Arkadiusz Kozubek LIPOSOMY

Arkadiusz Kozubek WSTĘP DO TECHNOLOGII LIPOSOMOWEJ Wrocław 2004

2

Arkadiusz Kozubek LIPOSOMY Wrocław 2004 3

4 Copyright 2004 by Arkadiusz Kozubek

Wprowadzenie Lecytyna, nadal główny składnik większości liposomów, została wydzielona po raz pierwszy z żółtka jaja w roku 1846 przez Gobleya a jej struktura została określona przez Streckera w 1868 roku. Już w 1854 roku Virchof w czasie obserwacji zachowania się wysuszonych nerwów umieszczonych w wodzie zauważył zjawisko pęcznienia lipidów w roztworze wodnym. Już w 1888 roku odkryto ciekłe kryształy (Lehmann i Rainitzer) oraz dostrzeżono istotność biologiczną koloidalnych asocjatów fosfolipidowych (Thudicum). W 1911 Lehmann w swej książce dotyczącej ciekłych kryształów po raz pierwszy zamieścił zdjęcie mikroskopowe struktur powstających podczas uwadniania fosfolipidów. Lehmann nazwał je Künstliche Zellen czyli sztuczne komórki. A B B A - opisane w 1854 roku przez Virchowa twory mielinowe B - zdjęcia mikroskopowe sztucznych komórek wykonane w 1911 roku przez Lehmana Przez następne lata wiele badań dotyczyło właściwości fosfolipidów i roli ich obecności w błonach biologicznych (np. przełomowe doświadczenia Grotera i Grendela stanowiące podwaliny dwuwarstwowej struktury błony biologicznej). W latach 60-tych Bangham współpracując z Hornem nad użyciem mikroskopu elektronowego dla charakteryzowania zawiesin wodnych lipidów, uzyskanych z pobliskiego laboratorium Dawsona, po raz pierwszy wykazali iż zawiesina składa się z zamkniętych, sferycznych i wielowarstwowych struktur. W swoich opublikowanych w 1964 i 1964 roku pracach Bangham wraz z współpracownikami wykazali istnienie oraz istotę liposomów jako wielowarstwowych pęcherzyków oraz zbadali wiele z ich właściwości. Przewidzieli również szybki rozwój zastosowań liposomów w biofizyce, fizykochemii koloidów, chemii oraz biologii komórki. Pierwsze banghosomy, zwane obecnie liposomami (od greckiego określenia - ciałka lipidowe) wielowarstwowymi, zbudowane są z kilku do kilkunastu przestrzeni wodnych oddzielonych od siebie zamkniętymi koncentrycznymi warstwami fosfolipidowymi o dwucząsteczkowej grubości. Niemalże w tym samym czasie (1967) Papahadjopoulos z współpracownikami opublikowali metodę uzyskiwania jednowarstwowych liposomów przez długotrwałą sonikację (poddanie działaniu ultradźwięków) zawiesiny fosfolipidów w roztworze wodnym, drugą z kluczowych i używanych do dnia dzisiejszego metod. Dynamiczny rozwój technik w latach 70-tych zaowocował tak znanymi technikami jak zastosowanie prasy Frencha lub homogenizatorów dla zmniejszania rozmiarów liposomów, zastosowanie techniki dializy detergentowych roztworów lipidów, uzyskiwanie liposomów metodą odparowywania faz odwróconych czy kalibracji wymiarowej przy zastosowaniu ekstruzji przez filtry membranowe. 5

Mechanizm powstawania liposomów Możliwość powstawania liposomów wynika z wyjątkowo korzystnych wartości HLB fosfolipidów jako amfifilów oraz kształtu ich cząsteczek, dzięki czemu większość fosfolipidów preferuje tworzenie agregatów o strukturze dwuwarstwowej. Badania teoretyczne podstaw mechanizmu tworzenia liposomów nie rozwijały się jednak w ta samo szybkim tempie jak badania nad nowymi technikami uzyskiwania i charakterystyki coraz to nowych rodzajów liposomów oraz ich zastosowań. Do niedawna praktycznie jedynie teoretyczne rozważania Saupego i Helfricha dotyczyły praw i zależności dotyczących struktury i rozkładu wielkości liposomów. Saube wyjaśniał problem warstwowości liposomów przy zastosowaniu wolnej energii ekspansji Landaua natomiast prace Helfricha, jak i ostatnio Lasica, wiązały wielkość energii zagięcia (bending energy) dwuwarstwy lipidowej z procesem tworzenia pęcherzyków liposomowych. W myśl tych opisów pęcherzyki liposomowe tworzą się podczas minimalizacji całkowitej energii brzegowej następującej w czasie zaginania płaskiej dwuwarstwy i tworzenia zamkniętych struktur. To eliminuje niekorzystną ekspozycję krawędzi ale równocześnie zwiększa energię zagięcia układu czego rezultatem jest termodynamicznie metastabilny stan liposomów. Tworzenie dużych wielowarstwowych liposomów podczas pęcznienia suchych dwuwarstw fosfolipidowych (nawet w stanie suchym, tj. przy bardzo małej ilości wody, fosfolipidy występują w postaci dwuwarstw) wynika z indukowanego na skutek różnic wielkości główek polarnych lipidów zewnętrznej i wewnętrznej monowarstwy zakrzywiania warstwy. Zakrzywienie to powoduje zaburzenie upakowania pomiędzy monowarstwami i w chwili osiągnięcia pewnej granicznej wartości różnic - odpączkowanie pęcherzyka. Zdolność liposomów do zamykania roztworów różnorakich solutów stała się podstawą rozwinięcia dwóch głównych, realizowanych praktycznie jednocześnie, kierunków badawczych - użycia liposomów jako prostych i poręcznych modeli błony biologicznej (przynajmniej jej podstawowej struktury jaką jest dwuwarstwa lipidowa) oraz zastosowania liposomów jako struktur zdolnych do przenoszenia i dostarczania do komórek zamkniętych w nich solutów. 6

Jedną z propozycji mechanizmu formowania liposomów poprzez odpączkowywanie pęcherzyków z hydratowanego wielowarstwowego filmu lipidowego zaproponował Lasic. Jak wspomniano wcześniej, badania nad liposomami jako modelowymi błonami biologicznymi zaowocowały również wielością metod pozwalających na uzyskiwanie różnorodnych rodzajów liposomów. Te poszukiwania coraz to nowych technik preparacji liposomów wynikały z faktu, iż nie znaleziono jeszcze sposobu uzyskania uniwersalnego liposomu. Jedne techniki są bardzo proste lecz w wyniku ich zastosowania uzyskuje się liposomy składające się z wielu koncentrycznych przedziałów wodnych, inne techniki umożliwiają wprawdzie uzyskiwanie liposomów otoczonych jedynie pojedynczą dwuwarstwą, czyli zawierające jeden przedział wodny lecz wymiary tych struktur są zbyt małe dla pewnych zastosowań. Badania nad użyciem liposomów jako nośników przekształciły się w oddzielną gałąź zwaną technologią liposomową a u ich podstaw leżał również fakt iż struktury te, utworzone z naturalnych składników, budujących przecież wszystkie komórkowe struktury błonowe, a więc obojętnych immunologicznie. Głównymi cechami technologii liposomowej są: opracowanie postępowania umożliwiającego wprowadzanie solutów do wnętrza komórek w sposób ukierunkowany i kontrolowany. Tymi solutami mogą być zarówno substancje drobnocząsteczkowe jak i makrocząsteczki. Wprowadzanie solutów umieszczonych w strukturach zamkniętych typu liposomu zapobiega m.in. niepożądanym reakcjom ubocznym jak i chroni je przed zbyt szybkim wchłonięciem lub degradacją. opracowanie takich technologii, dzięki którym dawki leków toksycznych w stanie wolnym mogłyby być obniżone przy zachowaniu skuteczności terapeutycznej lub też samo ich zamknięcie w liposomach spowodowałoby spadek ich efektu toksycznego. Dodatkowo, niezmiernie ważnymi zagadnieniami są poprawienie farmakodynamiki leków, uczynienie liposomów niewykrywalnymi przez system makrofagów jednojądrzastych oraz uzyskanie możliwości przechowywania liposomów przez odpowiednio długi czas. 7

