. DN podporządkowany człowiekowi manipulacje DN Poznanie mechanizmów replikacji, transkrypcji i translacji oraz rozwój biochemii, genetyki i informatyki doprowadziły do wynalezienia metod pozwalających na manipulowanie informacją zapisaną w DN, czyli rekombinowanie DN. Jest ono podstawą inżynierii genetycznej. worzenie rekombinowanych cząsteczek DN jest możliwe dzięki technikom pozwalającym na wyodrębnienie i powielenie fragmentów DN, a także odczytanie zapisanej w nich informacji. echniki te to przede wszystkim: rozcinanie DN za pomocą enzymów restrykcyjnych, sekwencjonowanie DN, chemiczna synteza DN, reakcja łańcuchowa polimerazy (PR). manipulowanie w DN izolowanie DN z komórek DN kopiowanie cięcie rearanżacja komórki Ryc..1. Po wyizolowaniu DN można kopiować, ciąć i zmieniać. Nożyczki i klej w rękach genetyków Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne sekwencje DN i bardzo precyzyjnie przecinają obie jego nici w określonym miejscu. Występują u bakterii, które wykorzystują je do rozcinania obcych cząsteczek DN. Zostały odkryte w latach sześćdziesiątych XX wieku, a już kilka lat później wprowadzono je do badań. Dotychczas scharakteryzowano ponad 3000 enzymów restrykcyjnych. Enzymy restrykcyjne są niezastąpione przy sekwencjonowaniu DN, badaniu struktury chromosomów, izolowaniu poszczególnych genów oraz tworzeniu nowych cząsteczek DN. Odcinki DN łatwiej analizować i poddawać manipulacjom niż długi łańcuch. Łączy się je z powrotem za pomocą enzymów zwanych ligazami, uzyskując rekombinowany DN. enzymy restrykcyjne i ich rola iekawe fakty Nazwy enzymów restrykcyjnych tworzy się od nazw organizmów, z których zostały wyizolowane (np. Eco od Escherichia coli). Oznaczenia cyfrowe (np. HindIII) informują o tym, że z danego organizmu wyizolowano więcej niż jeden enzym restrykcyjny. 21
nazwa enzymu Bam HI HaeIII EcoRI Hhal Ryc..2. Miejsca działania wybranych enzymów restrykcyjnych. sekwencjonowanie Sekwencjonowanie DN Do prawdziwej rewolucji w genetyce doprowadziło wynalezienie techniki sekwencjonowania DN, czyli określania kolejności ułożenia nukleotydów. Jest to jedna z podstawowych metod wykorzystywanych między innymi w biotechnologii, medycynie sądowej czy diagnostyce chorób genetycznych. Najbardziej znaną metodę sekwencjonowania opracował Frederick Sanger (tzw. metoda Sangera lub metoda terminacji łańcucha). 1 Rozdzielanie chromosomów i odcinanie fragmentów DN 2 ięcie fragmentów na mniejsze segmenty 1 2 3 5 6 7 8 9 10 3 ięcie każdego segmentu na małe fragmenty 2 1 3 5 6 7 9 8 10 Odczytywanie sekwencji nukleotydów w każdym z małych fragmentów DN dokonywane w sposób automatyczny w sekwenatorach DN 5 Zestawianie odczytanych sekwencji małych fragmentów zgodnie z ich znaną względną kolejnością 1 2 3 5 6 7 8 9 10 Ryc..3. Sekwencjonowanie DN metodą Sangera. 22
Pierwszy etap sekwencjonowania DN obejmuje izolację DN, rozdzielenie helisy na dwie pojedyncze nici i pocięcie nici na krótkie fragmenty. Drugi etap polega na kopiowaniu krótkich odcinków DN, które są komplementarne do nici DN. Odcinki DN o różnej długości są odpowiednio oznaczane (radioaktywnie lub fluorescencyjnie) i segregowane za pomocą elektroforezy. Z wielkości fragmentów wnioskuje się o sekwencji DN. Sekwencje poszczególnych odcinków składa się w cały, wyjściowy DN. Jest to możliwe, ponieważ końce poszczególnych odcinków zachodzą na siebie (podobnie jak