Temat 14 i 15: Różnicowanie pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. Izolacja bakteriofagów ze ścieków Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien: umieć scharakteryzować rodzinę Enterobacteriaceae (wspólne cechy biochemiczne, przykłady rodzajów bakterii i powodowane przez nie choroby) wiedzieć, jakie cechy biochemiczne bada się podczas identyfikacji pałeczek jelitowych, wiedzieć, jakie badania wchodzą w skład szeregu izolacyjnego i szeregu IMV umieć wyizolować bakteriofagi ze ścieków Enterobacteriaceae (z gr. enteron - jelito) tworzą obszerną rodzinę pałeczek występujących głównie w jelicie człowieka i zwierząt. Z tego powodu często określa się je mianem pałeczek jelitowych. Są to średniej wielkości gramujemne pałeczki, nieprzetrwalnikujące, ruchliwe lub nieruchliwe, posiadające otoczki lub bezotoczkowe, rosnące na zwykłych podłożach. Ich wspólnymi cechami biochemicznymi są: szybka fermentacja glukozy (także w warunkach beztlenowych) redukcja azotanów do azotynów, ujemna reakcja na oksydazę cytochromową. Prawie wszystkie pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzają katalazę (enzym rozkładający H2O2). W kwasie DNA tych bakterii suma cząsteczek guaniny i cytozyny (G+C) wynosi 39-59%. Granice między poszczególnymi rodzajami nie są ostre, spotyka się liczne formy przejściowe. Dlatego klasyfikacja tej rodziny nie jest jeszcze ostatecznie ustalona. Zgodnie z klasyfikacją podaną przez Bergeys Manual of Determinative Bacteriology rodzinę Enterobacteriaceae dzielimy na 5 trybów: Tryb I Escherichieae obejmuje rodzaje: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigiella Tryb II - Klebsielleae - obejmuje rodzaje: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia Tryb III Proteae - obejmuje rodzaj Proteus Tryb IV Yersinieae - obejmuje rodzaj Yersinia
Tryb V - Erwinieae - obejmuje rodzaj Erwinia. Podział na tryby oparto głównie na podobieństwie składu DNA, które jest wyrazem pokrewieństwa mikroorganizmów. Część pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae powoduje zakażenia przewodu pokarmowego (Shigella wywołująca czerwonkę, czy Salmonella powodująca dur brzuszny lub tzw. salmonellozy, czyli zatrucia pokarmowe), inne zaliczamy do względnie chorobotwórczych lub komensali (mikroorganizmów w zasadzie niechorobotwórczych, które zazwyczaj współżyją z organizmem gospodarza). Jednak przeniknięcie niektórych komensali do miejsc w organizmie, w których normalnie nie występują, może stać się przyczyną niebezpiecznych zakażeń. Szczepy Klebsiella pneumonieae, Escherichia coli (pałeczki okrężnicy), Proteus sp. i inne, mogą spowodować trudne do wyleczenia zakażenia dróg moczowych, oddechowych, posocznice u wcześniaków i noworodków. Jako że dla większości pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae naturalnym miejscem bytowania jest przewód pokarmowy człowieka i zwierząt, ich obecność w innych miejscach, np. w wodzie, glebie, czy w produktach żywnościowych traktowana jest jako wskaźnik bezpośredniego lub pośredniego zanieczyszczenia fekalnego (kałowego). Przykładem może tu być szerokie stosowanie pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) w ocenie stanu sanitarnego wody. Pałeczki Enterobacteriaceae, poza nielicznymi wyjątkami, nie wykazują większych różnic morfologicznych komórek lub kolonii, umożliwiających odróżnienie rodzajów i gatunków. Różnicowanie w ich obrębie oparte jest głównie na określeniu właściwości biochemicznych badanego szczepu. Analizie takiej poddaje się szczepy bakterii wyizolowane z badanego materiału na podłożach wybiórczo-namnażających (SF, Levin, Mc Conkey, SS, Wilson - Blair). Kryterium zaliczenia pałeczek do określonego rodzaju stanowi zespół właściwości biochemicznych, takich jak: wytwarzanie niektórych metabolitów (indol, H2S), rozkład cukrów i alkoholi (laktoza, mannitol, dulcytol), rozkład aminokwasów (deaminacja, dekarboksylacja), przemiany pewnych związków (mocznik, malonian), aktywność niektórych enzymów (oksydaza, katalaza).
