Biologia II rok 2015/2016

Transkrypt

1 Ćwiczenie 6 Temat: Metabolizm bakterii: Właściwości glikolityczne, lipolityczne, proteolityczne i oksydo-redukcyjne odczyt. Kontrola populacji bakteryjnej: wpływ czynników fizycznych i chemicznych na drobnoustroje posiew. ODCZYT cz II: 1. Sprawdzić właściwości glikolityczne bakterii: a) wykorzystywanie cukrów przez badane bakterie: zmiana barwy wskaźnika z zielonej na żółtą świadczy o wykorzystaniu badanego cukru. Fot. 1. Wykorzystanie testowanych cukrów przez E.coli (po lewej) i P.fluorescens. b) opisać wzrost E. coli i P. fluorescens na podłożu Endo: podłoże Endo jest podłożem różnicującym, zawierającym laktozę, jako źródło węgla, fuksynę zasadową i siarczyn sodowy redukujący fuksynę do bezbarwnej leukozasady. Po okresie inkubacji niektóre drobnoustroje fermentują laktozę z wytworzeniem aldehydu octowego, który z obecną leukozasadą tworzy barwny kompleks. Kolonie E.coliprzybierają ciemno-czerwone zabarwienie z metalicznym połyskiem, co jest wynikiem rozkładu laktozy przez te pałeczki. KATEDRA MIKROBIOLOGII UŚ W KATOWICACH 1

2 Fot. 2. Wzrost E.coli (po lewej) i P. fluorescens (po prawej) na podłożu Endo. c) odczytać wzrost badanych szczepów na podłożu Hugh-Leifsona. 1. Bakterie niezdolne do rozkładu cukru nie zmieniają barwy podłoża. 2. Bakterie wykorzystujące cukier w warunkach tlenowych zmieniają barwępodłoża tylko w probówce bez parafiny. 3. Bakterie utleniające i fermentujące cukier powodują zmianę zabarwienia z zielonej na żółtą (zakwaszenie podłoża) w obu probówkach. d) Próby VP i MR są stosowane do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaeae, które prowadzą rozkład glukozy z wytworzeniem wielu produktów pośrednich. W zależności od gatunku bakterii są one wytwarzane w różnych stosunkach ilościowych. Dlatego, wyróżniamy dwa typy fermentacji. W pierwszym przypadku powstają głównie kwasy organiczne (m. in. acetoina). Jest to typ fermentacji charakterystyczny dla E. coli, dodatni wynik MR. W drugim, przeważa produkcja 2,3 butanodiolu. Charakterystyczny dla Enterobacter sp. Dodatni wynik VP. KATEDRA MIKROBIOLOGII UŚ W KATOWICACH 2

3 wykonać próbę MR [MR methyl red] sprawdzenie stopnia zakwaszenia podłoża (określenie typu fermentacji): Do hodowli dodać kilka kropli roztworu czerwieni metylowej. Jeśli ph jest niższe niż 4,5 pożywka zabarwia się na czerwono (odczyn MR dodatni), jeżeli ph jest wyższe niż 4,5 barwa podłoża pozostanie żółta (odczyn MR ujemny). Wskaźnik czerwieni metylowej pozwala na wykrycie końcowych produktów rozkładu glukozy takich jak kwas mlekowy, kwas octowy, kwas mrówkowy i inne kwasy. Powoduje to zakwaszenie podłoża a tym samym pojawienie się dodatniego odczynu MR. wykonać próbę VP (odczyn Voges-Proskauera) sprawdzenie wytwarzania acetoiny. Do hodowli dodać 0,6 ml 6% roztworu -naftolu, 0,4 ml 40% wodnego roztworu KOH. Probówkę parokrotnie wstrząsnąć i umieścić na 30 minut w łaźni wodnej w temp. 37 o C. Czerwone lub wyraźnie różowe zabarwienie w górnej części podłoża świadczy o wytwarzaniu acetoinyprekursora 2,3 butanodiolu(odczyn dodatni). e) opisać zmiany obserwowane na podłożu Kliglera. Podłoże Kliglera jest głównie używane do orientacyjnej identyfikacji pałeczek jelitowych (Enterobacteriaceae). Jest również stosowany do odróżnienia Enterobacteriaceaeod innych bakterii Gram-ujemnych. Pozwala ono na wykrycie fermentacji glukozy, laktozy, jak również wytwarzania siarkowodoru (H 2 S) i gazu. Zawiera pepton, laktozę, glukozę oraz siarczek żelaza, siarczan amonu lub tiosiarczanu sodu. Wskaźnikiem ph jest czerwień fenolowa. W zależności od ph następuje zmiana barwy podłoża - w ph poniżej 6,4 na kolor żółty (zakwaszenie), w ph powyżej 8,2 na czerwony (alkalizacja). 1. Niezmieniona barwa podłoża oznacza brak fermentacji obu cukrów. 2. Żółty skos i żółty słupek (zakwaszenie podłoża) oznacza fermentację laktozy i glukozy. 3. Powstawanie baniek gazu wewnątrz podłoża (niekiedy jego rozerwanie), wskazuje na wytwarzanie gazu. 4. Czerwony skos i żółty słupek oznacza fermentację glukozy i brak fermentacji laktozy. Początkowo rozkładana jest glukoza - dochodzi do zakwaszenia podłoża (żółta barwa). KATEDRA MIKROBIOLOGII UŚ W KATOWICACH 3