elementy puzzli). Obecnie sekwencjonowanie DN zostało zautomatyzowane (między innymi dzięki nowoczesnym sekwenatorom). by się przekonać, jak działają enzymy restrykcyjne oraz na czym polega sekwencjonowanie DN, przeprowadź proste doświadczenie. etapy sekwencjonowania DN Zostań biochemikiem! Przygotuj cztery różnokolorowe zestawy tej samej sekwencji DN (ryc. ). Z każdego zestawu wytnij poszczególne nici (ryc. B, ). Następnie nić każdego koloru przetnij we wskazanych miejscach według zasad działania enzymów restrykcyjnych podanych w tabeli (kolor nici wskazuje na rodzaj enzymu stosowanego przy cięciu danej nici). Enzym Miejsce cięcia Kolor nici HaeIII czerwony EcoRI zielony EcoRII żółty HpaII niebieski Wybierz uzyskane fragmenty z nici dwóch kolorów (np. zielony i niebieski lub zielony i żółty) i je wymieszaj. Wykorzystując nakładające się sekwencje, ułóż wyjściową nić DN. Uwaga: Nie tworzysz par zasad, tylko pojedynczą nić zasady w każdej z nich muszą pasować do siebie, na przykład w następujący sposób: B 23
D Przez przesuwanie kolejnych części i próbowanie różnych kombinacji można zrekonstruować pierwotną nić. Po zakończeniu rekonstrukcji sprawdź sekwencję z nauczycielem. zy rekonstrukcja fragmentów nici uzyskanych za pomocą enzymów restrykcyjnych HaeIII i EcoRII jest możliwa? Przeprowadź podczas lekcji dyskusję na ten temat. odwrotna transkryptaza cdn 5' 5' DN o sekwencji mrn Odwrócić bieg zdarzeń cdn 3' Odwrotna transkryptaza wykorzystuje mrn jako matrycę do syntezy komplementarnej nici DN (cdn) Nić mrn ulega zniszczeniu, a na nici cdn powstaje druga nić DN wektor 3' Nowy DN jest wprowadzany do wektora by móc wykorzystać bakterie do produkcji białka (np. Escherichia coli do wytwarzania ludzkiej insuliny), należy do ich komórek wprowadzić gen, który je koduje. Ponieważ geny człowieka stanowią mieszaninę egzonów i intronów, a bakterie nie potrafią usuwać intronów, gen kodujący dane białko musi zostać ich pozbawiony. W tym celu wykorzystuje się tak zwany cdn (ang. complementary DN), komplementarny do dojrzałego mrn. by uzyskać cdn, należy najpierw wyizolować z komórki całkowitą pulę RN. Następnie, wykorzystując startery specyficznie rozpoznające mrn, odwrotna transkryptaza przeprowadza syntezę cdn na matrycy mrn. Odwrotna transkryptaza przeprowadza syntezę jednoniciowego DN na matrycy mrn z wykorzystaniem deoksytrifosforanów nukleotydów (dnp), dodając je na zasadzie komplementarności. Po zsyntetyzowaniu pierwszej nici mrn jest degenerowany. Syntezę drugiej nici przeprowadza polimeraza DN. Końcowym produktem jest dwuniciowa cząsteczka cdn, której sekwencja odpowiada mrn wyizolowanym z konkretnej komórki. W ten sposób można uzyskać całą kolekcję cdn, czyli bibliotekę cdn. Ryc... W czasie odwrotnej transkrypcji informacja z mrn jest przepisywana na DN przez enzym odwrotną transkryptazę. 2
PR rewolucja w badaniach genetycznych W 198 roku została wynaleziona metoda pozwalająca na powielanie wybranych odcinków DN. o tak zwana reakcja łańcuchowa polimerazy (w skrócie PR; z ang. Polymerase hain Reaction). Warunkiem przeprowadzenia PR jest znajomość sekwencji nukleotydów sąsiadujących z odcinkiem DN, który chcemy powielić (nie musimy znać sekwencji nukleotydów odcinka powielanego). W mieszaninie reakcyjnej znajdują się: krótkie odcinki DN, czyli startery, zwane też primerami (czyt. prajmerami), które są komplementarne do sekwencji otaczających kopiowaną sekwencję, nukleotydy (,,, ) oraz enzym najczęściej polimeraza aq. Jeden cykl reakcji PR obejmuje następujące etapy: 1. Oddzielenie nici DN dwie nici DN rozdzielane są przez podgrzanie roztworu do temperatury 95 przez 15 sekund. 