WYKRYWANIE BAKTERII SALMONELLA METODAMI MOLEKULARNYMI W PRODUKTACH ŻYWNOŚCIOWYCH

Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 573, 2013, 3 11 WYKRYWANIE BAKTERII SALMONELLA METODAMI MOLEKULARNYMI W PRODUKTACH ŻYWNOŚCIOWYCH Anna Misiewicz, Anna Goncerzewicz Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Warszawa Streszczenie. Bakterie z rodzaju Salmonella są najbardziej znanymi bakteriami patogennymi występującymi w przemyśle spożywczym. Powodują zakażenia prawie wszystkich produktów żywnościowych od mięsnych, mlecznych, jajecznych po rośliny oleiste i pasze. Wykrycie i identyfikacja bakterii Salmonella na podstawie tradycyjnej metody mikrobiologicznej, zgodnie z normą PN-EN 6579:2003, jest ciągle powszechnie stosowane w laboratoriach. Analiza ta jest czaso- i pracochłonna, jej wykonanie trwa około 5 7 dni. Wykorzystanie nowoczesnych technik biologii molekularnej, z etapem namnożenia i izolacji DNA, do uzyskania końcowego wyniku trwa znacznie krócej. W niniejszej pracy zastosowano metodę Real-Time PCR i klasyczny PCR do identyfikacji bakterii Salmonella w różnych produktach żywnościowych. Określono czas potrzebny do wykonania tej analizy molekularnej. Do reakcji Real-Time PCR wykorzystano komercyjny kit. Klasyczną reakcję PCR prowadzono z użyciem starterów Sal465Li Sal142F, uzyskując właściwy produkt o wielkości 343 pz. We wszystkich badanych próbkach wykryto bakterie Salmonella. Wynik analiz molekularnych uzyskano w ciągu 21 25 godzin. Słowa kluczowe: PCR, Real-Time PCR, Salmonella sp., identyfikacja WSTĘP Gram-ujemne pałeczki z rodzaju Salmonella są głównymi z ponad 30 czynników patogennych zakażających żywność. Na świecie odnotowuje się miliony zakażeń pokarmowych spowodowanych przez bakterie Salmonella. Jak wynika z szacunkowych danych, corocznie odnotowuje się około 1,3 mld chorób wywołanych bakteriami z rodzaju Salmonella, z czego około 3 mln przypadków kończy się śmiercią. Główną przyczyną zakażeń ludzi i zwierząt jest podgatunek Enterica. Adres do korespondencji Corresponding author: Anna Misiewicz, Instytut Biologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Zakład Mikrobiologii, ul. Rakowiecka 36, 02-532 Warszawa, e-mail: anna. misiewicz@ibprs.pl

4 A. Misiewicz, A. Goncerzewicz Globalne zmiany w procesach produkcji żywności, w sposobie przechowywania i spożywania mogą być przyczyną ciągłych infekcji bakteriami Salmonella sp. Jednym z bardziej niebezpiecznych produktów są surowe lub niedogotowane jaja [Coyle i in. 1988, Stephens i in. 2007] oraz produkty mięsne, nabiałowe, wyroby ciastkarskie i deserowe. Bakterie z rodzaju Salmonella są także izolowane z pasz oraz próbek środowiskowych [Fegan i in. 2004, Boughton i in. 2007]. Mogą one zakażać produkty na każdym etapie procesu produkcyjnego. Bardzo wiele zależy od higieny warunków produkcji, począwszy od obróbki wstępnej po końcowe jej etapy pakowanie i transport [Boughton i in. 2007]. Bakterie Salmonella mogą rozwijać się także w sposób nieograniczony podczas nieodpowiedniego przechowywania żywności, najważniejszą rolę odgrywa wówczas temperatura. Przeprowadzone badania dowodzą, iż znaczny wzrost bakterii następuje w temperaturze 8 C [Pindar i in. 2007]. Uważa się, iż nie rozwijają się one w temperaturze poniżej 6 C, natomiast według D Aousta [1991], w zależności od serotypów i szczepów, możliwy jest jednak