Rodzaje liposomów Liposomy, jako fosfolipidowe pęcherzykowe struktury można, niezależnie od wielości stosowanych technik uzyskiwania można podzielić na trzy główne klasy: 1. wielowarstwowe pęcherzyki lipidowe(mlv) wielkości 200nm-kilka mikronów 2. małe jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (SUV) wielkości 25-100 nm 3. duże jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (LUV) wielkości 100-400 nm 4. pęcherzyki ogromne (giant) o wielkości powyżej 1 mikrona Liposomy należące do poszczególnych klas różnią się przede wszystkim liczbą budujących je dwuwarstw lipidowych - MLV, jak już wspomniano wcześniej przypominają w przekroju główkę cebuli natomiast SUV i LUV są otoczone tylko przez jedną dwuwarstwę. Drugą istotną cechą różniącą poszczególne rodzaje liposomów jest wielkość przestrzeni wodnej zamkniętej w liposomie a właściwie stosunek wielkości przestrzeni wodnej do ilości lipidu wymaganego dla jej zamknięcia. Co więcej, granice pomiędzy poszczególnymi klasami nie są ostre. Widać to n.p. na przykładzie liposomów SUV i LUV. Liposomy MLV i SUV nie są pod względem wielkości (objętości) przestrzeni wodnej dobre gdyż albo ilość zamykanego roztworu wodnego jest bardzo mała w stosunku do ilości lipidu potrzebnej dla zamknięcia tej objętości albo też objętość roztworu zamykana w liposomie jest zbyt mała dla praktycznych zastosowań jak nośnika. Kryteria te ulegną jednak zmianie wraz ze zmianą charakteru solutu, który ma być transportowany przy pomocy liposomu. Soluty hydrofobowe lub silnie amfifilowe, które preferują środowisko niewodne będą w trakcie tworzenia liposomu lokować się przede wszystkim we wnętrzu dwuwarstwy tak więc dla tego typu związków warstwowość liposomów nie stanowi istotnego ograniczenia. Podobnie w przypadku związków silnie asocjujących z powierzchnią dwuwarstwy. Jeszcze do niedawna fosfolipidy naturalne lub półsyntetyczne były jedynym materiałem wyjściowym do produkcji liposomów. W chwili obecnej liposomy można otrzymywać z innych związków amfifilowych albo całkowicie syntetycznych albo też nie będących w żadnej mierze fosfolipidami. Jedynym warunkiem fizykochemicznym, jaki musi spełniać związek by móc z niego przygotować liposomy to zdolność do preferowania w warunkach silnego uwodnienia struktury dwuwarstwowej, analogicznej do struktury tworzonej przez fosfolipid. Nawiasem mówiąc, istnieją związki amfifilowe dwupolarne, które tworzą struktury warstwowe o grubości odpowiadającej grubości dwuwarstwy fosfolipidowej a będące w istocie monowarstwami lecz o obu powierzchniach hydrofilowych. Puryści językowi, mimo iż zarówno fosfolipidy jak i niefosfolipidowe związki amfifilowe tworzą pęcherzyki liposomowe, zastrzegają jednak termin liposom dla pęcherzyków zbudowanych przede wszystkim z fosfolipidów natomiast pęcherzyki zbudowane z innych amfifilów opatrują nazwami w rodzaju niosomy, nanosfery czy nanocząstki. 8

Liposomy wielowarstwowe (MLV). Obraz po lewej - kriorytowa mikroskopia elektronowa, obraz po prawej - transmisyjna mikroskopia elektronowa Liposomy jednowarstwowe (SUV) -transmisyjna mikroskopia elektronowa Liposomy jednowarstwowe (SUV) -kriorytowa mikroskopia elektronowa 9

Uzyskiwanie liposomów LIPIDY hydratacja suchego filmu lipidowego rozpuszczenie lipidów emulgacja zawiesina MLV koloidalny roztwór Roztwór w rozpuszczalniku (mikro)emulsja odpączkowanie kalibracja fragmentacja usuwanie detergentu mieszający się z wodą wstrzykiwanie niemieszający się z wodą żel LUV LUV,SUV SUV LUV SUV, MLV LUV, MLV MLV, LUV W odpowiedzi na potrzeby posiadania określonego typu liposomów wymaganych dla konkretnych zastosowań, w okresie ostatniej dekady metody preparacji różnych typów liposomów uległy szybkiemu rozwojowi. Wartość metody lub kombinacji metod zależy przede wszystkim od potrzeb badacza i zakładanego celu ich wykorzystania. Pewne metody są bardziej użyteczne dla jednych celów, podczas gdy inne dla drugich. Ocena różnych metod opierająca się na wielkości i warstwowości uzyskiwanych liposomów będzie przedstawiona poniżej. Innym kryterium oceny metody jest stwierdzenie czy metoda nadaje się szczególnie dla skali laboratoryjnej (1-100 ml liposomów o stężeniu 10-100 mg lipidu/ml), skali półprodukcyjnej (do 10 l zawiesin o stężeniu 100-300 mg/ml) czy też skali produkcji przemysłowej (ponad 10 l o stężeniu do 400 mg/ml). Generalnie, dla uzyskiwania/produkcji liposomów stosuje się następujące techniki polegające na: Hydratacji cienkiego filmu lipidowegop Sonikacji (działaniu destrukcyjnemu) fal ultradźwiękowych Kalibracji (przeciskaniu przez określonej wielkości pory) Zastosowaniu prasy Frencha Wstrzykiwaniu roztworu etanolowego Wstrzykiwaniu roztworu eterowego Dializy detergentowej Odparowywaniu techniką faz odwróconych 10

Jeżeli nie ma ograniczeń czy też preferencji w stosunku do rozmiarów i warstwowości liposomów to wielowarstwowe liposomy (MLV) są przydatne do zamykania solutów lipofilowych lub też wtedy, gdy efektywność zamykania roztworów wodnych nie jest istotna. Na skalę laboratoryjną odpowiednią techniką jest klasyczna metoda hydratacji cienkiego filmu lipidowego w roztworze wodnym zawierającym rozpuszczony w wodzie solut. Solut lipofilny jest dodawany do roztworu lipidów przed odparowaniem rozpuszczalników i utworzeniem filmu. Produkcja liposomów na większą skalę obejmuje takie postępowania jak liofilizacji, suszenie rozpylonej zawiesiny, czy też wstrzykiwania roztworu lipidowego do roztworu wodnego połączonego z równoczesnym odparowywaniem rozpuszczalnika. Dla pewnych zastosowań wąski zakres wielkości i wysoki stosunek powierzchni do objętości małych jednowarstwowych liposomów czyni je bardzo przydatnymi, szczególnie gdy nie jest wymagana wysoka wydajność zamykania wodorozpuszczalnych solutów. Do ich preparacji na skalę laboratoryjną stosuje się dezintegrację liposomów MLV ultradźwiękami. Do tego celu stosuje się dezintegratory zanurzeniowe lub dezintegratory wannowe. Podczas dezintegracji w sonikatorach zanurzeniowych do preparatu dostają się oderwane od końcówki cząstki metalu. Z tego względu preparat należy po sonikacji odwirować na wysokoobrotowej wirówce. Sonikatory wannowe są wolne od tego problemu ale wymagają dużych mocy aby proces przegiegał wydajnie. 11

