ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW ANALITYKI

ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej Wydziału Farmaceutycznego ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW ANALITYKI CZĘŚĆ I POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK Łódź 2014 1

AUTORZY: Bożena Dudkiewicz Anna Kwaszewska Paweł Lisiecki Maria Sobiś-Glinkowska Magdalena Szemraj Eligia M. Szewczyk ISBN: 978-83-64344-03-9 Wydanie drugie zmienione 2

Spis treści: Rozdział 1 Morfologia komórki bakteryjnej.5 Rozdział 2 Pożywki do hodowli bakterii....23 Rozdział 3 Otrzymywanie czystych hodowli, ocena morfologii wzrostu bakterii...31 Rozdział 4 Wymagania wzrostowe bakterii...41 Rozdział 5 Wykorzystanie cech biochemicznych dla identyfikacja bakterii 51 Rozdział 6 Liczenie bakterii 75 Rozdział 7 Indukcja mutacji, wykrywanie mutagenów, przekazywanie plazmidów. 87 Rozdział 8 Oddziaływanie na bakterie w środowisku. Dezynfekcja i antyseptyka 99 Rozdział 9 Sterylizacja. 115 Rozdział 10 Bakterie w lekach i żywności kontrola czystości mikrobiologicznej. 125 3

4

Rozdział 1 Morfologia komórki bakteryjnej Część teoretyczna Bakterie to organizmy prokariotyczne. Cechą charakterystyczną komórek bakteryjnych jest brak jądra otoczonego błoną jądrową i jąderka. Ich materiał genetyczny w formie nukleoidu, będącego podwójną nicią DNA styka się bezpośrednio z cytoplazmą. Nie posiadają one również dobrze wykształconych organelli komórkowych i układu błon wewnętrznych, takich jak retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego, lizosomy, mitochondria. Bakterie (poza mikoplazmami) mają ścianę komórkową, membranę cytoplazmatyczną, a w cytoplazmie zawieszone są rybosomy. Niektóre gatunki wytwarzają otoczki, przetrwalniki, fimbrie, ziarnistości zapasowe, a zdolność ruchu zawdzięczają rzęskom lub włóknu osiowemu. Z punktu widzenia diagnostyki najistotniejsze są te cechy morfologii komórek bakterii, które można uwidocznić prostymi metodami w mikroskopie świetlnym. Mikroskop elektronowy w laboratorium szpitalnym nie jest przydatny. Cechy morfologiczne komórek bakterii ważne dla ich identyfikacji to: kształt komórek i ich charakterystyczne dla rodzaju czy gatunku układy popodziałowe; budowa ściany komórkowej warunkująca różnicowe barwienie metodą Grama; otoczka; przetrwalniki; ziarnistości zapasowe; zdolność ruchu. 5

Wielkość, kształt i układy popodziałowe Bakterie wykazują znaczną rozpiętość wymiarów. Wymiar większości komórek bakteryjnych wynosi od 1 µm do 10 µm. Rozmiar najmniejszych wynosi od 0,15 µm do 0,2 µm, co jest na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego. Wymiar największych wynosi od 250 µm do 600 µm. Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5 µm, a średnica 1-2 µm. Wyróżniamy następujące kształty komórek bakteryjnych: kulisty, cylindryczny i spiralny. Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstanie układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów komórek w trakcie rozmnażania oraz brakiem ich rozdziałów po podziale. Wśród bakterii kulistych wyróżniamy następujące układy popodziałowe: dwoinki (np. dwoinki zapalenia płuc) komórki po podziale pozostają po dwie, ziarniaki czworacze (Tetracocus) komórki dzielą się w dwóch płaszczyznach, pakietowce (Sarcina) komórki dzielą się w trzech płaszczyznach do siebie prostopadłych tworząc sześcianki, paciorkowce (Streptococcus) komórki układają się w krótsze lub dłuższe łańcuszki, gronkowce (Staphylococcus) komórki mogą się dzielić w dwóch lub trzech płaszczyznach, tworząc skupiska przypominające kiście winogron. Do form cylindrycznych bakterii zaliczamy: pałeczki (np. Pseudomonas), laseczki (np. Bacillus), maczugowce (Corynebacterium), prątki (Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Niektóre formy bakterii cylindrycznych mogą tworzyć charakterystyczne układy przestrzenne: dwoinki, krótsze lub dłuższe łańcuszki, palisady, ugrupowania w kształcie liter V, X, Y. Do form spiralnych bakterii zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki 6

(np. Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się miedzy sobą liczbą skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów. Niektóre gatunki bakterii wykazują tendencję do różnorodności morfologicznej i wielokształtności komórek. Ich komórki mogą różnić się wielkością i kształtem. Obok form kulistych mogą występować formy cylindryczne i odwrotnie. Zjawisko to nazywamy polimorfizmem. Kształt i układy podpodziałowe bakterii możemy zaobserwować w preparatach przyżyciowych (np. w mikroskopie kontrastowo-fazowym lub w ciemnym polu widzenia, a nawet w zwykłym mikroskopie świetlnym), a także w preparatach utrwalonych, barwionych. Ściana komórkowa Ściana komórkowa wszystkich bakterii zawiera peptydoglikan (mureina), który styka się bezpośrednio z błoną cytoplazmatyczną. Składa się on z łańcuchów wielocukrowych, połączonych poprzecznie peptydami. Tworzy się w ten sposób charakterystyczne usieciowanie peptydoglikanu. Peptydoglikanu jest składnikiem ściany komórkowej wszystkich tworzących ją bakterii. Ściana komórkowa jednych bakterii (gramdodatnich) jest stosunkowo gruba i względnie jednorodna. Zawiera kilkadziesiąt warstw peptydoglikanu, co może stanowić 90% suchej masy ściany. W ich ścianie występują ponadto kwasy tejchojowe, lipotejchojowe i białka. Ściana innych bakterii (gramujemnych) jest cienka i ma budowę wielowarstwową. Jedną do trzech warstw peptydoglikanu, który stanowi tylko 10% suchej masy ściany, pokrywa dominujący u nich element - błona zewnętrzna. Peptydoglikan oddzielony jest od błony zewnętrznej przestrzenią peryplazmatyczną. Błona zewnętrzna stanowi warstwę plastyczną ściany komórkowej; zbudowana jest z fosfolipidów, białek, lipoproteiny Brauna oraz lipopolisacharydu (LPS). Różnice w budowie ściany komórkowej bakterii są przyczyną różnego ich barwienia w metodzie opracowanej przez Grama. Stało się to podstawą do bardzo przydatnego w identyfikacji, a tym samym diagnostyce, podziału bakterii na gramdodatnie i gramujemne. 7