Diagnostykę bakterii z rodziny Enterobacteriaceae poprzedza wykonanie oznaczeń potwierdzających zdolność wyizolowanych szczepów do: wytwarzania oksydazy, fermentacji glukozy i redukcji azotanów. Następnie należy przystąpić do bezpośredniej identyfikacji bakterii do rodzaju i gatunku, na podstawie schematów biochemicznych. Badania przeprowadza się etapami. Pierwszy z nich polega na wykonaniu tzw. szeregu izolacyjnego. Składa się on z czterech podłoży diagnostycznych: 1. wody peptonowej z tryptofanem, 2. podłoża Kliglera, 3. laktozy 10% pod parafiną, 4. podłoża z mocznikiem. Wzrost bakterii na tych podłożach pozwala na ocenę następujących właściwości: 1. wytwarzania indolu z tryptofanu, 2. zdolności do wytwarzania siarkowodoru (H2S), 3. wytwarzania gazu przy fermentacji węglowodanów, 4. rozkładu laktozy i mocznika. Wyniki tych badań są podstawą do zastosowania odpowiedniego szeregu różnicującego w drugim etapie badań. Etap trzeci, tzw. testy potwierdzające, wykonywany jest tylko w przypadkach wątpliwych, w których nie jest możliwe określenie przynależności taksonomicznej badanego szczepu na podstawie uprzednio przeprowadzonych badań. Klasyczna diagnostyka drobnoustrojów wymaga zgromadzenia bardzo wielu danych. Jest to praca żmudna, długotrwała i wymagająca zastosowania wielu podłóż i odczynników. Jest to więc badanie drogie. Dlatego w praktyce stosuje się szereg mikrometod ułatwiających i przyśpieszających identyfikację. Metody takie zostały m.in. opracowane dla bakterii będących wskaźnikami stanu sanitarnego, np. szybka identyfikacja pałeczki okrężnicy (Escherichia coli) spośród bakterii grupy coli typu kałowego możliwa jest dzięki tzw. testowi (szeregowi) IMVC. Skrót ten oznacza następujące cztery badania:
I badanie zdolności do wytwarzania indolu z tryptofanu, M reakcja z czerwienią metylową (tzw. odczynnik MR), która przyjmuje czerwone zabarwienie przy zakwaszeniu podłoża Clarca w wyniku rozkładu glukozy, V - badanie zdolności do wytwarzania acetylometylokarbinolu (acetoiny) z glukozy na podłożu Clarca (tzw. reakcja Vogesa-Proskauera), C - badanie zdolności do wykorzystywania cytrynianu jako jedynego źródła węgla. Typowe szczepy Escherichia coli wytwarzają indol z tryptofanu, rozkładają glukozę z wytworzeniem kwasu, nie wytwarzają acetylometylokarbinolu i nie potrafią korzystać z cytrynianu jako jedynego źródła węgla, a więc w teście IMVC dają wynik: ++. Wyjątkowo zdarzają się szczepy E. coli indoloujemne i w tedy wynik szeregu IMVC będzie miał postać: +. Według szeregu IMVC identyfikuje się w sposób pewny tylko te bakterie z grupy coli, u których wcześniej stwierdzono, że fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temperaturze 44 0 C. Ważną rolę w badaniach taksonomicznych odgrywa szybkość oznaczenia właściwości biochemicznych drobnoustrojów. Powoduje to tendencję do maksymalnego upraszczania i ograniczania czynności w trakcie diagnostyki. Przykładem tych uproszczeń może być zestaw podłoży Pathotec paper strips oraz Enterotube. Zestaw Pathotec zawiera paski bibuły nasycone odpowiednimi reagentami. Użycie ich pozwala w ciągu kilku godzin oznaczyć takie właściwości szczepu, jak: redukcja azotanów, deaminacja fenyloalaniny, wytwarzanie ureazy, siarkowodoru, dekarboksylacja lizyny, rozkładanie malonianu sodowego i eskuliny. Zestaw Enterotube zawiera w jednej plastikowej probówce (ang. tube rurka, probówka) 8 podłoży pozwalających na jednoczesne określenie 11 cech biochemicznych: rozkład glukozy do kwasu i gazu, rozkład laktozy, dulcytolu, deaminacja fenyloalaniny, dekarboksylacja lizyny i ornityny, wytwarzanie siarkowodoru, indolu, rozkład mocznika oraz zdolność wykorzystania cytrynianu jako jedynego źródła węgla. Dodatkową zaletą omawianego zestawu jest łatwość i szybkość posiewu (jednorazowe przeciągnięcie ezy przez wszystkie podłoża) oraz możliwość odczytania wyników nawet przez pomocniczy personel, w oparciu o zamieszczone schematy barwne. W Polsce produkowany jest zestaw pod nazwą Enteroplast. Są to plastikowe płytki ze studzienkami zawierającymi bezwodne podłoża z substratami różnicującymi. Pozwalają one na oznaczenie 10 cech biochemicznych na podstawie pojawienia się określonego zabarwienia