Innym sposobem uzyskiwania małych liposomów jest rozbijanie dużych siłami ścinania w prasie Frencha (zawiesina przeciskana jest przez pojedynczy otworek przy użyciu wysokich (do 200 bar) ciśnień lub wstrzykiwanie etanolowych roztworów lipidu do roztworu wodnego. Prasa Frencha Wstrzykiwanie roztworu etanolowego Wybór pomiędzy metodami zależy od dostępności sprzętu oraz istotności obecności w uzyskiwanych preparatach liposomowych resztkowych ilości etanolu (do 10%). Duże jednowarstwowe liposomy są szczególnie przydatne dla wydajnego zamykania rozpuszczonych w wodzie solutów z powodu preferującej objętość przestrzeni wodnej wartości stosunku objętości do powierzchni. Liposomy tego typu są również pożądane do badań nad rekonstytucją białek błonowych a także badań nad przepuszczalnością i fuzją błon. Do preparacji tego typu liposomów stosowane są często metody tzw. usuwania detergentów, w których lipid rozpuszcza się (solubilizuje) w roztworze detergentu o wysokiej wartości CMC (cholan, oktyloglukozyd), uzyskany roztwór detergentowolipidowy umieszcza się w komorze dializacyjnej i poddaje intensywnemu usuwaniu cząsteczek detergentu poprzez dializę. Uzyskane liposomy można zagęścić dla uzyskania wyższych stężeń lipidu poprzez ultrafiltrację. Najbardziej wydajną metodą uzyskiwania LUV jest metoda zwana odparowywaniem fazami odwróconymi. (REV). W metodzie tej roztwór lipidu w lotnym rozpuszczalniku organicznym emulguje się z roztworem wodnym a następnie poddaje się odparowaniu rozpuszczalnika organicznego np. w rotacyjnej wyparce próżniowej. Pozostałość rehydratuje się przez dodanie nowej porcji roztworu wodnego. Obie z opisanych powyżej metod charakteryzuje jednak pozostawanie w preparacie pewnej ilości używanych rozpuszczalników, szczególnie detergentów, co często ogranicza zastosowanie tak otrzymanych liposomów. 12

Inne techniki preparacji liposomów zostały przedstawione na kolejnych rysunkach: Infuzja roztworu eterowego Objętość fazy wodnej zamykana w liposomach Jak już wspomniano przy omawianiu rodzajów liposomów, różnią się one objętością swoich przedziałów wodnych. Największą mają liposomy typu LUV. Opracowano ostatnio jednak metody pozwalające na istotne poprawienie parametrów liposomów wielowarstwowych, tj. tych których uzyskiwanie jest najprostrze. Opisane poniżej postępowanie umożliwia nie tylko powiększenie objętości roztworu zamykanego w liposomie lecz również redukuje liczbę warstw do kilku a w sprzyjających przypadkach umożliwia uzyskiwanie liposomów jednowarstwowych typu LUV. Postępowanie to wykorzystuje fakt destrukcji dwuwarstwy pod wpływem szybkiego zamrażania liposomu oraz ponowne jej tworzenie podczas rozmrażania preparatu. Technika ta została nazwana FAT od Frozen And Thawed (zamrożone i rozmrożone). Zawiesinę liposomów zamraża się szybko przez umieszczenie w naczyniu zawierającym mieszaninę oziębiającą (ciekły azot czy stały dwutlenek węgla (suchy lód) z acetonem lub etanolem) do chwili całkowitego zamrożenia a następnie rozmraża przez umieszczenie w łaźni wodnej o temperaturze ok. 60 o C. To zamrażanie i rozmrażanie powtarza się od kilku do kilkunastu razy. Obserwując zawiesinę liposomów można zauważyć nawet gołym okiem fakt zmniejszenia się jej mętności po poddaniu jej opisanej procedurze. Dla oznaczania stopnia zamykania solutów w fazie wodnej należy po pierwsze oddzielić niezamkniętą (związaną) substancję od jej formy liposomowej. Najczęściej stosuje się filtrację żelową (patrz dalej). Wielkość liposomów Wydawać by się mogło, że użycie MLV dla przenoszenia związków lipofilnych a dużych LUV dla przenoszenia związków rozpuszczonych w fazie wodnej będzie korzystne dla wprowadzania solutów np. do organizmu człowieka. Okazuje się jednak, że wprowadzenie cząstek o tak dużych rozmiarach zmniejsza istotnie czas ich krążenia w krwioobiegu podczas którego uwalniają one swoją zawartość. Szczególnie istotne jest wychwytywanie liposomów przez komórki fagocytujące. Z drugiej strony większość technik preparacji liposomów daje populacje pęcherzyków o dużej niejednorodności wielkości. Dlatego też coraz częściej uzyskane liposomy poddaje się finalnemu procesowi ujednorodniania ich wielkości. Do tego celu stosuje się już powszechnie technikę kalibrowania wymiarowego liposomów. W technice tej liposomy przeciska się (ekstruduje) przez pory w poliwęglanowych filtrach membranowych. Filtry te charakteryzują się jednorodnej wielkości porami w postaci kanałów o okrągłym przekroju niemal prostopadłych do powierzchni błonki. 13

Przetłaczanie, w odróżnieniu od zwykłych urządzeń do filtracji płynów pod ciśnieniem, pracujących przy ciśnieniach do ok. 8 atmosfer, odbywa się przy ciśnieniach 20-54 atmosfer zależnie od wielkości porów i stężenia lipidów. POLIWĘGLANOWY FILTR MEMBRANOWY Fragment powierzchni filtra poliwęglanowego oglądany pod mikroskopem elektronowym PRZEKRÓJ PRZEZ FILTR pory Do kalibracji wymiarowej liposomów stosuje się urządzenia nazywane z angielska ekstruderami liposomowymi. Oprócz kalibratorów wykorzystujących ciśnienie gazu produkowane są urządzenia ręczne, opierające się na zasadzie pompy hydraulicznej (mały nacisk na tłok o niewielkiej średnicy daje duże ciśnienia na tłoku o średnicy kilkunastokrotnie większej). Ciśnienia stosowane w kalibratorach tak gazowych jak i ręcznych są jednak zdecydowanie mniejsze od stosowanych w prasie Frencha. Co więcej jedynie technika przetłaczania liposomów przez filtry poliwęglanowe zapewnia uzyskiwanie liposomów o małym rozrzucie wielkości, czego nie można powiedzieć o liposomach uzyskiwanych w prasie Frencha. Kalibrator ręczny Kalibrator ciśnieniowy 14