rozwój bakterii Salmonella w przedziale temperatury od 2 do 7 C. Zapewnienie jakości i bezpieczeństwa żywności jest najważniejszym kryterium dla zdrowia i życia ludzi oraz zwierząt [Naravaneni i Jamil 2005]. Od 1 stycznia 2006 roku na mocy Rozporządzenia (WE) [2004] obowiązują nowe zasady dotyczące specjalnych gwarancji na żywność [Misiewicz i in. 2009]. Tradycyjne metody mikrobiologiczne stosowane przez laboratoria do wykrywania i identyfikacji bakterii z rodzaju Salmonella są praco-, materiało- i czasochłonne [Malorny i in. 2008, Misiewicz i in. 2009]. Związane są z mnogością przesiewów i hodowli, różnych etapów identyfikacji od morfologicznych, przez biochemiczne, po serologiczne [Swaminathan i Feng 1994]. Szczególnego znaczenia nabierają zatem metody pozwalające na szybkie wykrycie bakterii patogennych. Są to metody immunoabsorbcyjne, oparte na zjawisku hybrydyzacji lub powielenia DNA [Seo i in. 2004, Blais i Martinem-Perez 2008]. Najbardziej obiecujące metody oparte są na technice PCR (Łańcuchowa Reakcja Polimerazy, ang. Polymerase Chain Reaction), pozwalającej na wykrycie różnych czynników patogennnych. Techniki te są wykorzystywane do wykrywania wielu bakterii, m.in.: Yersinia enterocolitica, Campylobacter sp., Listeria sp., Listeria monocytogenes, Esherichia coli oraz Salmonella sp., w różnych produktach żywnościowych. Otrzymany wynik jest obiektywny, ponieważ w testach wykorzystywana jest znajomość stałej struktury DNA sekwencji określonych nukleotydów, niezależnej od stanu fizjologicznego organizmu [Nissen i Sloots 2002, Atkins i Clark 2004]. Wykrywane są obecne wszystkie cząsteczki DNA, bez różnicowania żywych i martwych komórek. Martwe komórki bakterii nie odgrywają istotnej roli, mogą świadczyć tylko o skuteczności środków dezynfekcji [Malorny i in. 2008]. Startery o bardzo wysokiej specyficzności konstruowane są na podstawie fragmentów genów odpowiedzialnych za kodowanie cząsteczek RNA rybosomowego (rdna): 18S rdna, 28S rdna i 5.8S rdna. Wykorzystywane są także sekwencje nukleotydowe genów fima, inva charakterystycznych dla Salmonella sp. [Malorny i in. 2003, Naravaneni i Jamil 2005]. Nowoczesną generacją analiz opartych na reakcji PCR są analizy z zastosowaniem reakcji Real-Time PCR [Atkins i Clark 2004]. Wykazano, iż jest to metoda pozwalająca na wykrycie bakterii Salmonella, bez potrzeby uzyskania czystej kultury [Day i in. 2009]. Zastosowanie techniki PCR bazuje na wykryciu odpowiednich sekwencji nukleotydowych w genomie. Otrzymany wynik jest obiektywny, opiera się na stałej strukturze DNA, niezależnej od stanu fizjologicznego organizmu [Nissen i Sloots 2002, Atkins Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Wykrywanie bakterii Salmonella metodami molekularnymi... 5 i Clark 2004]. Do identyfikacji bakterii konstruowane są specyficzne startery, najczęściej na podstawie fragmentów genów odpowiedzialnych za kodowanie cząsteczek RNA rybosomowego (rdna): 18S rdna, 28S rdna i 5.8S rdna. W analizach wykorzystuje się również sekwencje nukleotydowe genów fima, inva, charakterystycznych dla Salmonella sp. [Malorny i in. 2003, Naravaneni i Jamil 2005]. Większość metod molekularnych bazuje na metodzie PCR (Polymerase Chain Reaction), wynalezionej przez Kary Mullis w 1993 roku. Metoda ta pozwala na amplifikację DNA i składa się z trzech etapów: rozpadu podwójnej helisy