4 Następnie, rozkładane są aminokwasy zawarte w peptonie alkalizując środowisko czerwone zabarwienie skosu. 5. Zaczernienie podłoża oznacza wytwarzanie siarkowodoru. 2. Sprawdzić wytwarzanie przez badane szczepy enzymów lipolitycznych. Powierzchnię podłoża z tłuszczem (po okresie inkubacji) zalać roztworem CuSO 4.Powstanie barwnego (szmaragdowego) kompleksu w pobliżu wzrostu bakterii świadczy o rozkładzie tłuszczu. Fot. 4. Rozkład tłuszczów na płytce posianej B.subtilis. 3. Zbadać właściwości proteolityczne wybranych bakterii: a) sprawdzić wytwarzanie przez badane szczepy enzymów proteolitycznych. Powierzchnię podłoża Fraziera zalać roztworem HgCl 2 w HCl. Wokół kolonii rozkładających żelatynę powstaje strefa przejaśnienia. Wynik dodatni. b) wytwarzanie indolu z tryptofanu: Tryptofan jest aminokwasem, który znajduje się prawie we wszystkich białkach. Bakterie wytwarzające enzym tryptofanazę są zdolne do hydrolizy tryptofanu z wytworzeniem indolu, który gromadzony jest w podłożu. Aby go wykryć na podłoże nawarstwiamy odczynnik Kovácsa (p-dimetyloaminobenzaldehyd w alkoholu amylowym i stężonym HCl). Pojawienie się w ciągu kilku minut ciemnowiśniowego pierścienia świadczy o obecności indolu w podłożu. Bakterie: Tryptofan indol + kwas pirogronowy + amoniak Reakcja z odczynnikiem Kovácsa: Indol + p-dwumetyloaminobenzaldehyd Odczynnik Kovácsa HCl + alkohol amylowy czerwony pierścień KATEDRA MIKROBIOLOGII UŚ W KATOWICACH 4

5 c) dekarboksylacja aminokwasów: zdolność bakterii do dekarboksylacji aminokwasów w warunkach beztlenowych bada się na podłożu Falkowa zawierającym aminokwas (substrat), glukozę oraz purpurę bromokrezolową (wskaźnik). Po inkubacji oceniamy wzrost i zmianę barwy w probówce bez aminokwasu (kontrola) i z aminokwasem. A. Wykorzystanie glukozy prowadzi do zakwaszenia podłoża, co objawia się zmianą barwy z fioletowej na żółtą, zaś wtórna alkalizacja zachodząca w wyniku dekarboksylacji aminokwasów przywraca pożywce A B barwę wyjściową (fioletową). Wystąpienie fioletowej barwy podłoża z aminokwasem i żółtej w probówce kontrolnej świadczy o wyniku dodatnim. B. W przypadku reakcji ujemnej obydwie probówki pozostają żółte. d) deaminacja fenyloalaniny: na powierzchnię hodowli bakterii (na podłożu z fenyloalaniną) nanieść 10% roztwór chlorku żelazowego. W przypadku wytworzenia przez bakterie kwasu fenylo-pirogronowego, pojawia się zielone zabarwienie. KATEDRA MIKROBIOLOGII UŚ W KATOWICACH 5

6 Tabela1. Właściwości biochemiczne niektórych gatunków bakterii. Bakterie Szereg cukrowy Podłoża identyfikacyjne E. coli P. fluorescens B. subtilis Glc Mal Lac Sac Man H-L tlen. H-L beztl. MR VP Kligler Tł. Biał. Trypt. Liz. Fenyl. Objaśnienia: (+) - wynik dodatni, (-) - wynik ujemny 6. Glc - glukoza, Mal - maltoza, Lac - laktoza, Sac - sacharoza, Man - mannitol, H-L - podłoże Hugh-Leifsona KATEDRA MIKROBIOLOGII UŚ W KATOWICACH