Analiza rozkładu wielkości liposomów poddanych kalibracji przez filtr o wielkości porów 200 nm (0.2 µm) Oprócz ujednorodnienia wielkości liposomów kalibracja umożliwia również uzyskanie liposomów jednowarstwowych o wielkościach od 100 nm do 30 nm VET 400 - Vesicles by Extrusion Technique uzyskane przy zastosowaniu filtra 400 nm itp. Jednowarstwowość liposomów po kalibracji potwierdzono nie tylko metodą mikroskopową lecz również techniką 31 P NMR. W tej technice dodanie do buforu zewnętrznego jonów Mn 2+ wygasza sygnał NMR jedynie tych cząsteczek, które znajdują się w zewnętrznej monowarstwie. Dla liposomów jednowarstwowych powinno się więc obserwować 50% wygaszanie sygnału. Zależność intensywności wygaszania sygnału 31 P NMR od liczby przejść zawiesiny liposomowej przez filtr o porach 100 nm. 15

Zalety stosowania techniki VET Zastosowanie techniki VET, szczególnie w połączeniu z procedurą FAT umożliwia uzyskanie liposomów wolnych od wad występujących przy stosowaniu innych technik. Liposomy przygotowywane są bez udziału rozpuszczalnika organicznego czy detergentu używanych w innych technikach, których całkowite usunięcie z preparatów jest praktycznie niemożliwe. Szczególnymi zaletami techniki VET są: bezpośrednia produkcja liposomów LUV i SUV z MLV, szybkość i prostota metody (od suchego lipidu do jednowarstwowych liposomów w czasie kilkunastu minut), produkcja liposomów o wysokiej jednorodności wielkości, zależnej od zastosowanego filtra, możliwość stosowania dla wszystkich amfifilów, które w stanie uwodnienia przyjmują strukturę dwuwarstwową, możliwość zastosowania dla dużego zakresu stężenia lipidów (do 400 mg/ml), możliwość uzyskania liposomów o wysokim stopniu zamknięcia roztworu wodnego, Modyfikacjami powyższej techniki są: Ciągła kablibracja przez filtry ceramiczne Mikrofluidyzacja 16

Pomiar istotnych parametrów liposomów Dla charakteryzacji liposomów przeznaczonych dla praktycznego użycia jako nośniki leków ważne są takie parametry jak: wielkość pęcherzyków i jej rozkład (homogenność preparatu) liczba dwuwarstw w pojedyńczym pęcherzyku płynność błon (dwuwarstw) ładunek pęcherzyków objętość zamknięta Podstawowe zasady analizy rozmiarów/wielkości cząstek Dla wielu praktycznych zastosowań istotnym jest aby wielkość pęcherzyków liposomowych była nie tylko odpowiednio mała ale i aby liposomy były jednorodne, czyli charakteryzowały się małą polidyspersyjnością. Ponieważ błona liposomów jest elastyczna to samo zastosowanie procesu kalibrowania nie daje dokładnej informacji o realnej wielkości otrzymywanych liposomów. To powoduje konieczność dokonania pomiarów aktualnych wielkości uzyskiwanych w danej procedurze pęcherzyków liposomowych. Do pomiarów wielkości cząstek, w tym i liposomów stosuje się wiele różnorodnych technik. Ponieważ większość cząstek, w tym i liposomów, nie jest idealną kulą to w większości tych technik rzeczywiste cząstki o mniej lub więcej nieregularnym kształcie sprowadzane są do kuli. To uproszczenie powoduje iż w zależności od stosowanej techniki pomiaru wielkości, kluczowe wartości determinujące różnice wielkości cząstek są różne. W rezultacie również i uzyskiwane wielkości cząstek są różne. Ilustruje to poniższy rysunek. Jeśli obserwujemy cząstkę, która jest przecież strukturą trójwymiarową, w mikroskopie to de facto obserwujemy jej dwuwymiarową projekcję co powoduje że jej wielkość będzie opisywana przez wiele różnych średnic. Z tego powodu najczęściej przyjmuje się sprowadzanie cząstek do równoważnej im kuli. Ponieważ każda z technik mierzy inne parametry cząstki (maksymalną długość, minimalną długość, objętość, powierzchnię, masę etc.) to da informację różną od uzyskanej przy użyciu innej techniki opierającej się na pomiarze innego parametru opisującego cząstkę. Różne odpowiedzi ilustrowane na rysunku powyżej przez różnej wielkości średnice równoważnych cząstce (tej w środku rysunku) kół uzyskane przy zastosowaniu różnych technik są generalnie prawdziwe. Po prostu każda technika opiera się na pomiarze innych właściwości, parametrów cząstki. Jest to tak jak w sytuacji dwóch osób mierzących wielkość pudełka zapałek, z tym że jedna używa linijki calowej a druga centymetrowej oraz jedna mierzy 17

długość pudełka a druga jego szerokość. Z tego też powodu trudno jest podać absolutne wartości i dla porównywania wielkości cząstek uzyskiwanych np. różnymi metodami powinno się używać tych samych technik. Co więcej, nawet przyjmując sferyczność naszych cząstek to porównywanie ich wielkości zależy istotnie od parametrów kuli użytych jako podstawę porównywania. Dajmy na to, że mamy trzy kule o średnicy 1, 2 i 3 jednostek. Jaka będzie średnia ich wielkość? Na pierwszy rzut oka - 2.00, dlatego że 1+2+3=6 a 6/3=2.00. Ale jeśli porównywać te trzy kulki ze względu na ich powierzchnię to uzyskana średnia wielkość będzie nie 2.00 a 2.16. Z kolei jeśli porównywać ze względu na ich masę to średnia wartość będzie równa 2.20, a objętościowo 2.72 itd. Tak więc z powodu, iż każdy sposób określania średniej, opiera się na różnych parametrach mierzonych cząstek otrzymuje się praktycznie nieskończoną liczbę prawdziwych odpowiedzi. To, którą z nich należy zastosować, zależy od konkretnej potrzeby. Czy ważniejsza jest dla nas w danym momencie informacja dotycząca średnicy cząstki czy jej masy a może powierzchni. O istotności przyjęcia odpowiedniego parametru charakteryzującego analizowane cząstki może świadczyć poniższa tabela. Rozmiar Ilość obiektów % liczbowy obiektów % masowy obiektów 10-1000 7000 0.2 99.96 1-10 17500 0.5 0.03 0.1-1 3500000 99.3 0.01 Całościowo 3524500 100.00 100.00 Na skutek intensywnych badań kosmicznych w okołoziemskiej przestrzeni orbituje duża liczba obiektów (wg. danych z 1991 roku), których obecność musi być brana pod uwagę przy wystrzeliwaniu następnego satelity lub promu kosmicznego. Naukowcy, śledzący stale te obiekty klasyfikują je w zależności od wielkości na trzy grupy. Jeśli przeanalizujemy trzecią kolumnę tabeli to możemy stwierdzić, że 99.3% wszystkich tych obiektów jest niezmiernie mała. To stwierdzenie opiera się na analizie ILOŚCI obiektów. Ale jeśli przeanalizujemy kolumnę czwartą to stwierdzimy (prawidłowo), że większość obiektów to obiekty o wielkości 10-1000 cm. To tu występuje większość MASY obiektów. Tak więc rozkłady obiektów wg. ich ILOŚCI i wg. ich MASY są całkiem różne i wnioski wysuwane mogą być również całkowicie różne, zależnie od przyjęcia tego czy innego rodzaju rozkładu wielkości. Czasami, używając jednej metody (mierzącej określony parametr cząstki) konieczne jest przeliczenie np. jednego z parametru charakteryzującego cząstki na inny. Należy zdawać sobie sprawę z tego, że może spowodować to istotne zniekształcenie danych. N.p. używając mikroskopu elektronowego obliczono średnią wielkość cząstki w oparciu o ich średnicę. Matematycznie nie jest problemem przeliczenie tej wielkości na średnią objętość cząstki. Ale, jeśli błąd wyznaczania średnicy był np. ±3% to błąd wyznaczania średniej (objętości) jest ±27%, co wynika z faktu iż objętość jest zależna w trzeciej potędze od średnicy. Z drugiej strony należy zdawać sobie sprawę z tego, że gdy przy użyciu mikroskopu chcemy uzyskać rozkład objętościowy lub masowy, pominiemy chociażby jedną cząstkę 10 µm średnicy to odpowiadać to będzie 1000 cząstek 1 µm średnicy. 18