DNA, przyłączenia starterów i dobudowywania nowej nici z wykorzystaniem enzymu polimerazy Taq. Po 35 40 cyklach reakcji PCR powstaje kilka miliardów kopii cząsteczki DNA, a produkty zwykle analizowane są poprzez ich rozdział na żelu agarozowym, po wybarwieniu żelu bromkiem etydyny. Ważnym wydarzeniem stało się opracowanie przez Higuchi i współpracowników w 1992 roku metody łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (Real-time PCR), pozwalającej na analizę ilości produktu w każdym cyklu reakcji [Wyska i Rosiak 2006]. W technice Real-time PCR, dzięki przeprowadzaniu jednocześnie amplifikacji i detekcji, zmniejsza się możliwość kontaminacji. Na reakcję Real-time PCR składają się następujące etapy: faza wykładnicza, faza liniowa i faza plateau [Wyska i Rosiak 2006]. W początkowej fazie reakcji ilość produktu jest niewielka, a sygnał fluorescencji jest maskowany przez tło. Cykl, w którym natężenie fluorescencji przewyższa wartość tła (wartość progową threshold), jest podstawą obliczeń początkowej ilości matrycy i jest określany jako Ct [Wyska i Rosiak 2006]. Ct jest proporcjonalny do wyjściowej ilości kopii DNA. Wyczerpanie składników mieszaniny reakcji, konkurencja starterów i produktów o matrycę i spadek aktywności polimerazy, powodują spowolnienie szybkości reakcji i w konsekwencji osiąga ona fazę plateau, w której nie obserwuje się zmian natężenia fluorescencji. Zwykle ilość matrycy w ostatniej fazie jest zbliżona do początkowej ilości matrycy, stąd też ilość produktu oznacza się w fazie wykładniczej [Wyska i Rosiak 2006, Wiedro i Stachowska 2007]. Dotychczas wykazano, iż metoda ta pozwala wykryć nawet niewielką ilość bakterii Salmonella, bez potrzeby uzyskania w badaniach czystej kultury [Fricker i in. 2007, Day i in. 2009]. Technika Real-time PCR pozwala na skrócenie czasu hodowli badanej próbki, w zależności od zastosowanych zestawów pozwalających na wykrycie bakterii. Są one jedno- lub dwuetapowe. Jednoetapowe polegają na przeniesieniu próbki żywności do buforu lizującego, w którym następuje od razu etap uwolnienia DNA bakteryjnego, a dwuetapowe na pobraniu próbki żywności, a następnie krótkim namnożeniu kultury, po czym następuje izolacja DNA. Im krótszy jest czas hodowli, tym szybciej można przejść do ekstrakcji DNA i analizy molekularnej [Malorny i in. 2008]. Zaletą techniki Real-Time jest prostota, specyficzność i duża wrażliwość, co umożliwia wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA, a tym samym pozwala na szybką identyfikację próbki żywności [Naravaneni i Jamil 2005 i Reynisson i in. 2006]. W przypadku klasycznej metodyki, zgodnej z normą PN-EN 6579:2003, czas potrzebny na przeprowadzenie pełnej analizy wymaga aż 7 dni. Uzyskany wynik obarczony jest subiektywną oceną analityka i zmiennością cech fizjologicznych ocenianych w testach biochemicznych. Szybkie techniki identyfikacji patogenów występujących w żywności, które bazują na analizie struktury DNA, stanowią jedne z najważniejszych rozwiązań technicznych w mikrobiologii molekularnej. Techniki PCR pozwalają na znaczne skrócenie nr 573, 2013