Otoczka Bakterie mogą syntetyzować i wydzielać na zewnątrz ściany zewnątrzkomórkowe substancje o charakterze polimerów. Jeśli polimer tworzy zbitą warstwę, ściśle otaczającą komórkę i jest mocno z nią związaną nazywamy go otoczką. Polimer tworzący luźną warstwę, swobodnie przylegającą do powierzchni komórki, łatwo tracony i znajdowany w pożywce, w której wzrastają bakterie nazywamy śluzem. Otoczka może obejmować jedną lub dwie komórki. Warstwa śluzowa obejmuje zwykle wiele komórek bakteryjnych. Bakteryjne otoczki i śluzy najczęściej mają charakter polisacharydów. Otoczki tylko niektórych bakterii mają strukturę polisacharydowo-peptydową lub peptydową. Otoczki są tworzone w naturalnych miejscach bytowania bakterii. W przypadku bakterii chorobotwórczych, w organizmie człowieka lub zwierząt. Można je zobaczyć w barwionych (np. metodą Grama) preparatach wykonanych z zakażonych tkanek. W organizmie otoczki odgrywają ważną rolę ochronną przed aktywnością układu immunologicznego. Tylko niektóre spośród tych bakterii wytwarzają otoczki także w hodowlach sztucznych. Sprzyja temu duża zawartość cukrów w pożywce. Otoczki trudno się wybarwiają, należy zastosować specjalne metody. Z hodowli najczęściej ogląda się je w preparatach barwionych metodą pozytywno-negatywną, w zwykłym mikroskopie świetlnym. W przypadku badania materiałów klinicznych otoczki mają ważne znaczenie, gdyż ich skład u drobnoustrojów je wytwarzających (np. Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis czy otoczkowych Haemophilus influenzae) jest ważną cechą charakterystyczną i umożliwia identyfikację serologiczną patogenów (także po ich rozpadzie np. wykrywanie antygenów otoczkowych w płynie mózgowordzeniowym), a także określenie serotypów w obrębie poszczególnych gatunków. Stosuje się tu testy lateksowe i niekiedy, metodę pęcznienia otoczek w obecności specyficznych przeciwciał. 8

Przetrwalniki Formy przetrwalne (endospory) tworzą tylko nieliczne bakterie. Spośród bakterii związanych z człowiekiem są to laseczki z rodzajów Bacillus i Clostridium. Powstają one w wyniku różnicowania się komórek wegetatywnych jeden przetrwalnik powstaje z jednej komórki. Proces ten nazywamy sporulacją. Cechą charakterystyczną przetrwalników jest stan uśpienia metabolizmu i znacznie większa niż u form wegetatywnych oporność na działanie czynników fizyko-chemicznych. Przetrwalniki zawdzięczają oporność swojej unikatowej budowie: płaszczom zewnętrznemu i wewnętrznemu, z którymi wiąże się oporność na czynniki chemiczne oraz korze, która w dużym stopniu decyduje o oporności na wysoką temperaturę. Wiele bakterii (laseczek) odpowiedzialnych za choroby u ludzi, bytuje w środowisku w postaci przetrwalników. Stąd dostają się do organizmu w postaci aerozoli lub po urazach z glebą. Przetrwalnik w środowisku nieożywionym zachowuje przez długi czas żywotność, a w dogodnych warunkach (np. w organizmie) kiełkuje w komórkę wegetatywną, która wytwarza toksyny i enzymy odpowiedzialne za chorobotwórczość tych bakterii. W warunkach hodowli laseczki wytwarzają przetrwalniki w późnej jej fazie. Można je wtedy oglądać w preparatach. Przetrwalnik może mieć kształt kulisty lub owalny i być umieszczony centralnie, podbiegunowo lub biegunowo. Przetrwalnik może mieć średnicę mniejszą lub większą od wymiaru porzecznego komórki. W przypadku, gdy jest większa, powoduje zniekształcenie komórki, nadając jej charakterystyczny kształt. Przetrwalniki nie barwią się zwykłymi metodami. Można je obserwować w komórkach nie zabarwionych, szczególnie dobrze w mikroskopie fazowo-kontrastowym, gdzie są widoczne jako struktury silniej załamujące światło niż reszta komórki. Można je również obserwować w preparatach barwionych np. metodą Grama. W zabarwionej komórce widać wtedy bezbarwny przetrwalnik. Jeśli właśnie powstaje, jest czasami zabarwiony, a gdy zostanie już uwolniony z komórki widoczny jest w preparacie jako twór bezbarwny, czasem z cieniutką warstewką barwnika na obwodzie. 9

Ziarnistości zapasowe W komórkach niektórych bakterii gromadzone są w cytoplazmie materiały zapasowe, nazywane też wtrętami cytoplazmatycznymi lub ciałami zapasowymi. Mają one charakter polimerów, które gromadzone są w komórce w czasie jej wzrostu w warunkach nadmiaru substancji odżywczych, a zużywane w warunkach głodu. Do najczęściej występujących u bakterii ciał zapasowych należy kwas poli-β-hydroksymasłowy. Bakterie mogą także gromadzić polimery glukozy skrobię, glikogen. Wśród bakterii związanych z człowiekiem, najważniejsze są występujące u bakterii grupy Maczugowate ziarnistości polimetafosforanowe, które zbudowane są z nieorganicznych fosforanów. Nazywamy je także wolutyną. Wykrywane poprzez odpowiednie barwienie preparatów mają istotne znaczenie taksonomiczne. Ruch bakterii Dzięki rzęskom czy włóknom osiowym, które są elementami budowy niektórych bakterii, zwłaszcza cylindrycznych, bakterie te wykazują zdolność poruszania się w środowisku płynnym lub półpłynnym, a nawet w cienkiej warstwie cieczy na podłożu stałym. Wykazanie zdolności ruchu bakterii może być ważną cechą identyfikacyjną. W komórkach bakterii występuje najczęściej jeden z trzech typów urzęsienia: monotrichalny jedna rzęska na biegunie, lofotrichalny pojedyncza rzęska lub ich pęczek na obu biegunach, perytrichalny wiele rzęsek dookoła komórki. Ruch krętków warunkuje włókno osiowe, które składa się z pęczka włókienek przypominających budową rzęski. Wyrastają one z bieguna komórki i tworząc włókno osiowe, spiralnie je oplatają. Barwienie rzęsek jest trudne i kłopotliwe. Dlatego o ich istnieniu dowiadujemy się pośrednio, obserwując ruch bakterii. W preparatach mokrych w mikroskopie świetlnym najlepiej temu służy preparat w kropli wiszącej. Ruch żywych komórek bakterii można także obserwować w mikroskopie kontrastowo-fazowym oraz w mikroskopie 10

