Stężenie białka HE 4 u kobiet z rakiem endometrium

GinPolMedProject 3 (45) 2017: 043-048 ARTYKUŁ ORYGINALNY Stężenie białka HE 4 u kobiet z rakiem endometrium Andrzej Brenk (ABDE), Piotr Bodzek (CDEG), Iwona Janosz (EF), Anita Olejek (E) Katedra Ginekologii, Położnictwa i Ginekologii Onkologicznej w Bytomiu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach STRESZCZENIE WKŁAD AUTORÓW: (A) Projekt badania (B) Zbieranie Danych (C) Analiza Statystyczna (D) Interpretacja Danych (E) Przygotowanie Rękopisu (F) Gromadzenie Piśmiennictwa (G) Gromadzenie Funduszy Wstęp. Rak endometrium jest jednym z najczęstszych nowotworów żeńskiego układu rozrodczego, ale do tej pory brak wiarygodnego diagnostycznego markera nowotworowego tego schorzenia. Opisane w piśmiennictwie wątpliwości dotyczące rzeczywistego zachowania się stężenia białka HE4 u chorych z rakiem endometrium stanowią podstawę podjęcia próby ich wyjaśnienia. Cel pracy. Celem pracy była ocena stężeń białka HE4 u kobiet z rakiem endometrium oraz odniesienie uzyskanych wyników do kobiet zdrowych w tym samym wieku. Materiał i metody. Badaniom poddano 50 kobiet z rozpoznanym rakiem endometrium oraz 50 zdrowych kobiet leczonych operacyjnie w Oddziale Klinicznym Ginekologii, Położnictwa i Ginekologii Onkologicznej w Bytomiu SUM. Wyniki. Średnie stężenie białka HE4 jest u zdrowych kobiet znamiennie statystycznie niższe w porównaniu do kobiet z rakiem endometrium. Ponadto stężenie HE4 u kobiet z rakiem endometrium rośnie wraz z głębokością naciekania endometrium opisaną w badaniu histopatologicznym. Stężenie białka CA125 jest znamiennie statystycznie niższe w grupie kontrolnej zdrowych kobiet w porównaniu do kobiet chorujących na endometrium. Wnioski. Rak endometrium jest silnym bodźcem indukującym syntezę białek HE4 i CA125. Wyraźny wzrost ekspresji białka HE4 u kobiet z rakiem endometrium sugeruje, iż białko to może być poszukiwanym markerem nowotworowym raka endometrium, wyraźnie zależnym od głębokości naciekania endometrium. U kobiet z rakiem endometrium na wzrost stężenia HE4 mogą mieć wpływ wyższe stężenia erytrocytów, INR oraz potasu. Sugeruje to większą wartość HE4 jako markera nowotworowego kobiet z rakiem endometrium bez schorzeń współistniejących. Słowa kluczowe: białko HE4; rak endometrium; marker nowotworowy Adres do korespondencji: Oddział Kliniczny Ginekologii, Położnictwa i Ginekologii Onkologicznej, Szpital Specjalistyczny nr 2 w Bytomiu, ul. Batorego 15, 41-902 Bytom Tel: +48 32 786 15 40; e-mail: Liczba słów: 1830 Tabele: 1 Ryciny: 5 Piśmiennictwo: 20 Received: 06.06.2017 Accepted: 10.07.2017 Published: 28.09.2017 WSTĘP Rak endometrium w krajach rozwiniętych jest jednym z najczęstszych nowotworów złośliwych kobiecego narządu płciowego. Zachorowalność od przeszło 30. lat wykazuje tendencję wzrostową. Według danych Ministerstwa Zdrowia współczynnik zachorowalności na 100000 mieszkanek wynosi w naszym kraju 19,3 co daje 4. miejsce wśród nowotworów u kobiet po raku piersi, płuca i jajnika. Rak błony śluzowej macicy dotyka głównie kobiety w 6. dekadzie życia. Wzrost zachorowalności wiąże się ze stosowaniem egzogennych estrogenów oraz chorobami cywilizacyjnymi, takimi jak nadciśnienie tętnicze, cukrzyca i otyłość. Białko HE4 (human epididymis protein 4) jest glikoproteiną, która bierze udział w wielu fizjologicznych i patologicznych procesach ludzkiego organizmu. Oprócz licznych zdrowych tkanek (np. nerek, płuc, tarczycy) ekspresję tego białka wykryto w wielu patologicznych liniach komórkowych, m.in. nowotworach jajnika, śluzówki