6 A. Misiewicz, A. Goncerzewicz czasu wykrycia bakterii z rodzaju Salmonella. Całkowity czas analizy wraz z etapami nieselektywnego namnożenia i izolacji DNA mieści się w 24 h. Real-Time PCR oraz klasyczny PCR są technikami czulszymi niż metody tradycyjne [Malorny i in. 2008]. Celem przeprowadzonych badań było wykrycie bakterii Salmonella sp. z wykorzystaniem techniki Real-Time PCR w różnych matrycach żywnościowych, potwierdzenie wyników przez zastosowanie klasycznej reakcji PCR oraz sprawdzenie wpływu izolacji DNA na końcowy wynik analizy Real-Time PCR. MATERIAŁ I METODY Materiałem były szczepy: Salmonella enterica serowar Enterica KKP 1193, Salmonella sp. KKP 1169, Salmonella sp. KKP 1611, Salmonella enterica serowar Gaminara KKP 1008. Wszystkie szczepy w badaniach pochodziły z Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS [KKP, www.kkp.ibprs.pl]. Podłożem stosowanym do namnożenia próbek zakażonych patogenami była zbuforowana woda peptonowa (BioMerieux). Reakcję amplifikacji prowadzono z parą specyficznych starterów Sal465L i Sal142F. Do Real-Time PCR zastosowano zestaw komercyjny Salmonella spp. Identification STRIP KitTM Manual for Rotorgene firmy Biolytix AG. W badaniach były zastosowane dwa protokoły izolacji DNA: 1. Szybka metoda izolacji DNA. Po odpowiednim czasie hodowli pobierano 300 μl zawiesiny komórek. Następnie próbki były ogrzewane w temperaturze 99 C przez 15 min, stosowano klasyczny sposób izolacji DNA metodą gotowania. Źródłem DNA jest otrzymany supernatant. 2. Metoda izolacji za pomocą zestawu komercyjnego GeneMatrix (EUR x ). Próbki rozdrabniono, poddawano lizie w buforze Res FE i Lyse FE w celu rozpuszczenia struktur tkankowych i komórkowych. Do uzyskanego materiału dodawano proteinazę K w celu degradacji białek komórkowych, białek wiążących DNA i nukleaz. Postępowano zgodnie z metodyką producenta. Czystość i jakość wyizolowanego DNA sprawdzano na spektrofotometrze NanoDrop. Amplifikacja DNA: 1. Tradycyjny PCR. Reakcje PCR przeprowadzono w objętości 25 μl, zawierającej w odpowiednich ilościach: 2,5 μl każdego ze starterów, o stężeniu 2 μm, 13 μl H 2 O; 2,5 μl dntps, każdy o stężeniu 2,5 μm, 2,5 μl buforu Run 10-razy stężonego, 1 U 1 μl polimerazy Run (A&ABiotechnology), 1 μl badanego DNA. Amplifikację wykonano z wykorzystaniem termocyklera (Termocykler Px2 Thermo Electron). Profil temperaturowy reakcji: 94 C 4 min; [94 C 30 s, 60 C 30 s, 72 C 40 s] przez 20 cykli; następnie 15 cykli [94 C 30 s, 63 C 30 s, 72 C 40 s]; 62 C 20 min. 2. Real-Time PCR. Do reakcji Real-Time PCR wykorzystano Salmonella spp. Identification STRIP-Kit TM Manual for Rotorgene firmy Biolytix AG. Kontrola pozytywna zawierała DNA Salmonella, o takim samym stężeniu w każdej próbce, w kontroli negatywnej DNA zastąpiono wodą. Objętość końcowa próbki do reakcji Real-Time PCR wynosiła 20 μl, w tym 5 μl DNA po izolacji DNA. Profil temperaturowy reakcji amplifikacji: 50 C 2 min; 95 C 10 min; [95 C 15 s, 60 C 60 s] x 50. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Wykrywanie bakterii Salmonella metodami molekularnymi... 7 Jako matryce żywnościowe zastosowano produkty płynne (mleko, woda) i produkty stałe (serek, ciasto, kiełbasa, czekolada). Zakażone próbki żywności przetrzymano przez 18 godzin w temperaturze 37 C. Po tym czasie pobierano z każdej próbki 300 μl próbki do izolacji DNA. Kolejne pobrania próbek do badań odbywały się po 2, 4, 6, 8, i 18 godzinach hodowli. Do czasu izolacji próbki zamrażano. WYNIKI I DYSKUSJA Uzyskane wyniki czystości (1,45 do 2,09) i ilości DNA (od 16,59 ng μl 1 do 61,10 ng μl 1 ) z różnych matryc wskazują na prawidłowo przeprowadzoną