2. Dołączenie starterów w wyniku gwałtownego schłodzenia mieszaniny reakcyjnej do temperatury 50 65 startery przyłączają się do nici DN. 3. Synteza DN mieszaninę reakcyjną ponownie podgrzewa się do temperatury 72. Jest to temperatura odpowiednia do działania polimerazy aq, która dołącza Ryc..5. ermocykler. kolejne nukleotydy równocześnie do obu nici DN. ały cykl jest wielokrotnie powtarzany. Po 20 cyklach DN jest powielony milion razy, a po 30 miliard i to w czasie krótszym niż godzina! o więcej, metoda PR jest obecnie całkowicie zautomatyzowana. Urządzenie służące do przeprowadzania PR to termocykler. polimerazy Ryc..6. Bakterie hermus aquaticus, z których pochodzi polimeraza aq, żyją w gorących źródłach (odkryto je w gorących źródłach Yellowstone). iekawe fakty Reakcja PR zachodzi dzięki unikalnym cechom polimerazy aq, która jest aktywna w wysokich temperaturach. Enzym ten wyizolowano z bakterii hermus aquaticus (stąd jego nazwa). 25
Metoda PR umożliwia powielenie nawet bardzo małych fragmentów DN (stanowiących mniej niż milionową część cząsteczki DN). Pozwala to na uzyskanie takiej ilości materiału genetycznego, która umożliwia jego analizę. Dlatego PR wykorzystuje się w medycynie (do wykrywania bakterii i wirusów, np. HIV) oraz w sądownictwie (np. do ustalania ojcostwa) i kryminalistyce (do znajdowania winnych w sprawach o gwałt czy zabójstwo). Ponieważ DN jest cząsteczką bardzo stabilną i może przetrwać wiele tysięcy lat, PR wykorzystuje się też do odtwarzania DN muzealnego lub znajdowanego w skamieniałościach. iekawe fakty Odmianą reakcji PR jest reakcja R-PR. W trakcie tej reakcji używa się odwrotnej transkryptazy, a wyjściowym kwasem jest mrn. Najpierw, na podstawie sekwencji zapisanej w mrn, wytwarzany jest cdn, który następnie jest powielany w trakcie reakcji PR. Jest to możliwe dzięki enzymom, na przykład enzymowi wyizolowanemu z bakterii hermus thermophilus, który ma właściwości zarówno polimerazy aq, jak i odwrotnej traksktyptazy. Enzym ten nazwano polimerazą th. R-PR znalazło wiele zastosowań w diagnostyce. Elektroforeza naliza fragmentów DN uzyskanych w wyniku reakcji PR czy cięcia enzymami restrykcyjnymi opiera się na różnicy w ich wielkości. Standardową metodą rozdziału cząsteczek DN o różnych długościach jest elektroforeza. Metoda ta polega na przemieszczaniu się naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym. ząsteczki naładowane dodatnio wędrują do elektrody ujemnej, zaś cząsteczki naładowane ujemnie do elektrody dodatniej. Elektroforezę przeprowadza się w żelu będącym siecią porów, przez które cząsteczki DN muszą się przeciskać. Krótsze (mniejsze) cząsteczki przeciskają się szybciej, natomiast dłuższe (większe) wędrują przez żel znacznie dłużej. ząsteczki o różnej wielkości tworzą na żelu prążki. Prążki DN uwidacznia się poprzez dodanie do żelu barwnika, najczęściej bromku etydyny, który wnika pomiędzy pary zasad DN i fluoryzuje pod wpływem promieniowania ultrafioletowego. Podsumowanie 1. Wśród stosowanych w genetyce metod pozwalających na analizę i modyfikacje DN najpowszechniejsze są: rozcinanie DN za pomocą enzymów restrykcyjnych, sekwencjonowanie DN, chemiczna synteza DN, reakcja łańcuchowa polimerazy (PR). 