z ciemnym polem widzenia. Ten ostatni jest szczególnie dogodny dla obserwacji krętków w przyżyciowych preparatach. Metody Mikroskopowanie Drobne wymiary bakterii sprawiają, że do oglądania ich komórek musimy korzystać z mikroskopu. Żywe komórki bakterii najczęściej obserwujemy w mikroskopie fazowo-kontrastowym i z ciemnym polem widzenia. Preparaty trwałe, barwione różnymi metodami, ogląda się w zwykłym mikroskopie świetlnym lub mikroskopie fluorescencyjnym. Mikroskop fazowo-kontrastowy przekształca, niewidzialny dla naszego oka, obraz fazowy na obraz kontrastowy zróżnicowany pod względem przechodzącego natężenia światła. Różnice te są rozpoznawalne przez wzrok ludzki. Struktury silniej załamujące światło będą widziane jako elementy ciemniejsze na jasnym tle. Mikroskop ten stwarza możliwości obserwowania żywych, niezabarwionych komórek bakterii, a nawet pewnych ich struktur, np. przetrwalników, materiałów zapasowych. W mikroskopie z ciemnym polem widzenia bakterie widoczne są jako jasne obiekty na ciemnym tle. Efekt taki uzyskujemy dzięki specjalnemu kondensorowi ciemnego pola, który zapobiega przechodzeniu światła bezpośrednio do soczewki obiektywu. Obiektyw odbiera tylko promienie świetlne ugięte przez elementy preparatu. Ten typ mikroskopu używany jest do oglądania bakterii żywych i ich ruchu. Do obserwacji bakterii wykorzystuje się przede wszystkim mikroskop świetlny z jasnym polem widzenia, ale komórki nie zabarwione są w nim źle widoczne, więc stosuje się różne metody barwienia. Mikroskop fluorescencyjny wyposażony jest w lampę emitującą promieniowanie UV, co pozwala na oglądanie preparatów barwionych różnicowo barwnikami fluorescencyjnymi. Mikroskop taki jest bardzo przydatny w diagnostyce; pozwala na stosowanie metody immunofluorescencji. Preparaty zawierające bakterie należy oglądać przy użyciu obiektywu immersyjnego dającego powiększenie 100 x i okularów powiększających 11

5-10 razy. Pozwala to na osiągnięcie największego powiększenia (1000 x), jakie możemy uzyskać w mikroskopie świetlnym. Obiektyw immersyjny wymaga zastosowania olejku immersyjnego, w którym należy zanurzyć soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do oglądania preparatów. Promienie świetlne po przejściu przez szkiełko preparatu, wpadając do warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu mikroskopowania z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku bawełnianą szmatką. W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co grozi jego uszkodzeniem, usuwamy olejek specjalnym zmywaczem. Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie istotny wpływ ma oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym, należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym lusterko wklęsłe. Preparaty trwałe należy oglądać przy maksymalnie podniesionym kondensorze. Preparaty przyżyciowe mające wykazać ruch bakterii, lub zawierające inne większe niż bakterie elementy można oglądać przy pomocy obiektywu powiększającego 60 x, wtedy, przy obniżonym kondensorze. Preparaty przyżyciowe - mokre Preparaty takie mogą być wykonywane bezpośrednio z materiału klinicznego wtedy ocenia się obecność w nim leukocytów i bakterii. W mikroskopie z ciemnym polem widzenia ogląda się przyżyciowo krętki. Można także oglądać takie preparaty z hodowli. Więcej cech bakterii w tym niektóre elementy ich struktury, można zobaczyć w mikroskopie kontrastowo-fazowym. Preparat w "kropli wiszącej" umożliwia obserwację ruchu bakterii. Wykonuje się go używając szkiełka podstawowego z wgłębieniem ("łezką") i szkiełka nakrywkowego. Wykonanie Brzeg wgłębienia na szkiełku podstawowym smarujemy cienką warstwą wazeliny. Na środek szkiełka nakrywkowego nanosimy oczko ezy płynnej 12

hodowli bakteryjnej. Następnie odwracamy szkiełko podstawowe i przyklejamy je do szkiełka nakrywkowego tak, aby kropla hodowli zawisła nad wgłębieniem. Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych Rozmazy wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach podstawowych. Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli stałej, na szkiełko należy nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie zawiesić w niej bardzo niewielką ilość zebranej ezą masy bakteryjnej. Powstała zawiesina powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem prawidłowej oceny ich morfologii. Przygotowanie rozmazu z hodowli płynnej polega na dwu lub trzykrotnym naniesieniu jej ezą na szkiełko. Każdą kroplę, przed naniesieniem następnej należy wysuszyć. Trzeba też pamiętać o przepaleniu ezy przed powtórnym zanurzeniem jej w hodowli. Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego powietrza, trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem. Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania. W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek w trakcie pobierania materiału. Barwienie preparatów trwałych Bakterie najczęściej oglądamy w preparatach barwionych. Możemy w nich zaobserwować cechy morfologiczne komórek bakteryjnych, jak wymiar, kształt sposób układania się komórek i pewne struktury anatomiczne. Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii i odróżnienie ich od składników otoczenia, w którym się znajdują. Barwniki wykorzystywane w pracowni mikrobiologicznej dzielimy na barwniki kwaśne i barwniki 13

zasadowe. Barwniki kwaśne to sole, w których kationem jest metal, a anion jest jonem barwnym. Do najczęściej wykorzystywanych należą: nigrozyna, tusz chiński, kolargol, zieleń malachitowa i eozyna. W barwnikach zasadowych jonem barwnym jest kation. Do najczęściej wykorzystywanych zaliczamy: fiolet krystaliczny, fuksynę zasadową, safraninę i błękit metylenowy. Mechanizm barwienia polega na adsorpcji barwnika na powierzchni komórki i na łączeniu się go ze związkami chemicznymi, głównie białkami, wchodzącymi w skład komórki bakteryjnej. W ph hodowli zwykle obojętnym lub lekko zasadowym białka bakteryjne posiadają ładunek ujemny. Kwasy nukleinowe, z którymi też będą łączyć się barwniki, w tych warunkach również wykazują ujemne naładowanie. Dlatego właśnie do barwienia bakterii używa się barwników zasadowych. Barwniki kwaśne stosowane są do barwienia tła otoczenia, w którym znajdują bakterie. Barwienie komórek bakteryjnych określamy barwieniem pozytywnym. Barwienie tła, otoczenia, w którym znajdują się komórki określamy barwieniem negatywnym. Barwienie metodą Grama Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy: gramdodatnie i gramujemne. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: barwnik podstawowy fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (gencjana); zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola); odbarwiacz - alkohol etylowy; barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna 1:10). Wykonanie barwienia - Na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę roztwór gencjany na 2 minuty; - preparat spłukać wodą; - nalać płyn Lugola na 1 minutę; - spłukać wodą; 14

- odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund; - spłukać wodą; - dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny; - spłukać wodą; - osuszyć lekko odciskając w bibule. Wynik barwienia: Bakterie gramdodatnie fioletowogranatowe, gramujemne - różowe. O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę komórkową. Grupa warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym, który przez cienką warstwę peptydoglikanu bakterii gramujemnych wydostaje się na zewnątrz. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia komórki bakterii gramujemnych na różowo. Barwienie metodą Ziehl-Neelsena Barwienie metodą Ziehla-Neelsena umożliwia wykrycie bakterii kwasoalkoholo-opornych (Mycobacterium, Nocardia). Jedynie te przyjmują i utrzymują w toku barwienia barwnik podstawowy. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: barwnik podstawowy - fenolowy roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna karbolowa); odbarwiacz - alkohol etylowy z dodatkiem 3% HCl (alkohol zakwaszony); barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór błękitu metylenowego (błękit metylenowy). Wykonanie barwienia 15