macicy, płuc, okrężnicy. Jednak wszyscy autorzy są zgodni, że największa ekspresja występuje w nabłonkowych rakach jajnika [1]. W ostatnich latach ukazały się prace sugerujące, że białko HE4 pełni rolę w predykcji raka endometrium. Opublikowano dane, z których wynika, iż istnieje statystycznie znamienny wzrost stężenia HE4 wraz ze wzrostem zaawansowania tego nowotworu wg FIGO, w zależności od stopnia złośliwości histopatologicznej, głębokości naciekania endometrium i obecności przerzutów do węzłów chłonnych. Ponadto sugeruje się dodatnią korelację pomiędzy przedoperacyjnym stężeniem HE4 i stopniem zaawansowania wg FIGO [2]. W oznaczaniu stężeń HE4 badacze widzą szansę na przedoperacyjną identyfikację pacjentek z głębokością naciekania myometrium powyżej 50% grubości, a więc chorych, u których warto rozważyć wykonanie limfadenektomii miedniczej [3]. Przydatność kliniczna białka HE4 u kobiet z rakiem endometrium wymaga jednak dalszych badań. Te właśnie wątpliwości dotyczące rze- 43

GinPolMedProject 3 (45) 2017: 043-048 czywistego zachowania się stężenia białka HE4 u chorych z rakiem endometrium stanowią podstawę podjęcia próby ich wyjaśnienia. Wciąż pozostaje wyzwaniem medycyny posiadanie wiarygodnego diagnostycznego narzędzia klinicznego pozwalającego w sposób szybki, nieinwazyjny i pewny wysunąć podejrzenie tego nowotworu, aby szybko rozpocząć leczenie. Pomimo dużego postępu wiedzy medycznej na ten temat, wciąż wiele pytań pozostaje bez odpowiedzi, co inspiruje do prowadzenia pogłębionych badań nad tym zagadnieniem. CEL GŁÓWNY Celem głównym pracy była ocena stężeń białka HE4 u kobiet z rakiem endometrium oraz odniesienie uzyskanych wyników do kobiet zdrowych w tym samym wieku. MATERIAŁ I METODYKA Badaniom poddano ogółem 100 kobiet. Grupę badaną stanowiło 50 kobiet z rozpoznanym rakiem endometrium, do grupy kontrolnej włączono 50 zdrowych kobiet, w porównywalnym wieku, uczęszczających na regularne wizyty do Poradni Ginekologiczno-Położniczej. Wszystkie kobiety z grupy badanej były hospitalizowane i leczone operacyjnie w Oddziale Klinicznym Ginekologii, Położnictwa i Ginekologii Onkologicznej w Bytomiu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego. Dla wszystkich kobiet z grup badanych przeanalizowano na podstawie dokumentacji medycznej wywiad lekarski i przebieg choroby od rozpoznania do zakończenia leczenia w klinice. Z badań wyłączono kobiety chore na jakiekolwiek przewlekłe choroby spoza układu płciowego (szczególnie choroby nerek i wątroby), palące papierosy, spożywające alkohol. Wyłączono z badań kobiety podające w okresie rozrodczym nieregularne i nieprawidłowe miesiączki. Kryterium wyłączenia z badań było także BMI poniżej 18,5 kg/m 2 lub powyżej 30 kg/m 2. Na wykonanie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach (Uchwała KNW/0022/KB1/115/13 z dnia 19.11.2013r.). Wszystkie pacjentki zostały wyczerpująco poinformowane o celu badań i wyraziły pisemną zgodę na uczestnictwo. Badania wchodziły w zakres pracy statutowej realizowanej w Katedrze i Oddziale Klinicznym Ginekologii, Położnictwa i Ginekologii Onkologicznej w Bytomiu w ramach działalności naukowo-badawczej SUM w Katowicach. Próbki krwi w ilości około 5 ml były pobierane u pacjentek z grup badanych w okresie przedoperacyjnym do suchych probówek na skrzep. U kobiet z grupy kontrolnej krew pobierano jednorazowo w trakcie rutynowej diagnostyki w Poradni Ginekologiczno-Położniczej. Niezwłocznie po pobraniu próbki krwi zostały odwirowane, a uzyskana surowica była przechowywana w temperaturze -70 C do chwili