podłoża. Do studzienek wprowadza się zawiesinę badanego szczepu bakterii i poddaje inkubacji w temp. 37 0 C przez 24 godz. W studzienkach bada się następujące reakcje: Fermentacja cukrów. W pięciu studzienkach znajdują się cukry: glukoza, sacharoza, laktoza, rafinoza i mannitol (alkoholowa pochodna glukozy). Jeśli bakterie fermentują dany cukier z wydzieleniem kwasu, to podłoże przyjmuje zabarwienie żółte, z powodu zmiany zabarwienia wskaźnika ph obecnego w studzienkach, reagującego na obniżenie odczynu, Aktywność ureazowa. Aktywność urazowa polega na hydrolizie mocznika z wydzieleniem amoniaku. Jako że amoniak w środowisku wodnym ma odczyn alkaliczny, obecny w podłożu odpowiedni wskaźnik ph zmienia zabarwienie na czerwone jeżeli dojdzie do hydrolizy mocznika. Wytwarzanie siarkowodoru w wyniku redukcji siarczynów. W przypadku powstawania siarkowodoru, reaguje on z obecnymi w podłożu kationami żelaza dając czarny osad siarczku żelaza. Deaminacja fenyloalaniny. Reakcja ta polega na odłączeniu grupy aminowej (deaminacji) od aminokwasu fenyloalaniny. W efekcie powstaje kwas fenylopirogronowy, który z chlorkiem żelazowym FeCl3, dodawanym po inkubacji, daje związek o zabarwieniu zielonym. Powstawanie indolu z tryptofanu. Przekształcenie aminokwasu tryptofanu w indol, wykrywa się przez dodanie do studzienki, po okresie inkubacji, odczynnika Kovacsa. Powstanie różowego zabarwienia świadczy o wyniku dodatnim. Jest to jedna z reakcji (I) z szeregu IMVC. Wzrost na podłożu z cytrynianem jako jedynym źródle węgla. Bakterie zdolne do wzrostu na tym podłożu rozkładają cytrynian, czemu towarzyszy alkalizacja. Obecny w pożywce wskaźnik ph zmienia wówczas barwę na niebieską. Jest to jedna z reakcji (C) z szeregu IMVC. Beztlenowa dekarboksylacja lizyny. Reakcja ta polega na odłączeniu grupy karboksylowej (dekarboksylacji) od aminokwasu lizyny. Przemiana zachodzi w warunkach beztlenowych, stworzonych przez zalanie studzienki sterylną parafiną. W efekcie powstają aminy, które alkalizują podłoże zmieniając jego zabarwienie na fioletowe.
Kwaśna fermentacja glukozy. W studzience znajduje się podłoże Clarca z glukozą. Jeżeli badana bakteria rozkłada glukozę z wytworzeniem kwasu, dojdzie do obniżenia odczynu do ph < 4,5. Po dodaniu czerwieni metylowej podłoże zmieni zabarwienie na czerwone. Jest to jedna z reakcji (M) z szeregu IMVC. Na podstawie uzyskanych reakcji barwnych określa się rodzaj bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, korzystając z dołączonych tabel. Oznaczanie podstawowych cech biochemicznych w tego typu testach pozwala tylko na przybliżoną identyfikację szczepu. Precyzyjne określenie przynależności gatunkowej możliwe jest dopiero po rozszerzonym badaniu biochemicznym i serologicznym (z zastosowaniem specyficznych przeciwciał). Część praktyczna Zadanie 1: Identyfikacja gatunków pałeczek jelitowych na podstawie wybranych testów biochemicznych Określić gatunek (rodzaj) badanej bakterii korzystając z tabel identyfikacyjnych, na podstawie wyników reakcji Vogesa-Proskauera, odczynu MR, próby na indol i in., oraz obserwacji wzrostu bakterii na wybranych pożywkach (m. in. podłoża z: cytrynianem sodu, laktozą i mocznikiem) Zadanie 2: Izolacja bakteriofagów ze ścieków miejskich Ścieki zostały pobrane z Wrocławskiej Oczyszczalni Ścieków Janówek. Do 40 ml ścieków dodano 5 ml zagęszczonego bulionu i 5ml bakterii E. coli. Po 24 godz. inkubacji w 37 0 C (na wytrząsarce) hodowlę ściekową odwirowano na wirówce, przy 2 000 obr./min (RPM) Uzyskany płyn nadosadowy (supernatant) posłuży jako źródło bakteriofagów do doświadczenia.