- Na ułożony na statywie do barwienia, utrwalony preparat należy nalać roztworem fuksyny zasadowej i krótko podgrzać szkiełko od spodu płomieniem palnika. Ukaże się para, gdy zniknie, czynność powtórzyć jeszcze dwa razy; - po ostudzeniu preparat należy spłukać wodą; - zalać preparat zakwaszonym alkoholem i pozostawić do całkowitego odbarwienia na ok. 1 minutę (czas odbarwiania zależy od grubości rozmazu); - spłukać wodą ; - dobarwić preparat błękitem metylenowym przez 2 minuty; - spłukany wodą preparat należy wysuszyć odciskając go w bibule. Wynik barwienia: Bakterie kwaso-alkoholo-oporne - różowe, inne elementy preparatu, w tym bakterie inne niż kwaso-alkoholo-oporne niebieskie. Barwienie metodą Neissera Barwienie metodą Neissera umożliwia wykrycie w komórkach bakterii polifosforanowych (wolutynowych) ziarnistości zapasowych. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: barwnik Neissera złożony z dwóch składników łączonych bezpośrednio przed barwieniem: alkoholowo-wodnego roztworu błękitu metylenowego (Neisser I) i alkoholowo-wodnego roztworu fioletu krystalicznego (Neisser II); wodny roztwór chryzoidyny. W barwieniu tym nie spłukujemy barwników wodą. Wykonanie barwienia - Przed przystąpieniem do barwienia należy przygotować barwnik Neissera przez zmieszanie w cylinderku: dwie części barwnika Neisser I i jedną część barwnika Neisser II; - na utrwalony preparat należy nalać wymieszany barwnik; - po 5 minutach dokładnie zlać barwnik, nie spłukiwać wodą; - nalać na szkiełko roztwór chryzoidyny na 10-15 sekund; - po zlaniu barwnika preparat od razu odcisnąć w bibule. Wynik barwienia: Ziarnistości wolutynowe są granatowoczarne, komórki żółte. 16

Barwione metodą negatywno-pozytywną Barwienie metodą negatywno-pozytywną jest jedną z technik wykrywania otoczek u bakterii. Zabarwiana jest komórka bakteryjna i innym barwnikiem tło. W metodzie tej można używać różnych barwników. Dla zabarwienia komórki - najczęściej stosuje się fuksynę z dodatkiem fuksyny karbolowej, dla zabarwienia tła - nigrozynę lub kolargol. Wykonanie barwienia - Na utrwalony preparat nalewamy: roztwór fuksyny i kilka kropli fuksyny zasadowej, a następnie leżące na statywie do barwienia szkiełko podgrzewamy od spodu płomieniem palnika do ukazania się pary; - po ostudzeniu, preparat należy spłukać wodą i osuszyć w bibule; - na brzeg szkiełka nanieść kroplę nigrozyny lub kolargolu i rozciągnąć barwnik równomiernie po powierzchni rozmazu krawędzią drugiego szkiełka podstawowego; - preparat wysuszyć w powietrzu. Wynik barwienia: Komórka barwi się na różowo, tło jest szare (nigrozyna) lub żółtobrązowe (kolargol). Otoczka pozostaje bezbarwna. Zadania do wykonania Zadanie 1. Mikroskopowanie i ocena preparatów Otrzymujesz gotowe preparaty wykonane z hodowli Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, które zabarwione zostały metoda prostą. - Nastaw je i obejrzyj pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. - Narysuj obraz preparatów widzianych w mikroskopie. - Określ powiększenie oglądanych preparatów oraz kształt i sposób układania się komórek bakteryjnych. Pamiętaj aby w swoich rysunkach uwzględnić różnice w wielkości komórek oglądanych drobnoustrojów. Do zapisania swoich obserwacji wykorzystaj poniższe tabele. 17

Obraz mikroskopowy (rysunek) Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Powiększenie: Opis obraz mikroskopowego Oglądany Kształt bakterii drobnoustrój Bacillus subtilis Sposób układania się komórek Staphylococcus aureus Escherichia coli 18

Zadanie 2. Identyfikacja na podstawie morfologii komórki Otrzymujesz hodowlę płynną nieznanych bakterii. - Wykonaj preparat z tej hodowli, zabarw go metodą Grama i oceń pod mikroskopem. - Narysuj obraz mikroskopowy i zapisz obserwacje w tabeli. - Ile rodzajów bakterii można odróżnić? - Określ ich kształt, sposób układania się komórek i zabarwienie. Kształt bakterii i ich układ (rysunek) Kształt bakterii i ich układ (opis ) 19

Zadanie 3. Barwienie metodą pozytywno-negatywną Otrzymujesz hodowlę stałą Klebsiella pneumoniae w płytce Petriego. Bakterie posiane zostały w sposób pasmowy. Wykonaj preparat z tej hodowli i zabarw go metodą pozytywno-negatywną. Narysuj obraz widziany pod mikroskopem. - Czy badany przez ciebie drobnoustrój charakteryzuje się zdolnością wytwarzania otoczki? 20

- Dlaczego w powszechnie stosowanych metodach barwienia otoczka pozostaje niewybarwiona? Zadanie 4. Kropla wisząca Otrzymujesz płynną hodowlę Proteus vulgaris, do której dodano kilka kropli zawiesiny czerwonych krwinek baranich. - Wykonaj preparat w "kropli wiszącej" i nastaw go pod mikroskopem. Pamiętaj, że tego typu preparat oglądamy przy obniżonym kondensorze z wykorzystaniem obiektywu powiększającego 40x lub 60x. - Oglądając preparat zwróć uwagę na różnicę w wielkości pomiędzy poruszającymi się bakteriami, a nie wykazującymi ruchu krwinkami czerwonymi. 21

