA, rntps i dntps. jako enzym reporterowy w nieradioaktywnych systemach do wykrywania i lokalizacji kwasów nukleinowych i białek. AP jest skoniugowana z ligandem, który specyficznie oddziałuje z cząsteczką docelową. 16

(A) (B) (C) alkaliczna fosfataza 5 p DNA lub 5 p RNA 5 OH DNA lub 5 OH RNA Ryc. 2.1 Usuwanie grupy 5 fosforanowej DNA/RNA. (A) struktura nukleotydu, zaznaczono usuwaną grupę fosforanową; (B) i (C) reakcja defosforylacji. wektor nie poddany działaniu alkalicznej fosfatazy moŝe ulegać ponownej cyrkularyzacji, co prowadzi do otrzymania duŝej ilości pustych wektorów defosforylowany wektor nie moŝe ulec cyrkularyzacji, bez insertu 3 OH 5 P 3 OH 3 OH 5 P 3 OH Ryc. 2.2 Schemat klonowania insertu (powstałego po trawieniu enzymem restrykcyjnym) do defosforylowanego wektora. 17

Kinaza polinukleotydowa bakteriofaga T4 (T4 PNK) katalizuje przeniesienie γ-fosforanu z ATP (Ryc. 4.3) na (patrz struktura nukleotydu po defosforylacji) koniec 5 OH jedno- lub dwuniciowego DNA, RNA lub oligonukleotydów. γ β α Ryc. 2.3 Struktura ATP (ang. adenosine triphosphate) i ADP (ang. adenosine diphosphate). Aktywność T4 PNK wykorzystywana jest głównie w dwóch typach reakcji: reakcji podstawienia (ang. forward reaction) i reakcji wymiany (ang. exchange reaction) (Ryc. 2.4). W reakcji podstawienia γ-fosforan przenoszony jest z ATP na DNA/RNA. Docelowy nukleotyd nie posiada reszty fosforanowej na końcu 5 (została ona usunięta w reakcji defosforylacji lub w takiej postaci została zsyntetyzowana chemicznie). Reakcja ta jest odwracalna. W reakcji wymiany, nadmiar ADP powoduje, Ŝe T4 PNK najpierw przenosi 5 -fosforan z ufosforylowanego DNA, a następnie DNA jest ponownie fosforylowany przez przeniesienie γ- fosforanu z ATP (np. [γ- 32 P]ATP). W reakcji katalizowanej przez T4 PNK stęŝenie ATP powinno wynosić 1µM (reakcja podstawienia) lub 2µM (reakcja wymiany). Ponadto enzym posiada aktywność 3 fosfatazy. Ryc. 2.4 Aktywność enzymatyczna T4 PNK. Oczyszczenie kinazy polinukleotydowej bakteriofaga T4 z zainfekowanych komórek gospodarza jest niewydajne i trudne, dlatego teŝ źródłem T4 PNK są komórki Escherichia coli z wklonowanym genem pset bakteriofaga T4. T4 PNK jest homotetramerem zbudowanym z podjednostek o masie 28,9 kda kaŝda. T4 PNK jest głównie wykorzystywana do: radioaktywnego znakowania na końcu 5 kwasów nukleinowych (reakcja podstawienia lub wymiany), które następnie wykorzystywane są: (i) jako sonda hybrydyzacji; (ii) do mapowania transkryptu; (iii) jako markery do elektroforezy Ŝelowej; (iv) jako startery w reakcji sekwencjonowania DNA; (v) jako startery do reakcji PCR lub w innych metodach wymagających terminalnie wyznakowanego DNA. 5'-fosforylacji oligonukleotydowych łączników i DNA/RNA przed ligacją. 18