Podczas analizy statystycznej rozkładu cząstek istotnym jest również zdanie sobie sprawy z istotnych różnic pomiędzy trzema kluczowymi terminami: Średnia (MEAN) Jest to pewne arytmetyczne uśrednienie danych. W zależności od mierzonych parametrów cząstki, jak wykazano wcześniej, uzyskuje się szereg różnych wartości średnich. Mediana (MEDIAN) Jest to wartość wielkości cząstki, która wynika z podzielenia populacji na dwie jednakowe części, t.j. 50% dystrybucji znajduje się poniżej mediany i 50% powyżej. Modalna (MODE) Jest często używana w analizie rozkładu częstotliwości występowania i jest to wartość najwyższego punktu na krzywej częstości występowania. Jeśli rozkład wielkości analizowanych cząstek jest normalny, czyli opisywany krzywą dzwonową Gaussa to wszystkie te trzy wartości pokrywają się, leżą w tym samym punkcie. Natomiast jeśli rozkład jest bimodalny, czyli występują dwie populacje cząstek (n.p. jedna stanowiąca 49% a druga 51% całości) to każda z powyższych wartości znajdzie się w innym punkcie. Średnia arytmetyczna będzie niemal dokładnie pomiędzy oboma populacjami i to w miejscu gdzie w ogóle nie występują cząstki o takiej wielkości. Średnica medialna cząstek będzie się znajdować w obszarze 1% populacji stanowiącej 51% całości cząstek bowiem ten punkt dzieli całość dokładnie na dwie połowy. Natomiast modalna znajdować się będzie na szczycie krzywej opisującej większą populację (tą 51%) gdyż jest to najczęściej (o 1% ale zawsze) występująca wartość wielkości cząstek. Tak więc powyższe wartości wcale nie muszą być identyczne a nawet podobne, szczególnie gdy rozkład wielkości nie jest symetryczny. Metody stosowane do pomiarów wielkości cząstek W poprzedniej części wspomniano, że każda z technik pomiaru wielkości cząstek daje odmienną odpowiedź z powodu mierzenia odmiennych wymiarów cząstki. Poniżej zostaną przedstawione niektóre zalety i wady najczęściej stosowanych metod pomiarowych. Sita Technika mierzenia wielkości cząstek przez przesiewanie przez sita o różnicującej się wielkości oczek jest najstarszą techniką, najprostszą i najtańszą. Ale nie nadaje się do mierzenia emulsji, zawiesin i aerozoli, czyli nie ma zastosowania do pomiaru wielkości liposomów. Sedymentacja Również stara technika wykorzystująca do pomiarów opadania cząstek zależności opisane prawem Stokesa. Ma zastosowanie dla cząstek o wielkości od 2 do 50 mikronów. Dwoma podstawową wadą jest konieczność znania gęstości sedymentujących cząstek. Co więcej prawo Stokesa dobrze opisuje jedynie cząstki sferyczne. Metoda jest więc niezbyt dobra dla wolno sedymentujących zawiesin, emulsji. Dla małych cząstek, których szybkość sedymentacji jest wypadkową dwóch procesów - sedymentacji grawitacyjnej oraz ruchów Browna, uzyskane dane obarczone są błędem od 20% nawet do 100% w przypadku cząstek 500 nm wielkości. 19

Poza tym metoda jest czasochłonna - do 1 godziny/pomiar, wymaga bardzo dokładnej kontroli temperatury tak aby nie występowały tak jej gradienty jak i gradienty lepkości medium oraz posiada ograniczony zakres pomiarowy (dla cząstek poniżej 2 µm przeważają ruchy Browna i pomiary są niedokładne). Elektrodetekcja przepływowa (licznik Coultera) Technika opracowana w latach 50-tych dla liczenia elementów morfotycznych krwi opiera się na przepływie cząstek przez mały otwór w poprzek którego przyłożono pole elektryczne. Przy przepływie cząstek następuje zmiana pojemności elektrycznej co jest rejestrowane jako impuls napięciowy. Dla mierzenia emulsji czy aerozoli jak również dla cząstek o wielkości poniżej 0,2 µm (200 nm) technika ta nie jest przydatna. Mikroskopia Jest bardzo dobrą techniką gdyż pozwala eksperymentatorowi bezpośrednio obserwować badane cząstki. Pozwala ocenić kształt i stopień agregacji badanych cząstek. Przy zastosowaniu wspomaganej komputerowo analizy obrazu można szybko i efektywnie dokonać analizy. Należy jednak pamiętać, że w preparacie obserwuje się i analizuje jedynie część badanego materiału i w przypadku niereprezentatywnej próbki wyniki będą istotnie zakłamane. Co więcej, uzyskany wynik jest silnie zależny od dokładnego liczenia cząstek - jak wcześniej wspomniano, pominięcie 1 cząstki 10µm podczas analizy rozkładu wagowego odpowiada pominięciu 1000 cząstek 1µm. Poza tym mikroskopia elektronowa wymaga żmudnego przygotowywania próbek i jest powolna. Rozpraszanie światła laserowego Technika ta jest bardziej prawidłowo nazywana niskokątowym rozpraszaniem światła laserowego. Metoda rozwinięta w ciągu ostatnich 20 lat staje się obecnie standardową nie tylko w badaniach przemysłowych ale i w laboratoriach naukowych. Metoda opiera się na fakcie iż kąt rozproszenia jest odwrotnie proporcjonalny do wielkości cząstki i pozwala mierzyć cząstki od 1 nm do 2000µm. Aparat składa się ze źródła światła - laser helowo-neonowy a ostatnio coraz częściej diodowy (600 nm), przedziału umożliwiającego wprowadzenie próbki - próbka aerozolowa może być wprowadzana bezpośrednio w strumień światła laserowego; zawiesina powinna przezeń przepływać oraz detektora, którym jest z reguły półprzewodnikowy; Generalną zaletą techniki jest jej uniwersalność - każda forma próbki może być analizowana, dynamiczny zakres pomiarów jest bardzo szeroki, metoda jest niedestrukcyjna, szybka i dokonuje pomiarów w całej użytej do badania próbce. Spektroskopia korelacji fotonowej (PCS) Mimo, iż stosuje ona laser jako źródło światła, podobnie jak metoda rozpraszania światła laserowego to nie powinna być z tą techniką mylona. PCS służy do pomiarów cząstek w zakresie kilku nm do ok. 1 µm. Sygnał na detektorze jest niezmiernie słaby dlatego wymagany jest fotopowielacz oraz specjalny korelator. Zasada metody jest inna od stosowanej w badaniach rozpraszania światła laserowego. Korelacja fotonowa działa na zasadzie mierzenia czasowych zmian w ilości rozpraszanego przez cząstki światła podczas gdy technika rozpraszania mierzy kątowy rozkład światła rozproszonego przez cząstki. Podstawowy układ pomiarowy PCS przedstawiono na rysunku na następnej stronie. 20