22

Rozdział 2 Pożywki do hodowli bakterii Cześć teoretyczna Czynniki warunkujące wzrost bakterii na podłożach Bakterie mogą się rozwijać tylko w takich środowiskach, które zaspokajają ich wymagania pokarmowe. Pobrane składniki są źródłem substancji budulcowych komórki oraz energii potrzebnej dla rozmnażania i wzrostu. Do elementów pokarmowych, bez których wzrost nie jest możliwy należą: węgiel (C), azot (N), fosfor (P), siarka (S), tlen (O), wodór (H). Pierwiastki te wchodzą w skład większości związków organicznych tworzących komórkę i określane są jako pierwiastki budulcowe lub biogenne. Pewne grupy bakterii, o wysokim stopniu pasożytnictwa, nie są zdolne do wzrostu, jeśli nie uzyskują gotowych złożonych związków, które nazywamy czynnikami wzrostowymi. Należą do nich witaminy, szczególnie z grupy B, które są koenzymami lub grupami prostetycznymi niektórych enzymów. Inną grupę czynników wzrostowych stanowią aminokwasy oraz zasady purynowe i pirymidynowe, które wykorzystywane są jako składniki budulcowe komórki. Czynnikami wzrostowymi niezbędnymi dla niektórych bakterii są: cholesterol, hem, hemina, NAD, NADP i nienasycone kwasy tłuszczowe. Bakterie do wzrostu i mnożenia wymagają znacznych ilości wody. W wodzie rozpuszczone są związki odżywcze dla bakterii. Woda jest także środowiskiem, w którym zachodzą procesy metaboliczne, a także jest istotnym źródłem wodoru i tlenu. Większość bakterii nie wzrasta, jeśli zawartość wody w środowisku jest niższa niż 20%. Zawartość wody w podłożach hodowlanych wynosi 50-90%. Wzrost bakterii zależny jest także od obecności soli mineralnych. Jony Mg 2+, Fe 2+, Ca 2+, Mn 2+, Zn 2+ są aktywatorami niektórych reakcji enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Jony Mg 2+ stabilizują strukturę ściany komórkowej bakterii gramujemnych. Stabilność struktury i prawidłową czynność rybosomów zapewniają jony 23

Mg 2+ i K +. Jony Ca 2+ są niezbędne w procesie wytwarzania przetrwalników. Sole mineralne są również czynnikami regulującymi ciśnienie osmotyczne komórki. Podłoża do hodowli bakterii Pożywki (podłoża) bakteriologiczne służą do hodowli bakterii w warunkach laboratoryjnych. Odpowiednie dobranie składu podłoża pozwala na przeniesienie bakterii z ich naturalnych środowisk (organizm człowieka, gleba, woda) i namnożenie. Zdolność wyrastania bakterii na określonych podłożach lub jej brak, jest bardzo ważną cechą diagnostyczną. Bakterie hodujemy na stałych lub w płynnych pożywkach, które umieszczone zostały w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego, kolby Erlenmayera, probówki). Wzrost i rozwój bakterii na pożywkach pozwala na ich wyodrębnienie i zbadanie ich cech morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych i serologicznych. Większość bakterii rośnie na sztucznych podłożach. Nie ma jednak uniwersalnej pożywki umożliwiającej wzrost wszystkim bakteriom. Pożywki stosowane do namnażania bakterii powinny: zawierać odpowiednie składniki pokarmowe, mieć odpowiednią wilgotność, mieć odpowiednie ph, mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne, być jałowe. Biorąc pod uwagę ich skład chemiczny, podłoża bakteriologiczne dzielimy na syntetyczne (ściśle zdefiniowane chemiczne) i złożone (kompleksowe). Skład pożywek syntetycznych jest dokładnie zdefiniowany i oparty na czystych, chemicznych związkach organicznych i nieorganicznych. Jest więc zawsze możliwy do dokładnego odtworzenia. Pożywki te znajdują niekiedy zastosowanie w laboratoriach badawczych. Podłoża złożone mają szerokie zastosowanie w laboratoriach diagnostycznych i naukowych. Są to podłoża zawierające różne składniki, 24

w tym surowce pochodzenia naturalnego, których skład nie jest dokładnie określony. Składniki pochodzenia naturalnego najczęściej wykorzystywane w pożywkach złożonych przedstawiono w tabeli 1. Pożywki dzielimy na proste (podstawowe), stosowane do hodowli drobnoustrojów o małych wymaganiach pokarmowych i wzbogacone, które służą do hodowli drobnoustrojów o dużych wymaganiach odżywczych. Tabela 1. Składniki pochodzenia naturalnego stosowane w pożywkach złożonych. Ekstrakty mięsne wodne wyciągi bogate źródło azotu, węgla z tkanki mięsnej, serca, wątroby i witamin dobre źródło azotu, węgla, Ekstrakty z drożdży bogate źródło witamin z grupy B Peptony produkty częściowej, bogate źródło azotu, węgla enzymatycznej hydrolizy białek Hydrolizaty enzymatyczne lub bogate źródło wolnych kwasowe kazeiny, białek soi, białek aminokwasów (azotu), węgla mięsa. Białka kazeina, żelatyna, białka jaja, surowicy krwi bogate źródło azotu, węgla, mikroelementów Podstawową prostą pożywką płynną jest bulion odżywczy, a stałą agar odżywczy. Bulion odżywczy zawiera wyciąg mięsny, pepton i NaCl. Poprzez dodanie 1,5-2% agaru do bulionu odżywczego otrzymujemy podłoże stałe. Agar jest to wielocukier otrzymywany z glonów morskich. Silnie chłonie wodę, upłynnia się w temperaturze 100 C, a zestala w temperaturze 45-48 C. W temperaturze 37 C, a więc optymalnej dla wzrostu większości bakterii, ma konsystencję stałą. Służy on do zestalenia pożywki. Nie jest wykorzystywany przez bakterie jako składnik odżywczy. Agar odżywczy przygotowywany jest w postaci skosów agarowych, słupków lub płytek agarowych. Podłoża wzbogacone to najczęściej podłoża podstawowe zawierające dodatkowe składniki. Elementami wzbogacającymi mogą być: 25

węglowodany (np. glukoza), białka zwierzęce (surowica lub krew), hydrolizaty białek (np. kazeiny). Powszechnie wykorzystywanym w badaniach mikrobiologicznych podłożem wzbogaconym jest agar z krwią. Zawiera on 5-10% odwłóknionej jałowej krwi (najczęściej baraniej), zmieszanej z roztopionym agarem odżywczym. Po wylaniu na płytkę Petriego otrzymujemy tak zwaną płytkę krwawą. Innym często wykorzystywanym podłożem wzbogaconym jest agar czekoladowy. Zawiera on agar odżywczy i zdenaturowaną termicznie krew. Po zestaleniu podłoża ma ono barwę czekoladową, stąd jego nazwa. Pożywki mogą zawierać dodatkowe składniki, które wpływają stymulująco lub hamująco na rozwój hodowanych na nich bakterii. Ze względu na wynikające z ich składu zastosowanie, podłoża możemy podzielić na: - namnażające lub namnażająco-wybiórcze, - wybiórcze (selektywne), - diagnostyczne (różnicujące), - transportowe. Pożywki namnażające lub namnażająco-wybiórcze są to najczęściej podłoża płynne, wykorzystywane do namnażania bakterii występujących w niewielkiej ilości w badanej próbce, często jako pojedyncze komórki, w licznej populacji bakterii towarzyszących. Skład pożywki i warunki hodowli umożliwiają namnożenie się tylko bakterii poszukiwanych. Pożywki wybiórcze (selektywne) oprócz składników odżywczych zawierają składniki, które powodują całkowite zahamowanie wzrostu pewnych gatunków bakterii lub znaczne ograniczenie ich wzrostu. Czynnikiem decydującymi o wybiórczości podłoża może być azydek sodu, sole kwasów żółciowych niektóre barwniki i antybiotyki. Są to najczęściej podłoża stałe. Przykładem podłoża wybiórczego może być podłoże Loewensteina- Jensena do hodowli prątków gruźlicy. Pożywki różnicujące (diagnostyczne) pozwalają na zmierzające do identyfikacji, różnicowanie bakterii. Zawierają one substrat diagnostyczny, który może być rozłożony enzymatycznie tylko przez określone gatunki bakterii. Do podłoża często dodawany jest wskaźnik, który na przykład zmienia swoje zabarwienie w zależności od ph pożywki. Dlatego właśnie rozkład substratu manifestuje się zmianą zabarwienia pożywki (podłoża 26