izolację. Próbki serka homogenizowanego zakażono bakteriami: Salmonella enterica serowar Enterica KKP 1193 i Klebsiella pneumoniae KKP 1586, która pełniła rolę kontroli negatywnej. DNA uzyskane z obu rodzajów izolacji zastosowano do reakcji PCR w czasie rzeczywistym. W obu przypadkach uzyskano właściwy produkt amplifikacji. Przy stosowaniu DNA z bakterii Klebsiella pneumoniae zaobserwowano produkt amplifikacji DNA na poziomie kontroli negatywnej. Na rysunkach 1 i 2 przedstawiono wyniki uzyskane po reakcji molekularnej. W każdej zakażonej próbce żywności wykryto z wykorzystaniem metody Real-time PCR bakterie z rodzaju Salmonella. Następnie dokonano analizy obecności DNA Salmonella w zakażonych próbkach metodą klasycznego PCR. W każdej pobranej do analizy zakażonej próbce stwierdzono obecność bakterii z rodzaju Salmonella sp. Wyniki uzyskane w wyniku klasycznej reakcji PCR były zgodne z wynikami uzyskanymi w reakcji Real-Time PCR. Wyniki otrzymany metodą Real-Time PCR uzyskano znacznie szybciej niż w klasycznej reakcji PCR, nie wymagały one bowiem rozdziału elektroforetycznego. Rys. 1. Fig. 1. Analiza próbek żywności zakażonych bakteriami Salmonella sp.: KP kontrola pozytywna, KN kontrola negatywna Analysis of food samples contaminated of Salmonella sp.: KP positive control, KN negative control nr 573, 2013

8 A. Misiewicz, A. Goncerzewicz Rys. 2. Fig. 2. Analiza próbek żywności zakażonych bakteriami Klebsiella pneumoniae Analysis of food samples contaminated of Klebsiella pneumoniae 400pz 300pz Rys. 3. Fig. 3. Wynik analizy otrzymany w reakcji PCR ze starterami Sal465L i Sal142F. Produkty reakcji o wielkości 343 pz: 1 6 próbki żywności zakażone bakteriami Salmonella sp., 7 kontrola pozytywna, 8 kontrola negatywna, M Gene Ruler DNA Ladder, Low Range Fermentas Result of PCR analysis using Sal465L and Sal142F starter. Reaction product of 343 bp: 1 6 food samples Salmonella sp. contaminated, 7 positive control, 8 negative control, M Gene Ruler DNA Ladder, Low Range Fermentas Day i inmi [2009] w swoich badaniach wykazali, iż Real-Time PCR jest skutecznym narzędziem do identyfikacji Salmonella enterica serowar Enteritidis z surowych i niedogotowanych jaj. W produktach tych znajduje się wiele związków, które mogą powodować inhibicję reakcji molekularnej, dlatego wykorzystali oni zmodyfikowaną procedurę, wykorzystując Real-Time PCR. Arrach i inni [2008] zastosowali technikę Real-Time PCR do identyfikacji różnych genotypów w obrębie jednego serowaru bakterii Salmonella. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Wykrywanie bakterii Salmonella metodami molekularnymi... 9 Technika Real-Time PCR znalazła zastosowanie w badaniach epidemiologicznych. Przypadek taki miał miejsce w USA w Teksasie w 2002 roku, gdzie odnotowano ponad 100 pacjentów zakażonych bakteriami Salmonella [Daum i in. 2002]. Malorny i inni [2004] w analizach Real-Time PCR wykryli wszystkie ze 110 badanych szczepów Salmonella, dodatkowo sprawdzili selektywność metody dla 87 szczepów bakterii towarzyszących bakterii Salmonella sp. Specyficzność i selektywność metody określono na 100%. W niniejszej pracy porównano Real-Time PCR i klasyczny PCR pod względem czasu analiz i trudności w interpretacji wyników. Analizy wykazały obecność bakterii dla obydwu technik we wszystkich próbach zakażonych bakteriami z rodzaju Salmonella, jednakże wyniki uzyskane Real-Time PCR były bardziej czytelne. Przykładowo Molarny i inni [2003] w swoich badaniach wykorzystali klasyczny PCR do identyfikacji genu inva, który jest genem typowym dla większości bakterii Salmonella. W niniejszej pracy zastosowano startery bazujące na stabilnych fragmentach genomu bakterii Salmonella. WNIOSKI 1. Metoda identyfikacji z wykorzystaniem Real-Time PCR jest skutecznym narzędziem do identyfikacji bakterii z różnych matryc żywnościowych. 