Laser (konieczne jest silne źródło światła) oświetla próbkę, którą jest rozcieńczona zawiesina cząstek. Światło rozproszone przez cząstki jest wyłapywane przez fotopowielacz, zwykle ustawiony pod kątem 90 o. Jeśli sygnał fotopowielacza analizować oscylograficznie to można stwierdzić, że intensywność sygnału nie jest stała i ulega zmianie wraz z przepływaniem cząstek w poprzek strumienia światła i że fale światła rozproszonego przez nie nakładają się na siebie i ulegają interferencji. Tak więc fotopowielacz widzi nie stały a zmieniający się w czasie sygnał. Jeżeli cząstki są małe to wykonują one szybkie ruchy dyfuzyjne i światło rozproszone wykazuje szybkie fluktuacje. Większe cząstki dyfundują wolniej co powoduje wolniejsze fluktuacje sygnału. Tak więc zmiany w intensywności światła docierającego do detektora niosą informację o wielkości rozpraszających cząstek. Tylko w jaki sposób informację tę uzyskać z analizy zmian intensywności światła. Ponieważ cząstki poruszają się w sposób przypadkowy, zmiany w intensywności światła zawierają istotny składnik przypadkowości. Dla otrzymania użytecznej informacji należy zbadać statystyczne właściwości tych fluktuacji, uzyskane użyteczne wartości noszą nazwę funkcji korelacyjnej. Co to jest funkcja korelacyjna? Gdy popatrzymy na typowy wykres zmian w czasie sygnału charakteryzującego się dużą przypadkowością, podobnie jak to ma miejsce na wyjściu fotopowielacza w doświadczeniach PCS to zauważymy, że na skutek ruchów dyfuzyjnych cząstek sygnał zawiera wiele szumów (rys. poniżej). W typowym doświadczeniu PCS te fluktuacje zachodzą w skali mikrosekundowej co powoduje posiadanie odpowiednio szybkiej aparatury analizującej dla ich detekcji i analizy. Zmiany te, na pierwszy rzut oka wyglądają jak przypadkowe zakłócenia lecz należy zauważyć dwie rzeczy. 1) Zmiany sygnału nie następują natychmiastowo. Jeśli rozważać wartości uzyskane dla dwóch bardzo blisko położonych punktów to widać iż różnica pomiędzy nimi jest w sumie niewielka, czyli ich wartości są skorelowane. 2) Ponieważ obserwowane zmiany są przypadkowe dlatego też, gdy porównywać wartości intensywności dla dwóch odległych w skali czasowej punktów, nie stwierdzi się żadnej między nimi zależności, czyli punkty te są nieskorelowane. Tak więc analizując dwie intensywności średnio odległe w czasie (pośrednio pomiędzy sytuacjami opisanymi w pkt 1 i 2) uzyska się jakieś pośrednie wartości korelacji pomiędzy nimi. Fakt ten powoduje efekt pamięci wartości korelacji zależny od pozycji wszystkich rozpraszających światło cząstek. Jeśli 21

moglibyśmy zastosować jakąś miarę poziomu korelacji i zanalizować jej zmianę w czasie to wykres ten wyglądałby tak jak na wykresie poniżej. Wykres zaczynałby się od najwyższych wartości i opadałby wraz z upływem czasu do wartości najniższych, następowałby proces zaniku korelacji. Jak więc mierzyć ilościowo korelację i to w jaki sposób ona zanika. Dla tego celu stosowany jest następujący algorytm. Wyobraźmy sobie, że mierzyliśmy intensywność światła przez krótki czas i że zarejestrowaliśmy dwie kopie wyników, które następnie naniesiono na jeden wykres (rys. poniżej) tak aby widzieć równocześnie oba wykresy. Wszystkie maksima i minima są położone dokładnie nad sobą gdyż jeden wykres jest dokładnie nad drugim. Dla ilościowego określenia tego stopnia nakładania w całkowitym czasie pomiaru dokonuje się pomnożenia wartości intensywności uzyskanych w tym samym punkcie czasowym dla jednej krzywej przez wartości uzyskane w tym samym punkcie czasowym dla drugiej krzywej. Posługując się tym nowym zestawem danych, tak jak i poprzednie zależnym od czasu, można określić jego wielkość przez zmierzenie wielkości powierzchni pod wykresem. Proces ten nosi nazwę integracji nakładania wzdłuż osi czasu. Ponieważ maksima i minima się pokrywają to po przeprowadzeniu procedury przemnożenia a następnie integracji uzyska się względnie wysokie wartości. Reasumując, jeśli uzyskuje się w wyniku wspomnianego postępowania duże wartości to można przypuszczać iż są one wynikiem nałożenia dwóch krzywych, które posiadają minima i maksima w tych samych miejscach. Co jednak będzie, jeśli jeden z wykresów zostanie nieco przesunięty względem drugiego na osi czasu, jak przedstawiono na rysunku poniżej. Maksima i minima nie pokrywają się już tak dokładnie co spowoduje, że po przeprowadzeniu operacji mnożenia i integracji uzyska się wartości mniejsze. Przy dalszym przesunięciu obu wykresów względem 22

siebie ich nakładanie się będzie jeszcze gorsze (rys. poniżej) a uzyskane wyniki mnożenia i integracji będą jeszcze mniejsze. Kontynuując to przesuwanie obu wykresów względem siebie wzdłuż osi czasu i określając wartość integracji nakładania uzyska się coraz mniejsze wartości dążące do wartości minimalnej, stałej wyznaczanej przez sytuację kiedy nie zachodzi w ogóle nakładanie się obu wykresów. Liczba, uzyskiwana w wyniku wielokrotnego procesu mnożenie-integracja nazywana jest funkcją korelacyjną, G. Funkcja te nie jest funkcją czasu (dokonywano integracji całego zestawu danych) lecz zmienia się zależnie od wielkości przesunięcia krzywych względem siebie. To przesunięcie nazywane jest czasem korelacji. Wprawdzie jego jednostkami są jednostki czasu lecz nie jest to prawdziwy czas. Jest to raczej wielkość skali czasowej wg. której badamy korelację. Bardzo ważnym jest zrozumienie różnic pomiędzy czasem eksperymentu a czasem korelacji. Czas eksperymentu jest czasem prawdziwym i z reguły wynosi 10-100 sekund, natomiast czas korelacji jest czasem potrzebnym aby sygnał z detektora utracił z pamięci wartość poprzedniego sygnału (z reguły 10-100 mikrosekund, dla rozpraszania światła w układach koloidowych). Wartość korelacji nie zmniejsza się tak jak to ma miejsce wraz z ostępem czasu eksperymentu, bowiem zmiany rozproszonego światła zachodzą tak samo przypadkowo na początku jak i na końcu eksperymentu czyli w dowolnej chwili eksperymentu następują fluktuacje intensywności, których skala czasowa jest tego samego rzędu wielkości jak czas korelacji. Co dalej z pomiarem metodą PCS? Zetasizer 5000 W aparacie pracującym na zasadzie PCS do matematycznej analizy funkcji korelacyjnej mierzonego światła służy urządzenie zwane korelatorem. W aparacie Zetasizer korelator jest modułem wmontowanym na stałe do komputera sterującego (p. także rysunki na następnej stronie). 23