stałe lub podłoża płynne) lub odpowiednim zabarwieniem wyrosłych kolonii (podłoża stałe). Stałe podłoża różnicujące mogą być jednocześnie podłożami wybiórczym dla określonej grupy bakterii i są nazywane wybiórczo-różnicującymi. Przykładem takiej pożywki może być podłoże SS (Salmonella-Shigella) służące do izolacji pałeczek z rodzajów Salmonella i Shigella oraz podłoże Chapmana służące do izolacji gronkowców. Pożywki transportowe nie zawierają składników pokarmowych. Zawierają wodę i składniki optymalizujące środowisko dla przeżycia bakterii, w tym roztwory buforowe i sole mineralne. Zadaniem tych pożywek jest utrzymanie żywotności bakterii w próbce, zanim trafi ona do laboratorium mikrobiologicznego. Na rynku dostępne są podłoża o wystandaryzowanym składzie, jałowe i gotowe do użycia, w jednorazowych naczyniach, o określonej dacie przydatności. Zastosowanie gotowych podłoży znacznie skraca czas przygotowań do badań mikrobiologicznych. Można też je przygotowywać samodzielnie, korzystając z pożywek w proszku o wystandaryzowanym składzie i innych chemicznych składników. Własnoręczne komponowanie pożywek wymaga zastosowania procedur i kontroli zapewniających powtarzalność ich składu, pozwalającą na porównywanie wyników hodowli otrzymywanych w różnym czasie i w różnych laboratoriach. Bezpośrednio po przygotowaniu, takie pożywki należy wyjałowić (wysterylizować), stanowią bowiem podłoże wzrostu także dla drobnoustrojów licznie obecnych w użytych składnikach i otoczeniu. Sterylizacji tej dokonuje się najczęściej w autoklawie lub w aparacie Kocha, a czasem przez przesączenie przez filtr o odpowiednio małych porach. Czas hodowli W podłożu zawierającym niezbędne do wzrostu składniki, bakterie podwajają swoją masę i replikują swój materiał genetyczny, co w konsekwencji prowadzi do ich podziału. Czas generacji (okres międzypodziałowy) jest to czas potrzebny do podwojenia liczby komórek w populacji. Szybkość wzrostu bakterii jest cechą charakterystyczną 27

rodzaju (gatunku). Zależy ona także od rodzaju podłoża wzrostowego oraz warunków środowiskowych. W optymalnych warunkach wzrostu w laboratorium okresy międzypodziałowe większości bakterii trwają od 20 do 40 minut, ale może też być znacznie dłuższy - od kilku do kilkunastu godzin. Stąd, czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na pożywce tak, aby ich wzrost był widoczny gołym okiem jest różny, ale dla większości bakterii chorobotwórczych wynosi 18-24 godziny. Są jednak i takie, które hodować trzeba przez wiele dni lub nawet tygodni (np. prątki). Krzywa wzrostu bakterii w hodowli płynnej Bakterie na podłożach płynnych można namnażać w warunkach hodowli okresowej (zwykłej) lub ciągłej. W hodowli okresowej bakterie namnażają się w systemie zamkniętym (probówki, kolbki, butelki, bioreaktory) do momentu wyczerpania substancji odżywczych zawartych w pożywce lub nagromadzenia w niej dużej ilości toksycznych dla bakterii produktów ich metabolizmu. W hodowli ciągłej, którą prowadzi się w specjalnych bioreaktorach, wzrost bakterii można utrzymywać nieskończenie długo. Wzrost bakterii w hodowli okresowej można przedstawić graficznie pod postacią krzywej, którą nazywamy krzywą wzrostu hodowli bakteryjnej. Jest to krzywa w układzie półlogarytmicznym. Opisuje ona zależność logarytmu dziesiętnego liczby żywych komórek bakterii od czasu hodowli i ilustruje wzrost populacji (rycina 1). Obraz krzywej wzrostu dla większości bakterii jest bardzo podobny i można w nim wyróżnić sześć faz. Czas trwania poszczególnych faz wzrostu jest zależny od rodzaju bakterii i warunków hodowli. Faza pierwsza, nazywana jest fazą zastoju. Bakterie przystosowuj swój metabolizm do nowego środowiska. Wzrasta ilość rybosomów i zawartość RNA. Pojedyncze komórki powiększają swój wymiar i przygotowują się do podziału. Faza druga - przyspieszonego wzrostu. Komórki wykazują intensywny metabolizm. Rozpoczynają się podziały komórkowe. Faza trzecia, nazywana fazą wzrostu wykładniczego (logarytmicznego), jest okresem rzeczywistego rozwoju hodowli. Metabolizm komórek jest bardzo intensywny. Liczba żywych komórek przyrasta w postępie 28

geometrycznym. W populacji prawie wszystkie komórki są żywe. W tej fazie wzrostu bakterie są najbardziej wrażliwe na działanie fizycznych i chemicznych czynników środowiskowych. k re ó m o k h c y w y ż y b z lic lg 1 2 3 4 5 6 czas hodowli Rycina 1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej: 1- faza zastoju, 2 faza przyspieszonego wzrostu, 3 faza wzrostu logarytmicznego, 4 faza zwolnionego wzrostu, 5 faza stacjonarna, 6 faza zamierania Faza czwarta jest fazą zwolnionego wzrostu. Rozmiar komórek maleje. Zmniejsza się ilość rybosomów i zawartość RNA. Zwiększa się liczba komórek martwych. Częstość podziałów maleje. Faza piąta, nazywana fazą stacjonarną (równowagi), charakteryzuje się stałą liczbą żywych komórek w hodowli. Z powodu braku substancji pokarmowych komórki zużywają własne materiały zapasowe. Sporadyczne podziały komórkowe rekompensują ubytki komórek spowodowane ich wymieraniem. Faza szósta zamierania. Wzrasta liczba martwych komórek. Zaczynają się procesy autolizy, czyli samorozpuszczania się bakterii pod wpływem własnych enzymów. Zmniejsza się liczba żywych komórek i ogólna biomasa hodowli. Brak podziałów komórkowych. 29