Wykonanie ciągu rozcieńczeń zawiesiny fagów w buforze PBS a. ustawić w statywie 6 sterylnych probówek Eppendorfa (tzw. eppendorfek) i ponumerować je (1-6) b. do każdej probówki dodać 0,9 ml (900 l) buforu PBS, c. dobrze wymieszać zawiesinę bakteriofagów, d. do pierwszej eppendorfki przenieść 0,1 ml (100 l) wyjściowej zawiesiny fagów, zamknąć probówkę i kilkakrotnie wymieszać wykonując obroty w górę i w dół, e. przenieść 0,1 ml zawiesiny z probówki 1 do probówki 2 i wymieszać f. postępując podobnie, wykonać kolejne rozcieńczenia zawiesiny fagów w pozostałych probówkach Eppendorfa Posiew mieszaniny fagów z bakteriami na pożywkę agarową a. ustawić w drugim statywie 6 sterylnych probówek Eppendorfa i ponumerować je (1-6), b. do każdej probówki dodać 0,5 ml zawiesiny bakterii E. coli pochodzącej z hodowli bulionowej w fazie logarytmicznej, c. następnie, do każdej probówki z bakteriami dodać 0,1 ml odpowiedniego rozcieńczenia zawiesiny fagów z ciągu rozcieńczeń, zaczynając od rozcieńczenia 6 (z rozcieńczenia 6 do probówki 6, z rozcieńczenia 5 do probówki 5, itd.), d. następnie zamknąć probówki i wymieszać ich zawartość przekręcając je kilkakrotnie w górę i w dół, e. inkubować przez 10 min. w 37 0 C, aby umożliwić fagom adsorpcję do komórek bakterii, f. w tym czasie ponumerować 6 szalek Petriego z agarem odżywczym (1-6) i sześć dużych szklanych probówek (1-6) ustawionych w trzecim statywie,
g. po inkubacji mieszaniny fagów i bakterii, do każdej z 6 dużych szklanych probówek dodać : 3 ml ciepłego Top-agaru (z kolby przechowywanej w cieplarce) i zawartość odpowiednich eppendorfek (bakterie + rozcieńczenie zawiesiny fagów) (zawartość eppendofki 6 do probówki 6, 5 do 5, itd.), a następnie wymieszać zawartość probówki i wylać ją na powierzchnię odpowiedniej szalki z agarem (z probówki 1 na szalkę 1, z probówki 2 na szalkę 2, itd.) delikatnie przechylając szalkę, aby dobrze rozprowadzić agar z bakteriami i fagami, h. odczekać do zastygnięcia agaru i. Inkubować w temp. 37 0 C przez 24 godz. Wykonanie posiewu kontrolnego (bez fagów) a. do jednej dużej probówki szklanej dodać 0,5 ml hodowli bakteryjnej oraz 3 ml Topagaru, i wymieszać. b. posiać rozlewając agar z samymi bakteriami na powierzchni zestalonego agaru, jak w pkt. 2g. Po inkubacji obejrzeć hodowle. W miejscach namnażania się bakteriofagów, powinny być widoczne charakterystyczne łysinki, czyli odbarwienia w warstwie bakterii porastających powierzchnię agaru. Porównać ze wzrostem bakterii w próbie kontrolnej (bakterie bez bakteriofagów). Policzyć łysinki i obliczyć zagęszczenie fagów w ściekach. Wyniki podać w PFU/ml ścieków. PFU (pfu) jednostka tworząca łysinkę (ang. plaque forming unit).