Wykazano, że funkcja korelacyjna światła rozproszonego przez zbiór monodyspersyjnych (t.j. o jednakowej wielkości) cząstek jest funkcją wykładniczą i co więcej, że czas jej zaniku jest zależny od wielkości tych cząstek. Oznacza to iż (a) cząstki dyfundują w sposób przypadkowy i tracą informację dotyczącą ich poprzedniej lokalizacji w sposób zmienny wykładniczo oraz (b) wielkość cząstek może być mierzona poprzez pomiar szybkości zaniku funkcji korelacyjnej. W praktyce te pomiary są realizowane przez korelator a przenoszone do komputera, który w oparciu o nie dokonuje odpowiednich obliczeń a o końcowym wyniku informuje eksperymentatora. Problemy rozpoczynają się w chwili gdy cząstki są o różnej wielkości, czyli w sytuacji gdy występuje ich tzw. rozkład wielkości. Każda cząstka o określonej wielkości będzie wypływać w różnym stopniu na składnik wykładniczy funkcji korelacyjnej. Widok ogólny aparatu Zetasizer wraz z komponentami Kluczowe elementy wewnętrzne aparatu Zetasizer 24

Przyjmijmy przypadek, w którym mamy do czynienia jedynie z dwoma różnymi wielkościami cząstek (rysunek na następnej stronie). Funkcja korelacyjna będzie w tym przypadku sumą dwóch funkcji wykładniczych pochodzących od cząstek obu wielkości. Istotnym jest, iż jest to również funkcja zanikająca wyglądająca przy tym podobnie do funkcji o pośredniej wartości szybkości zaniku. Tak więc mając mieszaninę cząstek 100 nm i 300 nm wielkości funkcja korelacyjna będzie bardzo zbliżona do funkcji generowanej przez cząstki 200 nm wielkości. Aby komputer potrafił jej rozróżnić dane eksperymentalne muszą być bardzo dobrej jakości i wolne od szumów i zakłóceń. Problem staje się jeszcze trudniejszy jeśli w zawiesinie występuje wielość cząstek o różnej wielkości (występuje rozkład ich wielkości) i ogromna liczba funkcji wykładniczych jest do siebie dodana. Jest to istotny problem matematyczny - w teorii, jeśli dane nie są idealne to prowadzi to do nieskończonej liczby rozwiązań problemu. Na szczęście, istnieje kilka algorytmów, których zastosowanie dostarcza prawidłowych wyników chociaż wymagana jest odpowiednia jakość próbki oraz właściwe postępowanie pomiarowe. Z tych algorytmów trzy są często używane najczęściej: 1. Metoda kumulacyjna Procedura ta próbuje znaleźć rozkład matematyczny najlepiej pasujący do danych eksperymentalnych i podaje wyniki w postaci średniej wielkości cząstek (tzw. średnica z-średnia) oraz miarę szerokości rozkładu wielkości cząstek zwaną polidyspersyjnością. Procedura ta ma zastosowanie jedynie wtedy gdy rozkład wielkości cząstek jest faktycznie Gausowski (normalny) i nie za szeroki (wartość polidyspersyjności jest mniejsza od 0.3-0.4). Procedura jest prosta ale należy pamiętać, że nadaje się przede wszystkim dla układów praktycznie monodyspersyjnych (homogennych zawiesin o jednym szczycie rozkładu wielkości cząstek). 25

2. Metoda próbkowania wykładniczego Pike-Ostrowsky Metoda ta używa transformacji Laplace a dla bezpośredniego odwrócenia funkcji korelacyjnej. Dla jej zastosowania dane eksperymentalne muszą się charakteryzować gładką i płaską linią podstawową gdyż w przeciwnym razie populacje cząstek zostaną rozdzielone nieprawidłowo. Obecnie coraz częściej zamiast tej metody stosuje się metodę CONTIN. 3. Algorytm CONTIN Jest to metoda zaliczana do standardów przemysłowych używająca techniki zwanej wymuszonym uprawidłowieniem. Metoda choć skomplikowana matematycznie, jest metodą pewną i z reguły dostarcza dobrych, zgodnych z oczekiwaniami wyników nie sugerując przy tym układów bimodalnych w sytuacji gdy rozkład monomodalny daje identyczne wyniki. Pomiar potencjału Zeta (ładunek pęcherzyka/liposomu) Stabilność zawiesiny cząstek zależy od interakcji pomiędzy nimi. Jeśli występuje pomiędzy nimi odpychanie, wtedy zawiesina nie będzie agregować i nie nastąpi proces flokulacji. W przeciwnej sytuacji, siły przyciągania spowodują sytuację, w której cząstki zaczną agregować a następnie koagulować co spowoduje ich wypadanie z "roztworu". Pomiar potencjału Zeta, który jest jednym z najlepszych parametrów opisujących proces zachowania się cząstek w zawiesinie, jest kluczowym w kontrolowaniu elektrostatycznych właściwości zawiesin. Skąd się bierze potencjał Zeta. W roztworach polarnych, takich jak roztwory wodne, większość cząstek posiada ładunek powierzchniowy. W przypadku liposomów jest to szczególnie istotne gdyż do ich tworzenia wykorzystuje się mieszaniny składników, w najprostszym przypadku fosfolipidów, istotnie różniących się stopniem zjonizowania (czyli ładunku) grup polarnych. Warstwa utworzona z takich różnorodnych elektrycznie cząsteczek będzie przyciągać lub odpychać jony ze środowiska, tj. roztworu wodnego w którym została zawieszona co spowoduje iż w jej pobliżu wytworzy się ściślej związana, przylegająca warstwa jonów. 26