Ważne definicje Populację bakterii rosnącą na podłożu stałym lub płynnym nazywamy hodowlą. Hodowlę składającą się z różnych gatunków bakterii nazywamy hodowlą mieszaną. Czystą hodowlą nazywamy hodowlę bakterii jednego rodzaju (gatunku, szczepu). Szczep to populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku wyróżniająca się określonymi cechami. Szczepy wyprowadzone z pojedynczej komórki nazywamy klonami. 30

Rozdział 3 Otrzymywanie czystych hodowli, ocena morfologii wzrostu bakterii Część teoretyczna Posiew na podłoża Materiał zawierający bakterie posiewa się na podłoża stałe (skos agarowy, płytka agarowa) lub płynne (bulion) jałowymi: ezą, pipetą lub wacikiem. Każda próbka pobierana do posiewu z hodowli lub zawiesiny bakterii, którą zakażamy świeże podłoże stanowi inokulum. Czyste hodowle W większości przypadków przy badaniu bakteriologicznym materiałów klinicznych, żywności, wody czy leków spodziewamy się w próbce więcej niż jednego rodzaju drobnoustrojów. Identyfikacja drobnoustrojów występujących w badanym materiale, może nastąpić dopiero po ich wyodrębnieniu i uzyskaniu czystych hodowli. Do tego celu wykorzystuje się metodę posiewu redukcyjnego. Taki typ posiewu pozwala na ocenę morfologii wyrosłych kolonii. Zakłada się, że każda z nich powstaje z jednej jednostki wzrostowej. A zatem, ile typów kolonii, tyle rodzajów bakterii w hodowli. Ponieważ morfologia kolonii różnych gatunków czy nawet rodzajów może być zbliżona, czasem pomocnym w odróżnieniu kolonii jest posiew redukcyjny na płytkę z podłożem diagnostycznym. Izolacja pojedynczej kolonii z takiego posiewu prowadzi zwykle do uzyskania hodowli czystej. Morfologia wzrostu bakterii na podłożach Sposób, w jaki bakterie wyrastają na pożywkach jest ważną cechą, która może być istotna przy ich identyfikacji. 31

Na podłożach płynnych bakterie wyrastają w postaci jednolitego zmętnienia, osadu na dnie naczynia, kożuszka lub błonki na powierzchni płynu. Czasami zmętnieniu towarzyszy delikatny osad lub zagęszczenie przy powierzchni, a na granicy faz tworzy się przylegająca do ścianek naczynia warstwa biofilmu. Na podłożach stałych możemy oceniać wygląd kolonii bakteryjnych. Istotna może być też ocena obfitości wzrostu lub obserwacja zdolności bakterii do wzrostu mgławicowego (to cecha bakterii bardzo ruchliwych). Kolonię bakteryjną definiujemy jako widoczne makroskopowo na powierzchni lub w głębi stałej pożywki skupisko bakterii wyrosłe z jednej jednostki wzrostowej (jtk jednostka tworząca kolonie; CFU ang. colony forming unit). Przez jednostkę wzrostową rozumiemy pojedynczą komórkę lub kilka komórek bakteryjnych, które nie rozdzieliły się po podziale (układ popodziałowy) albo przetrwalnik. Umiejętność oceny morfologii kolonii jest bardzo ważna, gdyż w przypadku niektórych bakterii może w istotny sposób ważyć na ich identyfikacji, jest też istotna przy określaniu czystości hodowli. W określonych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami. Metody Posiewy Posiewając ezą, należy ją wyjałowić wyżarzając w płomieniu palnika przed i po wykonaniu posiewu. Jeśli używa się jałowych pipet i wacików należy pamiętać o ich umieszczeniu w odpowiednich naczyniach (np. w słoju z chloraminą) po zakończeniu posiewu. W trakcie posiewania bakterii na podłoża płynne należy także pamiętać o opalaniu wylotu naczyń w płomieniu palnika po otwarciu i przed ich zamknięciem. Ma to zapobiec zakażeniu pożywki drobnoustrojami z zewnątrz i zapewnić bezpieczeństwo osobie pracującej. Posiew na podłoże płynne ezą polega na uwolnieniu z niej materiału stanowiącego inokulum do pożywki przez pocieranie o ścianki naczynia probówki lub kolbki. 32

Przy posiewaniu do naczyń zawierających większe objętości pożywki konieczne jest zachowanie odpowiednich proporcji między wielkością inokulum a objętością podłoża. Zwykle stosuje się zasadę, że inokulum stanowi 5% końcowej objętości pożywki. Posiewu możemy dokonywać pipetą wprowadzając np. 5 ml hodowli stanowiącej inokulum do 95 ml pożywki. Posiew na podłoża stałe na płytkach Petriego dokonuje się w różny sposób zależnie od jego celu. Ważnym, często stosowanym przy izolacji bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej bakterii. Sposób wykonania takiego posiewu przedstawia rycina 1. Rycina 1. Posiew redukcyjny A B C D 33

W poszczególnych etapach raz naniesiony materiał zostaje rozprowadzany na kolejne (zwykle 4) sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do takiej ilości, przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci pojedynczych kolonii. Czasem wykonuje się posiew redukcyjny z materiału z wacika. Oznacza to, że pierwsza jego strefa posiana jest wacikiem, którym np. pobrano materiał kliniczny wymaz, a następne już w klasyczny sposób ezą z zachowaniem zasady jej przepalania w trakcie posiewu. Można wykonać na płytce także posiew pasmowy lub punktowy, który pozwala umieścić na płytce wiele próbek, których cechy chcemy porównywać. Polega on na naniesieniu na płytkę inokulum z ezy w postaci pasma różnej długości. Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum stanowi zwykle próbka pobrana z podłoża płynnego (nadmiar płynu z wacika należy w trakcie pobierania odcisnąć o ścianki naczynia), którą rozprowadza się równomiernie na powierzchni podłoża w płytce. Czasem zawiesina stanowiąca inokulum w tej metodzie posiewu jest w odpowiedni sposób standaryzowana. Inokulum o określonej objętości, zwykle 0,1 ml można także rozprowadzić głaszczką lub odpowiednio zagiętą ezą. Przy posiewie na podłoże stałe w probówce w postaci skosu agarowego należy wprowadzić ezę z inokulum do dna probówki i rozprowadzić na powierzchni skosu. Zwykle prowadzi się w tym celu ezę zygzakowatym ruchem od ścianki do ścianki próbówki, przesuwając ją ku wylotowi naczynia. Półskosy posiewa się wkłuwając ezę w część słupkową, a dopiero potem wyprowadzając ją zygzakiem po powierzchni skosu ku wylotowi. Otrzymywanie czystych hodowli Postępowanie zmierzające do otrzymania czystych hodowli z nieznanych próbek sprowadza się do następujących kroków. 34