Termostabilne polimerazy DNA przeprowadzają zaleŝną od matrycy syntezę DNA w kierunku 5 3 (Ryc. 2.5). Proces ten polega na dodawaniu deoksyrybonukleotydów do końca 3 nowosyntetyzowanej nici. Do rozpoczęcia reakcji wymagany jest starter z wolną grupą 3 -OH oraz jony Mg 2+. Maksymalną aktywność katalityczną enzymy te wykazują w temperaturze 75-80 C. W temp. 37 C osiągają jedynie około 10% aktywności maksymalnej. 5 DNA OH termostabilna polimeraza DNA 5 DNA ( p dn) n + npp i Mg 2+ datp, dttp, dgtp, dctp Ryc. 2.5 Reakcja katalizowana przez termostabilną polimerazę DNA. Tabela 5. Właściwości wybranych termostabilnych polimeraz DNA* (wg Sambrook, J. i Russell, D.; 2001). Enzym Organizm Optymalna temperatura ( C) Aktywność egzonukleolityczna Częstość błędów 10-6 Stabilność Inne uwagi Taq Thermus aquaticus 75-80 5 3 20-100 9 min w 97,5 C produkt PCR posiada na końcu 3 da** 94 kda monomer Pwo Pyrococcus woesei 60-65 3 5 3,2 > 120 min w 100 C Pfu Pyrococcus furiosus 72-78 3 5 1,6 240 min w 95 C produkt PCR posiada tępe końce 90 kda monomer *poszczególne wartości mogą odbiegać od podanych w tabeli i róŝnić się w zaleŝności od producenta **polimeraza DNA Taq wykazuje aktywność transferazy nukleotydowej, ale nie ma aktywności proofreading (egzonukleolitycznej 3 5 ), co powoduje dodanie dodatkowej reszt/y adeninowych na końcu 3 produktu PCR Dostępne są równieŝ mieszaniny kilku termostabilnych polimeraz DNA np. High Fidelity PCR Enzyme Mix czy Long PCR Enzyme Mix. UmoŜliwiają one amplifikację fragmentów DNA o wielkości: (i) do 47 kpz z wirusowym DNA jako matrycą lub (ii) do 21 kpz z genomowym DNA jako matrycą. Zastosowanie termostabilnych polimeraz DNA: amplifikacja fragmentów DNA w reakcji PCR; znakowanie DNA; sekwencjonowanie DNA; wbudowywanie zmodyfikowanych nukleotydów (np. nukleotydów znakowanych biotyną, digoksygeniną lub fluorescencyjnie); mutageneza specyficzna wobec miejsca; 19

Polimeraza DNA I (holoenzym) (PolI, polimeraza Kornberga) syntetyzowana przez E. coli zbudowana jest z pojedynczego łańcucha polipeptydowego o masie cząsteczkowej 109 kda, kodowanego przez gen pola. Enzym ten posiada następujące aktywności: (i) polimerazy DNA 5 3 ; (ii) egzonukleazy 3 5 ; (iii) egzonukleazy 5 3 oraz (iv) RNazy H. Aktywność RNazy H nie jest powszechnie wykorzystywana w biologii molekularnej. Poszczególne aktywności katalizowane są przez odrębne domeny enzymu (Tabela 6). Tabela 6. Domeny polimerazy DNA I kodowanej przez Escherichia coli. Domena Aktywność Karboksylowa, aminokwasy 543 928, ~46 kda Centralna, aminokwasy 326 542, ~22 kda* Aminowa, aminokwasy 1-325* *karboksylowa i centralna domena stanowią fragment Klenowa polimeryzacyjna 5 3 egzonukleolityczna 3 5 egzonukleolityczna 5 3 Fragment Klenowa jest duŝym fragmentem polimerazy DNA I kodowanej przez E. coli. Posiada aktywność polimeryzacyjną 5 3 oraz aktywność egzonukleolityczną 3 5 (aktywność naprawcza). W porównaniu z PolI nie posiada aktywności egzonukleolitycznej 5 3. Do przeprowadzenia syntezy DNA w kierunku 5 3 wymagana jest obecność jednoniciowej matrycy oraz startera. Niezbędnym kofaktorem reakcji katalizowanych przez enzym są jony Mg 2+. Fragment Klenowa jest monomerem o wielkości 76 kda. Enzym ten moŝna otrzymać poprzez proteolizę polimerazy Kornberga subtylizyną lub teŝ poprzez sklonowanie odpowiedniego fragmentu genu pola w komórkach E. coli. Fragment Klenowa jest wykorzystywany w biologii molekularnej m.in. do: wypełniania lepkich końców 5 (Ryc. 2.6), powstałych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi pozostawiającymi tego typu końce. Enzym ten katalizuje w sposób zaleŝny od matrycy dodawanie trifosforanów nukleotydów do cofniętej reszty hydroksylowej 3. Synteza zachodzi w kierunku 5 3 do momentu, aŝ wystający lepki koniec zostanie całkowicie wypełniony. 5...GTCCA 3 OH fragment Klenowa 5...GTCCAAGCT 3 OH 3...CAGGTTCGA p 5 3...CAGGTTCGA p 5 datp, dttp, dgtp, dctp Mg 2+ Ryc. 2.6 Wypełnianie wystających lepkich końców 5 przez fragment Klenowa. wytępiania lepkich końców 3, które powstały po trawieniu enzymami restrykcyjnymi zostawiającymi wystające końce 3. Jednak wytępianie lepkich końców 3 jest wydajniej katalizowane przez polimerazę DNA faga T4, która ma większą aktywność egzonukleolityczną. W niektórych przypadkach aktywność egzonukleolityczna 3 5 fragmentu Klenowa jest niepotrzebna lub szkodliwa. NaleŜy wtedy zastosować fragment Klenowa exo -. Enzym ten zachowuje aktywność polimeryzacyjną, nie posiada natomiast aktywności egzonukleolitycznej 3 5. Fragment Klenowa exo - uzyskuje się poprzez wprowadzenie odpowiedniej mutacji w genie kodującym fragment Klenowa. 20