przeprowadzenia oznaczeń. Oznaczenia zostały wykonane metodą immunoenzymatyczną przy użyciu komercyjnych testów do ilościowego oznaczania HE4 w surowicy ludzkiej. Wszystkie oznaczenia wykonano w Katedrze i Zakładzie Farmakologii Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Do analizy statystycznej wykorzystany został program Statistica 10.0 (StatSoft Inc., 2011). Wyniki dla zmiennych na skali nominalnej przedstawiono za pomocą tablic częstości. W przypadku zmiennych ilościowych wyliczono podstawowe miary statystyki opisowej: średnią arytmetyczną, medianę, kwartyle oraz odchylenie standardowe. Zgodność rozkładu zmiennych z rozkładem normalnym badano przy wykorzystaniu testu Shapiro-Wilka. Ponieważ rozkłady (w tym kluczowego parametru HE4) odbiegały istotnie od rozkładu normalnego do weryfikacji hipotez wykorzystano metody nieparametryczne. W przypadku porównań międzygrupowych skorzystano z testu U Manna-Whitneya (w przypadku dwóch grup porównawczych), testu ANOVA rang Kruskala-Wallisa wraz z testem post-hoc Dunna (dla więcej Tab. 1. Stężenia białka HE4 [pmol/l] oraz białka CA125 [U/ml] (mediana, średnia ± odchylenie standardowe) w grupie badanej w okresie przedoperacyjnym oraz w grupie kontrolnej Grupa badana N=50 Grupa kontrolna N=50 HE4 [pmol/l] 55,5 a) 22,5 75,9 ± 50,2 23,1 ± 5,1 CA125 [U/ml] 42,7 b) 17,2 42,7 ± 19,8 17,2 ± 10,5 a) p<0,000001 w porównaniu z grupą kontrolną b) p=0,00009 w porównaniu z grupą kontrolną 44

A. Brenk et al. Stężenie białka HE 4 u kobiet z rakiem endometrium niż dwóch grup) lub w przypadku zmiennych jakościowych testu chi-kwadrat. Do porównań wartości parametrów zmierzonych przed i po zabiegu operacyjnym użyto testu kolejności par Wilcoxona. Analizę korelacyjną wykonywano za pomocą współczynnika korelacji rang Spearmana. Założono poziom istotności α=0,05. Za istotne statystycznie uznawano wyniki, gdy wyliczone prawdopodobienstwo testowe p spełniało nierówność p<0,05. WYNIKI Wstępne wyniki przedstawiono w tabeli 1. oraz na rycinach 1 5. Średni wiek badanych w grupie kobiet z rakiem endometrium wynosił 63,7 ± 9,0 lat, a w grupie kontrolnej 55,3 ± 7,1 lat. Nie stwierdzono różnic statystycznie istotnych pomiędzy wiekiem a grupami pacjentek. Średnie stężenie białka HE4 jest u zdrowych kobiet znamiennie statystycznie niższe w porównaniu Ryc. 1. Zależność pomiędzy stężeniem HE4 [pmol/l] u kobiet z rakiem endometrium a przedoperacyjnym stężeniem krwinek czerwonych [mg/dl] do kobiet z rakiem endometrium (p=0,000000) (tab. 1.). Ponadto stężenie HE4 u kobiet z rakiem endometrium rośnie wraz z głębokością naciekania endometrium opisaną w badaniu histopatologicznym. W grupie badanej oraz kontrolnej zbadano także stężenia białka CA125. Stężenie białka CA125 jest znamiennie statystycznie niższe w grupie kontrolnej zdrowych kobiet (17,2 U/ml) w porównaniu do kobiet chorujących na raka endometrium (42,7 U/ml; p=0,00009) (tab. 1). Przeanalizowano czynniki mogące mieć wpływ na stężenie HE4 w badanych grupach kobiet. W grupie pacjentek z rakiem endometrium znaleziono kilka korelacji liniowych pomiędzy stężeniem HE4 a parametrami biochemicznymi pobieranymi zarówno przed, jak i po leczeniu operacyjnym. Zależności te ilustrują ryciny 1 5. DYSKUSJA W ostatnich latach pojawiło się kilka doniesień dotyczących oceny przydatności białka HE4 u kobiet z rakiem endometrium. Mimo, iż jest to nowotwór dający stosunkowo wczesne objawy, a więc rozpoznawany u wielu pacjentek we wczesnym stadium zaawansowania, do tej pory nie ma żadnego markera nowotworowego wprowadzonego do praktyki