2. Enzymy restrykcyjne umożliwiają rozcięcie DN w określonym miejscu. Poprzez połączenie otrzymanych odcinków za pomocą ligaz uzyskuje się rekombinowany DN. 3. Sekwencjonowanie obejmuje: izolację DN, pocięcie go na krótkie fragmenty, oznakowanie ich i posegregowanie oraz poskładanie sekwencji w wyjściową cząsteczkę.. Dzięki odwrotnej transkryptazie można sekwencję nukleotydów w mrn przepisać na DN. Uzyskuje się w ten sposób cdn komplementarny do mrn. 5. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PR) pozwala na uzyskanie wielu kopii wybranego odcinka DN. Znalazła ona wiele zastosowań (np. w medycynie, kryminalistyce). 26
Zadania 1. Wyjaśnij, co oznacza pojęcie rekombinowanie DN. 2. Wymień metody pozwalające na rekombinowanie DN. 3. Odpowiedz, w jaki sposób powstaje cdn i na czym polega jego rola.. Przedstaw znaczenie polimerazy aq w reakcji PR. 5. Wyjaśnij, do czego służą enzymy restrykcyjne. 6. Przeczytaj poniższy fragment artykułu. Przepisz zamieszczone pod nim zdania do zeszytu. Obok każdego z nich napisz, czy może być wnioskiem z tekstu (K lub NIE). Wprowadzenie nowych, bardziej czułych metod diagnostycznych (PR) pozwoliło wykazać, że zarówno w populacji osób zdrowych, jak i chorych z zakażeniami dróg oddechowych rzeczywisty odsetek osób zakażonych drobnoustrojem hlamydophila pneumoniae może być wyższy niż oceniany na podstawie dodatnich wyników badań serologicznych. Źródło: R. Krenke, Zakażenia górnych dróg oddechowych wywołane przez drobnoustroje atypowe, Magazyn otorynolaryngologiczny, V(20), 2006. a) Za pomocą PR możemy wykryć obecność drobnoustrojów, które jeszcze nie zdążyły wywołać objawów choroby. b) Dotychczasowe badania dawały wynik dodatni, jeśli drobnoustrój zakaził organizm. c) Wczesne wykrycie obecności patogenów w organizmie daje ludziom szansę na wyzdrowienie lub zastosowanie odpowiedniej terapii. 7. Przedstaw zalety reakcji łańcuchowej polimerazy. Wyjaśnij, dlaczego uznaje się technikę manipulowania DN za przełomową w badaniach genetycznych. 8. Przeprowadźcie w klasie burzę mózgów na temat: Rekombinowanie DN. Możliwości wykorzystania. Sporządźcie notatkę w zeszycie. 9. Spośród podanych poniżej nazw urządzeń wskaż to, które służy do przeprowadzania reakcji łańcuchowej polimerazy (PR). a) sekwenator b) ultrawirówka c) termocykler 10. Przeczytaj poniższy tekst. W 200 roku zaprezentowano pierwszy poznany genom ptasi genom kury. Liczy on 1 mld par zasad i został zsekwencjonowany podobnie jak poprzednio: DN losowo pocięto na kawałki, sekwencjonowano je z osobna, a następnie komputer dopasował końce kawałków do siebie, składając z nich cały genom. Dzięki temu została wypełniona istotna luka, jeśli chodzi o strunowce do tamtej pory znano bowiem genomy człowieka (3 mld par zasad), myszy, szczura, psa, ryb: rozdymki i fugu (350 i 360 mln) oraz prymitywnego strunowca żachwy (180 mln). Dzięki poznaniu genomów zwierząt należących do tak odległych gromad możliwe będzie prześledzenie przebiegu ewolucji i odpowiedź na tak podstawowe pytania, jak skąd się wzięła żyworodność, stałocieplność czy zdolność latania. Źródło: enomy, genomy, Świat Nauki, Nr 2 (162)/2005. Na podstawie tekstu omów, jakie znaczenie ma rozwój technik inżynierii genetycznej dla: a) systematyków i taksonomów, b) naukowców zajmujących się problemami ewolucji. 27