Ponieważ warstwa jest obdarzona określonym ładunkiem wypadkowym, dodatnim lub ujemnym ładunek warstewki roztworu przylegającej do niej bezpośrednio będzie dodatni lub ujemny. W przypadku przedstawionym na rysunku powyżej warstwa cząsteczek posiada ładunek powierzchniowy ujemny więc przyciąga jony u ładunku dodatnim. Stężenie tych jonów zmienia się wykładniczo wraz ze wzrostem odległości od powierzchni cząstki (liposomu) i w końcu, w odpowiednio dużej odległości od powierzchni stężenie poszczególnych jonów (anionów i kationów) będzie identyczne jak w całej masie roztworu. Tak więc gdy zbliżamy się do powierzchni tej cząstki (np. liposomu) stężenie jonów dodatnich ulega zwiększeniu czyli stężenie anionów ulega zmniejszeniu, oczywiście w stosunku do ich stężenia w całej masie roztworu, gdyż aniony są w tej strefie odpychane przez ujemny ładunek powierzchniowy. Pewne z kationów z roztworu są nawet silniej wiązane przez powierzchnię wtedy gdy zbliżą się na tak małą odległość, że jej dotkną. Tworzą one tzw. warstwę Sterna. Jak daleko w głąb masy roztworu sięga więc powyższy potencjał?. Odległość tę charakteryzuje wielkość nazywana stałą Debyee-Huckel'a określana symbolem k. Równanie określające k uwzględnia takie wartości jak temperaturę, siłę jonową itp.lecz jego najbardziej użyteczną postacią jest: k = 3.288 x I x 0.5 (nm -1 ) dla roztworu wodnego przy 25 o C. Jednostkami wielkości 1 k są jednostki długości, tak więc jest zwana grubością podwójnej warstwy - jest to odległość opisująca, charakteryzująca opadanie wykładniczego gradientu potencjału zilustrowanego na poprzednim rysunku. Dla przykładu, dla siły jonowej 0,01 M, 1 k wynosi 3 nm a przy I równym 0,00001 M 1 k wynosi już 96 nm. Tak więc w słabych elektrolitach, spadek wartości potencjału trwa bardzo długo a w silnych pozostaje praktycznie w pobliżu cząstki. Efekt ten określa się jako ekranowanie ładunku cząstki. Czym jest więc potencjał Zeta? Należy pamiętać, że nie jest to potencjał powierzchni cząstki (liposomu). Potencjał Zeta jest potencjałem mierzonym przy pomocy techniki elektroforetycznej, w której cząstki migrują w przyłożonym zewnętrznie polu elektrycznym. W tych warunkach cząstki poruszają się wraz z warstwą Sterna i potencjał Zeta jest potencjałem istniejącym tuż poza tą ściśle związaną warstewką (jest ona zwana również hydrodynamiczną bądź też płaszczyzną poślizgu) i determinującym szybkość migracji. Ponieważ potencjał Zeta znajduje się w pewnej odległości od powierzchni ma on nieco mniejszą wartość od potencjału powierzchniowego. Ponieważ zawiesiny liposomów przygotowuje się w różnych roztworach elektrolitów dlatego też istotnym jest poznanie ich wpływu na wielkość potencjału Zeta. Jeśli wykreślić zależność wielkości potencjału od odległości dla różnych stężeń elektrolitu uzyska się zestaw krzywych wyglądających tak jak na rysunku poniżej. 27

Wartość potencjału zanika szybciej w silniejszym elektrolicie gdyż jego siła jonowa jest większa, czyli 1 k jest mniejsze. Tak więc wraz ze wzrostem siły jonowej, czyli stężenia elektrolitu zmniejsza się również wartość potencjału Zeta. W niskich stężeniach elektrolitu wartość potencjału Zeta jest bardzo zbliżona do wartości potencjału powierzchniowego natomiast w wysokich stężeniach elektrolitu zbliża się do zera. Zależność wartości potencjału Zeta od stężenia elektrolitu przedstawione na następnym rysunku. Przedstawione dane są wielkościami najczęściej spotykanymi dla większości znanych układów koloidalnych. Gdy zależy nam na uzyskaniu informacji o wartości potencjału powierzchniowego to należy przeprowadzić pomiary potencjału Zeta w roztworach o niskiej sile jonowej, typowo 1 mm i poniżej. Powyższe rozważania opierają się na jednym ważnym założeniu, w myśl którego jony przyciągane są do powierzchni jedynie przez oddziaływania elektrostatyczne bez jakiegokolwiek udziału wiązań chemicznych czy też zmian równowagi jonowej na powierzchni. Tego typu elektrolity ulegają nieswoistej adsorpcji. Przykładem takiego elektrolitu jest mieszanina NaCl i KNO 3 w stosunku 1:1. Jeśli wyniki uzyskanych zmian potencjału Zeta od stężenia danego elektrolitu są podobne do tych przedstawionych na poprzednim rysunku to można założyć, że elektrolit ten ulega jedynie nieswoistej adsorpcji. 28

Charakteryzowanie enkapsulacji czyli wielkości objętości solutu zamykanego (wiązanego) przez nośnik liposomowy (stosunku lipid/lek) W celu wyznaczenia poziomu objętości zamkniętej w danym preparacie pęcherzyków liposomowych należy oddzielić niezamknięty w pęcherzykach związek poprzez (najczęśćiej sączenie molekularne Sephadex lub Sepharose). Pęcherzyki, jako zdecydowanie większe będą wypływać z kolumny pierwsze a dopiero po nich może wypływać wolny (t.j. niezamknięty w nich) związek. Enkapsulację wyrażoną jako stosunek ilości lipidu do ilości leku można obliczyć w oparciu o ilościowe oznaczenie ilości lipidu w danej próbce (oznaczanie fosforu) oraz oznaczenie ilości leku (odpowiednia dla danego leku metoda - spektroskopia UV-VIS czy też fluorescencyjna, HPLC) po rozbiciu próbki liposomów przez dodanie do kilkusetmikrolitrowej próbki preparatu kilku mikrolitrów detergentu Triton X- 100. Następuje wtedy rozpuszczenie dwuwarstw na stutek solubilizacyjnego działania detergentu niejonowego i uwolnienie zawartości pęcherzyka. Należy pamiętać o tym, że obecna w pęcherzyku substancja aktywna nie musi być koniecznie zmknięta w jego przestrzeni wodnej. Równie dobrze może być silnie zasocjowana z jego zewnętrzną (lub wewnętrzną) powierzchnią. Z punktu widzenia dostarczania substancji aktywnej do miejsca docelowego nie ma to jednak praktycznego znaczenia. Czyli: liposomowe (pęcherzykowe) postacie leków obejmują zarówno leki zamknięte w dwuwarstwie lub przestrzeni wodnej pęczerzyków jak i leki dostatecznie silnie związane z ich powierzchnią, tak, że nie jest możliwe ich oddzielenie przy użyciu standardowych metod rozdziału substancji wolnej (niezamkniętej, niezasocjowanej) o zamkniętej (związanej). Skład dwuwarstwy tworzącej pęcherzyki i jej płynność Historycznie rzecz biorąc najczęściej do uzyskiwania pęcherzyków liposomowych używano przede wszystkim naturalnych lipidów, tj wydzielanych poszczególnych klas (np. PC, PS, PG, PE etc.). Z punktu widzenia zastosowania pęcherzyków liposomowych jako modele błony biologicznej takie podejście nie ma i nie miało kluczowego znaczenia. Co innego gdy rozpatrywać pęcherzyki liposomowe jako nośniki leków (substancji bioaktywnych), szczególnie takich, które mają mieć zastosowania dożylne i/lub być produkowane na skalę przemysłową (odpowiednia stabilność w czasie przechowywania n.p. w aptece). Naturalne produkty charakteryzują się, mimo identycznej główki polarnej wysoką heterogennością długości i stopnia nienasycenia łańcuchów acylowych. Dla przykładu w tabeli poniżej przedstawiono skład kwasów tłuszczowych lecytyn (fosfatydylocholin) izolowanych z żółtka jaja kurzego oraz z soi. Grupa kwasów tłuszczowych nasycone monoenowe polienowe kwasy Ay By Cy Dy Es 14:0 0 3 1 0 16:0 27 33 28 42 12 18:0 13 13 13 10 4 16:1 2 1 1 2 18:1 24 30 32 28 10 18:2 12 16 15 16 73 20:4 4 3 4 2 22:4 + 5 2 1 1 22:6 5 1 5 ślad Stosowanie naturalnych lipidów wiąże się więc z niebezpieczeństwem nieidentyczności poszczególnych serii finalnych preparatów. 29