klinicznej, który byłby specyficzny dla raka endometrium [4]. W literaturze istnieją doniesienia dotyczące przydatności różnych markerów surowiczych w raku błony śluzowej macicy, takich jak: CEA, CA72.4, CA19.9, CA15.3, M-CSF oraz czasem używanego do tego celu CA125, jednak markery te wykazują zwiększoną ekspresje tylko u 20 30% pacjentek [5]. Znalezienie takiego mar- Ryc. 2. Zależność pomiędzy stężeniem HE4 [pmol/l] u kobiet z rakiem endometrium a przedoperacyjnym stężeniem potasu [mmol/l] Ryc. 3. Zależność pomiędzy stężeniem HE4 [pmol/l] u kobiet z rakiem endometrium a różnicą stężeń poi przedoperacyjnych INR 45

GinPolMedProject 3 (45) 2017: 043-048 kera jest szczególnie ważne u pacjentek z dużym ryzykiem rozwoju raka endometrium, jak i u tych które są dodatkowo obciążone występowaniem skrajnej otyłości, zespołem Lyncha lub leczonych tamoxyfenem z powodu raka sutka. U pozostałych chorych czuły marker dałby możliwość monitorowania terapii wspomagającej oraz pozwoliłby wcześnie przewidzieć nawroty. W ostatnich latach udowodniono, że białko HE4 pełni rolę w predykcji raka endometrium [6,7]. Zanotti i wsp. [2] opublikowali dane, z których wynika iż istnieje statystycznie znamienny wzrost stężenia HE4 wraz ze wzrostem zaawansowania tego nowotworu wg FIGO, w zależności od stopnia złośliwości histopatologicznej, głębokości naciekania endometrium i obecności przerzutów do węzłów chłonnych, co potwierdzili także inni autorzy [4,5,8-11]. Ponadto Zanotti i wsp. [2] przedstawili dodatnią korelację pomiędzy przedoperacyjnym stężeniem HE4 i stopniem zaawansowania wg FIGO. Wg Bignotti i wsp. [4] ocena wartości HE4 u pacjentek z rakiem endometrium może być użyteczna, jako proste, wczesne i wysoko efektywne narzędzie do selekcji pacjentek wysokiego ryzyka, u którym można zmodyfikować typowe leczenie wykonując rozszerzone wycięcie węzłów chłonnych lub stosując terapię dodatkową, taką jak rozszerzenie pól radioterapii czy chemioterapię ogólnoustrojową. Wyniki własne są zgodne z opisanymi wyżej, białko HE4 jawi się jako użyteczny marker w diagnostyce i przewidywaniu raka endometrium u kobiet. Opinię tę potwierdził Capriglione i wsp. [3], który w oznaczaniu stężeń HE4 widzi szanse na przedoperacyjną identyfikację pacjentek z głębokością naciekania myometrium powyżej 50% grubości, a więc chorych, u których war- to rozważyć wykonanie limfadenektomii miedniczej. Pozwoliłoby to kierować chore do odpowiednich ośrodków chirurgii onkologicznej [3]. Angioli i wsp. [12] zaproponowali na wzór algorytmu ROMA wprowadzenie do praktyki klinicznej w przypadkach raka endometrium algorytmu REM (risk of endometrial malignancy) obejmującego oznaczanie stężenia surowiczych markerów, badanie ultrasonograficzne oraz analizę objawów klinicznych. Celem nowego narzędzia ma być identyfikacja pacjentek z wysokim ryzykiem raka endometrium i ich skierowanie na leczenie do ośrodków mogących zaproponować chorym odpowiednią i optymalną terapię, a co za tym idzie poprawę wyników leczenia i redukcję kosztów. Z powyższych rozważań wynika, że oznaczanie stężeń HE4 u kobiet z rakiem endometrium może być przydatne w przedoperacyjnej kwalifikacji pacjentek do odpowiedniego leczenia operacyjnego nawet we wczesnym stadium zaawansowania choroby [2,3,5,13] oraz że HE4 jest najbardziej odpowiednim i wrażliwym markerem raka endometrium zidentyfikowanym do dnia dzisiejszego [8,13,14]. Przydatność kliniczna białka HE4 u kobiet z rakiem endometrium wymaga jednak dalszych badań, chociażby z powodu, iż nie ustalono jeszcze górnej granicy normy tego markera w tej