2. Potwierdzono, że zastosowanie techniki PCR i Real-Time PCR pozwala na skrócenie czasu wykrycia bakterii Salmonella sp. w żywności w porównaniu z metodami klasycznymi. 3. Zastosowane w analizach różne metody izolacji nie wpłynęły na identyfikację metodą Real-Time PCR. 4. Metoda Real-Time PCR pozwala na uzyskanie graficznych, łatwych w interpretacji wyników, nie wymaga rozdziału elektroforetycznego. LITERATURA Arrach N., Porwollik S., Cheng P., Cho A., Long F., Choi A., McClelland M., 2008. Salmonella serovar identification using PCR-based detection of gene presence and absence. J. Clin. Microbiol. 46 (8), 2581 2589. Atkins S.D., Clark I.M., 2004. Fungal molecular diadnostics: a mini revive. J. Appl. Genet. 45 (1): 3 15. Blais B.W., Martinez-Perez A., 2008. Detection of group D salmonellae including Salmonella Enteritidis in eggs by polymyxin-based enzyme-linked immunoabsorbent assay. J. Food Prot. 71, 392 396. Boughton C., Egan J., Kelly G., Markey B., Leonard N., 2007. Quantitative examination of Salmonella spp. in the lairage environment of a pig abattoir. Foodborne Pathog. Dis. 4, 26 32. Coyle E.F., Palmer S.R., Ribeiro C.D., Jones H.I., Howard A.J., Ward L., Rowe B., 1998. Salmonella enteritidis phage type 4 infection: association with hen s eggs. Lancet. Dec. 3, 2 (8623), 1295 1297. nr 573, 2013

10 A. Misiewicz, A. Goncerzewicz D Aoust J.Y., 1991. Psychrotrophy and foodborne Salmonella. Int. J. Food Microbiol. 13, 207 215. Daum L.T., Barnes W.J., McAvin J.C., Neidert M.S., Cooper L.A., Huff W.B., Daul L., Riggins W.S., Morris S., Salmen A., Lohman K.L., 2002. Real-Time PCR detection of Salmonella in suspect foods from a gastroenteritis outbreak in Kerr Country, Texas. J. Clin Microbiol. 40 (8), 3050 3052. Day J.B., Basavanna U., Sharma S.K., 2009. Development of a cell culture method to isolate and enrich Salmonella enterica serotype Enteritidis from shell eggs for subsequent detection by Real-Time PCR. Appl. Environ. Microbiol. 75 (16), 5321 5327. Fegan N., Vanderlinde P., Higgs G., Desmarchelier P., 2004. Quantification and prevalence of Salmonella in beef cattle presenting at slaugher. J. Appl. Microbiol. 97, 892 898. Fricker M., Messelhausser U., Busch U., Scherer S., Ehling-Schulz M., 2007. Diagnostic real-time PCR assays for the detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food- -borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892 1898. Malorny B., Hoorfar J., Bunge C., Helmuth R., 2003. Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR: towards and international standard. Appl. Environ. Microbiol. 69 (1), 290 296. Malorny B., Paccassoni E., Fach P., Bunge C., Martin A., Helmuth R., 2004. Diagnostic Real- -Time PCR for detection of Salmonella in food. Appl. Environ. Microbiol. 