7 Temat: Kontrola populacji bakteryjnej: Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na drobnoustroje. Posiew. I. CZĘŚĆ TEORETYCZNA: 1. Mechanizm działania światła widzialnego oraz promieniowania UV na bakterie. Pojęcia: fotodynamiczne uczulenie i fotoreaktywacja. 2. Wpływ temperatury, napięcia powierzchniowego, ciśnienia osmotycznego, stężenia jonów wodorowych i jonów metali ciężkich na mikroorganizmy. 3. Punkt i czas śmierci cieplnej. Literatura: 1. Różalski A Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Wyd. U. Łódzkiego, Łódź. 2. Kunicki-Goldfinger W Życie bakterii. WN PWN, Warszawa. 3. Temat 9 pt. Wpływ czynników środowiskowych na mikroorganizmy kursu e- learningowego Mikrobiologia środowiskowa dostępny na platformie uniwersyteckiej UŚ pod adresem: 4. Schlegel H Mikrobiologia ogólna. WN PWN, Warszawa. II. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA: A. Wpływ czynników fizycznych: 1. Wpływ podwyższonej temperatury: - Zaszczepić po 2 probówki zawierające płynną pożywkę bulionową odpowiednio szczepem Escherichia coli ibacillussubtilis. - Jedną probówkę zaszczepioną bakteriami Escherichia coli i jedną probówkę posianą Bacillussubtilis umieścić w łaźni wodnej i pasteryzować w temp. 80 o C przez 15 min., - Inkubację wszystkich 4 probówek z zaszczepionymi pożywkami przeprowadzić w cieplarce w temp. 37 o C. 2. Wpływ ciśnienia osmotycznego: - Posiać Escherichia coli i Saccharomycescerevisiae na płynną pożywkę uniwersalną, w której zróżnicowano ciśnienie osmotyczne przez dodatek 0%, 1%, 10%, 20% i 50% glukozy. - Probówki inkubować w temp. 37 o C dla E.coli i w temp. 28 o C dla drożdży. KATEDRA MIKROBIOLOGII UŚ W KATOWICACH 7

8 3. Wpływ napięcia powierzchniowego: Po jednej probówki z płynną pożywką bulionową dodać 1 ml detergentu celem silnego obniżenia napięcia powierzchniowego, drugą pozostawić jako kontrolę. Obie probówki zaszczepić hodowlą Escherichia coli lubbacillussubtilis. Inkubować w temp. 37 o C. 4. Wpływ promieniowania: - Przygotować krążki z tektury o średnicy szalki Petriego. Wyciąć dowolny szablon. Wysterylizować przez 15 minut pod lampą UV. - Wykonać posiew mazany na płytkach z bulionem agarowym - wysiać po 0,1cm 3 zawiesiny komórek Escherichia coli lub Bacillus subtilis. - Na posianą płytkę nałożyć jałowy szablon i naświetlać promieniami UV przez 10 minut, po czym przy pomocy jałowej pęsety zdjąć szablon i odłożyć do materiałów przeznaczonych do sterylizacji. - Płytki zamknąć i inkubować w 37 o C. UWAGA! Wszystkie czynności przy naświetlaniu należy wykonywać w rękawiczkach i w ciemnych okularach ochronnych. Nie należy kierować wzroku na źródło promieniowania a także na promienie odbite. B. Wpływ czynników chemicznych: 1. Wpływ stężenia jonów wodorowych: - Posiać Escherichia coli i Aspergillus niger na pożywki bulionowe o wartości ph = 4, 7 i Hodowle inkubować w temp. 28 o C - Aspergillus niger i w temp. 37 o C - E. coli. 2. Wpływ związków metali ciężkich: - Wykonać posiew mazany - na 2 płytkach agarowych po 0,1 ml zawiesiny komórek Escherichia coli lubbacillussubtilis. - Na środku płytek umieścić krążki bibuły nasycone związkami Cu, Zn, Cr, Cd - Płytki inkubować w temp. 37 o C. KATEDRA MIKROBIOLOGII UŚ W KATOWICACH 8

9 3. Bakteriobójcze działanie czosnku: Czosnek od kilku tysięcy lat cieszy się sławą jako przyprawa i środek leczniczy. Skład chemiczny czosnkuobejmuje m. in. lotne związki siarkowe, olejki eteryczne, błonnik, cukry, witaminy a także organiczne związki siarki, takie jak alliina i skordynina A i B. Po przekrojeniu lub rozgnieceniu ząbków czosnku,alliina ulega rozpadowi enzymatycznemu do allicyny, związku o charakterze silnego fitoncydu oraz kwasu pirogronowego i amoniaku. Związki siarkowe zawarte w czosnku działają silnie bakteriobójczo, m. in. w walce z bakteriami jelitowymi, bakteriami z rodzajustreptococcusoraz grzybami Candida albicans. Sposób postępowania: Na 3 płytkachpetriegowykonać posiew mazany 0,1 ml płynnej hodowli bakterii Escherichia coli. a) Świeże trzy ząbki czosnku obrać i rozetrzeć w moździerzu zmacerowany czosnek, przenieść na wieczko jednej z płytekpetriego. wieczko nakryć denkiem z pożywką i uszczelnić parafilmem, nie odwracając płytki wieczkiem do góry (Rys. 1). Rys. 1.Sposób przygotowania płytki ze zmacerowanym czosnkiem.płytki nie odwracać wieczkiem do góry. b) na drugiej z posianych płytek wykonać kilka odcisków przekrojonego na połowę, obranego ząbku czosnku. Płytki nie parafilmować. c) trzecią z posianych płytek pozostawić jako próbę kontrolną, bez dodatku czosnku. KATEDRA MIKROBIOLOGII UŚ W KATOWICACH 9