jednostce chorobowej [3]. W badaniach własnych wykazano wpływ niektórych parametrów biochemicznych krwi na stężenie białka HE4. Stwierdzono liniową korelację dodatnią pomiędzy stężeniem erytrocytów a stężeniem HE4 w okresie przedoperacyjnym (ryc.1.). Analogiczna zależność została udowodniona dla potasu (ryc.2.). Trudno odnieść się do tych wyników, bowiem brak jeszcze w piśmiennictwie pełnego opracowania Ryc. 4. Zależność pomiędzy stężeniem HE4 [pmol/l] u kobiet z rakiem endometrium a różnicą poziomów po- i przedoperacyjnych hematokrytu [%] Ryc. 5. Zależność pomiędzy stężeniem HE4 [pmol/l] u kobiet z rakiem endometrium a różnicą stężeń poi przedoperacyjnych potasu [mmol/l] 46

A. Brenk et al. Stężenie białka HE 4 u kobiet z rakiem endometrium podobnych zależności. Wzrost stężenia potasu dodatnio korelujący ze wzrostem białka HE4 u kobiet z rakiem endometrium tłumaczyć może fakt, iż u kobiet starszych częściej dochodzi do osłabienia filtracji nerkowej [15]. Białko HE4 jest białkiem o niskiej masie cząsteczkowej, łatwo wiec jest wydalane przez nerki. Nagy i wsp. [16] wykazali statystycznie znaczący wzrost stężeń HE4 w różnych stadiach przewlekłej choroby nerek, proporcjonalny do spadku współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR). Wpływ nieprawidłowości pracy nerek na stężenie HE4 potwierdzili także Escudero i wsp. [17] wyraźnie sugerując, iż choroby nerek i wątroby zmieniają stężenie tego markera. Także Bolstad i wsp. [18] donoszą, że wpływ dysfunkcji nerek, a co za tym idzie zmienione stężenia kreatyniny w surowicy kobiet wpływają na stężenie białka HE4 stężenie HE4 rośnie proporcjonalnie do stężenia kreatyniny w surowicy krwi. Przy założeniu prawidłowego stężenia kreatyniny 50 µmol/l, już jej wzrost do 70 µmol/l pociąga za sobą o 12% wyższe stężenia HE4, dla stężenia kreatyniny 100 µmol/l wzrost HE4 następuje już o 27% [18]. Niewydolność nerek obecnie jest uważana za jeden z głównych czynników powodujących wzrost HE4 u kobiet bez choroby nowotworowej [17], schorzenie to wpływa w mniejszym stopniu na wartości CA125 [14], ale także może być źródłem fałszywie pozytywnych wyników innych markerów, takich jak antygen płaskonabłonkowy (SCC), S-100, ProGRP [17]. Wśród badanych pacjentek nie było pacjentek z niewydolnością nerek, stanowiło to jedno z kryteriów wyłączenia z badania. Wydaje się jednak, że pacjentki w wieku pomenopauzalnym mogą mieć nieco osłabioną filtrację nerkową związaną z wiekiem, jednak obserwacje te wymagają dalszych badań. U kobiet z niewydolnością nerek, u których w praktyce klinicznej posługujemy się wynikami HE4, należy stężenia tego markera interpretować ostrożnie, szczególnie, jeśli nieprawidłowe jest stężenie kreatyniny (wyższe niż 115 µmol/l lub 1,3 mg/dl) [17]. Jest to szczególnie ważne w przypadku monitorowania efektów leczenia nowotworów, bowiem leczenie uzupełniające może powodować trwałe uszkodzenie nerek lub przejściową ich dysfunkcję [19, 20]. WNIOSKI 1. Rak endometrium jest silnym bodźcem indukującym syntezę białek HE4 i CA125. Wyraźny wzrost ekspresji białka HE4 u kobiet z rakiem endometrium sugeruje, iż białko to może być poszukiwanym markerem nowotworowym raka endometrium, wyraźnie zależnym od głębokości naciekania endometrium. 2. U kobiet z rakiem endometrium na wzrost stężenia HE4 mogą mieć wpływ wyższe stężenia erytrocytów, INR oraz potasu. Sugeruje to większą wartość HE4 jako markera nowotworowego kobiet z rakiem endometrium bez schorzeń współistniejących. 1. Janosz I, Bodzek P, Partyka R i wsp. Ocena stężeń białka HE4 w poszczególnych trymestrach ciąży fizjologicznej. GinPolMedProject 2017;1,43:54-58. 