70 (12), 7046 7052. Malorny B., Löfström C., Wagner M., Krämer N., Hoorfar J., 2008. Minireviews: Enumeration of Salmonella bacteria in food and feed samples by Real-Time PCR for quantitative microbial risk assessment. Appl. Environ. Microbiol. 74 (5), 1299 1304. Misiewicz A., Goncerzewicz A., Suchorzyńska M., 2009. Rapid molecular methods for the identification Salmonella sp. in food. poster. Konferencja Naukowa BioMillenium, Politechnika Gdańska, 22 24.10.2009. Naravaneni R., Jamil K., 2005. Rapid detection of food-borne pathogens by using molecular techniques. J. Med. Microbiol., 54, 51 54. Nissen M.D., Sloots T.P., 2002. Rapid diagnosis in pediatric infectious diseases: the past, the present and the future. Pediatr. Infect. Dis. J. 21, 605 612. Pindar K., Cook A., Pollari F., Ravel A., Lee S., Odumeru A.J., 2007. Quantitative effect of refrigerated storage time on the enumeration of Campylobacter, Listeria, and Salmonella on artificially inoculated raw chicken meat. J. Food Prot. 70, 739 743. PN-EN ISO 6579:2003/A1:2007 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp. Rozporządzenie (WE) nr 853/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. Dz. Urz. UE L 139/55. Seo K.H., Valentin-Bon I.E., Bracket R.E., Holt P.S., 2004. Rapid specific detection of Salmonella enteritidis in pooled eggs by real-time PCR. J. Food Prot. 67, 864 869. Stephens N., Sault C., Firestone S.M., Lightfoot D., Bell C., 2007. Large outbreaks of Salmonella Typhimurium phage type 135 infections associated with the consumption of products cointaining raw egg in Tasmania. Commun. Dis. Intell. 31, 118 124. Swaminathan B., Feng P. 1994. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. An. Rev. Microbiol. 48, 401 426. Wiedro K., Stachowska E., Chlubeko D., 2007. Łańcuchowa reakcja polimerazy z analizą w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Roczniki Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie 53, 3, 5 9. Wyska E., Rosiak M., 2006. Zastosowanie łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR) w badaniach farmakokinetycznych. Postępy Hig. Med. Dośw. 60, 660 666. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

Wykrywanie bakterii Salmonella metodami molekularnymi... 11 DETECTION OF SALMONELLA SP. IN FOOD USING MOLECULAR METHODS Summary. Pathogenic bacteria of Salmonella genus are the most common infections in food industry. They might to contaminate wide range of products, protein food e.g. meat, milk food, eggs and egg foods, plants and its preserves, fodder and feeds. Detection and identification of Salmonella sp. are made using traditional methods corresponding with standard PN-EN 6579:2003. That method is commonly used in the microbiological laboratories its time consuming and laborious analysis. Using a modern molecular biology techniques allow to confirm the Salmonella infections in 24-hours with enrichment and isolation steps. In our study were used Real-Time PCR and traditional PCR techniques to detect Salmonella pathogens from various foods. In addition we checked time of molecular analysis. In the study was used commercial kit to Real-Time PCR analysis and primer set Sal465L, Sal142F with are based on characteristic and solid genomic fragments of Salmonella genus. In every experiment we got positive results for food contaminated by Salmonella. The results were obtained in 21 25 hours. Key words: identification, PCR, Real-Time PCR, Salmonella sp. nr 573, 2013