Badany materiał posiewa się redukcyjnie na odpowiednio dobrane podłoże. Po inkubacji (czasem wydłużonej nawet do 5 dni) w temperaturze optymalnej dla oczekiwanych drobnoustrojów ocenia się morfologię wyrosłych kolonii. Obecność różnic w ich wyglądzie wskazuje, że mamy do czynienia z hodowlą mieszaną. Izoluje się wtedy pojedyncze kolonie i posiewa się je redukcyjnie na oddzielne płytki. Otrzymana w wyniku takiego posiewu hodowla może być uznana za czystą, jeśli kolonie posiadają jednakową morfologię. Namnożona (na skosie, w pożywce płynnej lub w inny sposób) pojedyncza kolonia z takiej płytki może być materiałem dla wykonywania prób i posiewów identyfikacyjnych czy służących do określenia właściwości fizjologicznych, biochemicznych i antygenowych bakterii. Szybką, choć czasem zawodną metodą sprawdzenia czystości hodowli płynnej jest ocena morfologii komórek tworzących ją bakterii w preparatach barwionych metodą Grama. Opis kolonii Dla celów diagnostycznych opisuje się kolonie wyrosłe na podłożach, które nie powodują ich nienaturalnego zabarwienia w wyniku oddziaływania zawartych w nich wskaźników czy barwników. Niekiedy jednak istotny także bywa opis ich wyglądu na podłożach diagnostycznych. Należy opisywać kolonie oddalone od pozostałych tak, aby ich wzrost nie był ograniczony przez zbyt liczne sąsiedztwo. W opisie kolonii należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy: wielkość - średnica (mm); kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna,... ; brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany,... ; powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona,..; wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata, grudkowata, wrastająca w podłoże,... ; 35

przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna,... ; barwę - biała, kremowa, szara, czerwona,... ; otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża. Zadania do wykonania Zadanie 1. Otrzymywanie czystej hodowli Etap I - Materiał z otrzymanej hodowli płynnej posiej redukcyjnie na płytkę agarową. - Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37 C, 24 godziny). - Wykonaj preparat barwiony metodą Grama z posiewanej hodowli. - Narysuj i opisz obraz mikroskopowy 36

Etap II - Obejrzyj wykonany wczoraj posiew redukcyjny, zwracając szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu. - Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii. - Wykonaj z każdej z nich preparat barwiony metodą Grama i uzupełnij opis kolonii o morfologię komórki. - Każdą z wybranych kolonii posiej redukcyjnie na nową płytkę. Opisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37 C, 24 godziny). Kolonia: Preparat: Kolonia: Preparat: 37

Kolonia: Preparat: Oceń zgodność otrzymanych obrazów mikroskopowych z preparatem wykonanym w pierwszym etapie doświadczenia. Jak oceniasz znaczenie preparatu bezpośredniego z hodowli wyjściowej dla określenia jej czystości i rodzaju drobnoustrojów w niej się znajdujących? 38

Etap III Jeśli na każdej z posianych płytek wyrosną kolonie tylko jednego rodzaju, o wyglądzie zgodnym z wcześniej wykonanym opisem, otrzymałeś czyste hodowle tych bakterii czyli hodowle jednego gatunku pochodzące z pojedynczej kolonii, a zatem czyste hodowle poszczególnych szczepów bakteryjnych. Zadanie 2. Ocena morfologii kolonii bakteryjnej - Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze kolonie. Powstały one w wyniku rozmnożenia się komórek bakterii i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza. - Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając wszystkie jej cechy. 39

40

Rozdział 4 Wymagania wzrostowe bakterii Część teoretyczna Wymagania pokarmowe Bakterie, podobnie jak inne organizmy żywe, potrzebują dostępu do odpowiednich składników odżywczych, umożliwiających im prawidłowy wzrost i rozmnażanie. Wymagania pokarmowe bakterii są bardzo różnorodne, od bakterii skrajnie wymagających, które mają najmniejsze zdolności biosyntetyczne i wymagają do wzrostu związków wielkocząsteczkowych, poprzez stanowiące największą grupę bakterie o wymaganiach pośrednich, do których zalicza się większość bakterii chorobotwórczych, aż do skrajnie niewymagających, które wykorzystują jako źródło węgla CO 2. Wymagania pokarmowe są w dużej mierze związane ze stopniem pasożytnictwa poszczególnych drobnoustrojów. Źródła węgla i azotu Węgiel jest podstawowym pierwiastkiem budulcowym organizmów żywych. W zależności od źródeł, z jakich bakterie mogą go pozyskiwać podzielono je na: autotrofy czerpiące węgiel tylko z CO 2 i przekształcające go do związków organicznych; heterotrofy czerpiące węgiel ze związków organicznych. Heterotrofy do prawidłowego wzrostu potrzebują w środowisku co najmniej jednego związku organicznego. Najwięcej drobnoustrojów ma zdolność do rozkładu glukozy, ale zdarzają się także bakterie mogące korzystać z mleczanu, bursztynianu, metanu, a także bardziej złożonych związków, jak lignina czy węglowodory aromatyczne. Heterotrofy zostały podzielone na: 41

- prototrofy drobnoustroje o małych wymaganiach pokarmowych, którym do wzrostu wystarczy jeden prosty związek organiczny i sole mineralne, co świadczy o ich dużych, gwarantujących szerokie rozprzestrzenienie, możliwościach enzymatycznych; - auksotrofy drobnoustroje o dużych wymaganiach odżywczych, rosnące jedynie w obecności co najmniej dwóch związków organicznych stanowiących źródło węgla i azotu, których nie są w stanie same syntetyzować, co w znacznym stopniu uzależnia je od środowiska. Zarówno prototrofizm, jak i auksotrofizm, mogą być wykorzystywane dla celów diagnostycznych, na przykład w identyfikacji pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, czy przy ustalaniu gatunku pałeczek z rodzaju Haemophilus. Bakterie auksotroficzne często wymagają do wzrostu specjalnych czynników wzrostowych, którymi mogą być aminokwasy, puryny i pirymidyny lub witaminy. Azot, który jest ważnym pierwiastkiem wchodzącym w skład białek i kwasów nukleinowych, prototrofy mogą pozyskiwać ze związków nieorganicznych (np. soli amonowych, azotanów i azotynów), a auksotrofy wykorzystują organiczne źródła azotu. Źródła energii oraz donatory elektronów Drobnoustroje mają zdolność wykorzystywania energii słonecznej lub energii chemicznej uwalnianej ze związków wysokoenergetycznych. Pozwala to wyróżnić wśród bakterii: fototrofy które korzystają z energii słonecznej (bakterie fotosyntetyzujące), chemotrofy korzystające z energii pochodzącej z rozkładu związków organicznych i nieorganicznych. W zależności od donatorów elektronów dzielimy bakterie na: litotrofy - korzystające z donatorów nieorganicznych, organotrofy - korzystające z donatorów organicznych. 42