2. Zanotti L, Bignotti E, Calza S et al. Human epididymis protein 4 as a serum marker for diagnosis of endometrial carcinoma and prediction of clinical outcome. Clin Chem Lab Med 2012;50,12:2189-2198. 3. Capriglione S, Plotti F, Miranda A et al. Utility of tumor marker HE4 as prognostic factor in endometrial cancer: a single-center controlled study. Tumour Biol 2015; 36,6: 4151-6. 4. Bignotti E, Ragnoli M, Zanotti L et al. Diagnostic and prognostic impact of serum HE4 detection in endometrial carcinoma patients. Br J Cancer 2011;104,1418-1425. 5. Angioli R, Plotti F, Capriglione S et al. The role of novel biomarker HE4 in endometrial cancer: a case control prospective study. Tumor Biol 2013;34:571-576. 6. Li J, Chen H, Mariani A et al. HE4 (WFDC2) promotes tumor growth in endometrial cancer cell lines. Int J Mol Sci 2013;14:6026-6043. 7. Moore RG, Brown AK, Miller MC et al. Utility of a novel serum tumor biomarker HE4 in patients with endometrioid adenocarcinoma of the uterus. Gynecol Oncol 2008; 110:196-201. 8. Omer B, Genc S, Takmaz O et al. The diagnostic role of human epididymis protein 4 and serum amyloid-a in early-stage endometrial cancer patients. Tumor Biol 2013; 34:2645-2650. 9. Brennan DJ, Hackethal A, Mann KP et al. Serum HE4 detects recurrent endometrial cancer in patients undergoimg routine clinical surveillance. BMC Cancer 2015; 15:33. 10. Antonsen SL, Hogdall E, Christensen IJ et al. HE4 and CA125 levels in the preoperative assessment of endometrial cancer patients: a prospective multicenter study (EN- DOMET). Acta Obstet Gynecol Scand 2013;92:1313-1322. 11. Kalogera E, Scholler N, Powless C et al. Correlation of serum HE4 with tumor size and myometrial invasion in endometrial cancer. Gynecol Oncol 2012;124:270-275. 12. Angioli R, Capriglione S, Aloisi A et al. REM (Risk of Endometrial Malignancy): a proposal for a new scoring system to evaluate risk of endometrial malignancy. Clin Cancer Res 2013;19:5733-5739. 13. Angioli R, Miranda A, Aloisi A et al. A critical review on HE4 performance in endometrial cancer: where are we now? Tumour Biol 2014;35:881-887. 14. Kappelmayer J, Antal-Szalmas P, Nagy Jr B. Human epididymis protein 4 (HE4) in laboratory medicine and an algorithm in renal disorders. Clinica Chimica Acta 2015;438:35-42. PIŚMIENNICTWO 47

GinPolMedProject 3 (45) 2017: 043-048 15. Moore RG, Miller MC, Eklund EE et al. Serum levels of the ovarian cancer biomarker HE4 are decreased in pregnancy and increase with age. Am J Obstet Gynecol 2012;206(4):349.e1-349.e7 16. Nagy Jr B, Krasznai ZT, Balla H et al. Elevated human epididymis protein 4 concentrations in chronic kidney disease. Ann Clin Biochem 2012;49:377-80. 17. Escudero JM, Auge JM, Filella X et al. Comparision of serum human epididymis protein 4 with cancer antigen 125 as a tumor marker in patients with malignant and non-malignant diseases. Clinical Chemistry 2011; 57,11: 1534-1544. 18. Bolstad N, Oijordsbakken M, Nustad K et al. Human epididymis protein 4 reference limits and natural variation in a Nordic reference population. Tumour Biol 2012; 33: 141-8. 19. Li P, Zhang X, Li T et al. Combined detection of sialic acid and hydroxyproline in diagnosis of ovarian cancer and its comparison with human epididymis protein 4 and carbohydrate antigen 125. Clinica Chimica Acta 2015; 439: 148-153. 20. Hertlein L, Stieber P, Kirschenhofer A et al. Human epididymis protein 4 (HE4) in benign and malignant diseases. Clin Chem Lab Med 2012;50:2181-2188. 48