Ocena stężeń białka HE4 w poszczególnych trymestrach ciąży fizjologicznej

GinPolMedProject 1 (43) 2017: 054-058 ARTYKUŁ ORYGINALNY Ocena stężeń białka HE4 w poszczególnych trymestrach ciąży fizjologicznej Iwona Janosz 1 (ACEF), Piotr Bodzek 1 (EFG), Robert Partyka 2 (ABE), Danuta Kokocińska 2 (DE), Anita Olejek 1 (DE) 1 Katedra Ginekologii, Położnictwa i Ginekologii Onkologicznej w Bytomiu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach 2 Katedra Anestezjologii, Intensywnej Terapii i Medycyny Ratunkowej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach STRESZCZENIE WKŁAD AUTORÓW: (A) Projekt badania (B) Zbieranie Danych (C) Analiza Statystyczna (D ) Interpretacja Danych (E ) Przygotowanie Rękopisu (F ) Gromadzenie Piśmiennictwa (G ) Gromadzenie Funduszy Wstęp. Białko HE4 jest obecnie używane jako marker dla raka jajnika z wyraźnie wyższą swoistością i specyficznością niż CA125. Do tej pory nie określono jednoznacznych wartości prawidłowych dla tego białka u kobiet ciężarnych. Celem pracy była ocena stężenia białka HE4 u kobiet ciężarnych w poszczególnych trymestrach ciąży oraz porównanie ich z grupą zdrowych kobiet nie będących w ciąży. Materiał i metoda. Badaniom poddano 59 kobiet w ciąży fizjologicznej w poszczególnych trymestrach ciąży, grupę kontrolną stanowiło 20 zdrowych kobiet nie będących w ciąży. Krew do badań pobierano w trakcie rutynowej diagnostyki klinicznej. Oznaczenia zostały wykonane wykorzystując zjawisko chemiluminescencji przy użyciu aparatu Architect firmy Abbott (USA). Uzyskane wyniki przedstawiono wykorzystując podstawowe parametry statystyki opisowej. Wyniki. Średni wiek badanych kobiet ciężarnych z ciążą fizjologiczną był porównywalny do wieku kobiet włączonych do grupy kontrolnej. Średnie stężenie HE4 u zdrowych kobiet nie będących w ciąży (grupa kontrolna) było znamiennie statystycznie niższe w porównaniu zarówno do kobiet ciężarnych ogółem, jak i w poszczególnych trymestrach ciąży. Stężenie HE4 w III trymestrze ciąży było statystycznie znamiennie wyższe niż u ciężarnych zarówno w I, jak i II trymestrze ciąży. Wnioski. Stężenie białka HE4 wzrasta wraz z rozwojem ciąży i jest wyższe niż u zdrowych kobiet nieciężarnych. Wzrost HE4 u kobiet ciężarnych należy brać pod uwagę w diagnostyce guzów przydatków w ciąży. HE4 może okazać się czynnikiem mogącym mieć wpływ na predykcję ciężkości schorzeń u ciężarnych. Badania nad rolą tego białka w ciąży wymagają jednak dalszych opracowań. Słowa kluczowe: HE4; ciąża; marker nowotworowy Adres do korespondencji: Iwona Janosz tel. 32-7861540, e-mail: ivjanosz@gmail.com Liczb słów: 1524 Tabele: 1 Ryciny: 5 Piśmiennictwo: 29 Received: 27.12.2016 Accepted: 15.02.2017 Published: 29.03.2017 WSTĘP Białko HE4 (human epididymis protein 4) jest małą, rozpuszczalną glikoproteiną, która bierze udział w fizjologicznych i patologicznych procesach organizmu. Białko HE4 zostało po raz pierwszy zidentyfikowane w 1991 roku przez Kirchhoffa i wsp. [1] w komórkach nabłonkowych dystalnej części najądrza. Początkowo uważano, ze jest jedynie inhibitorem proteaz zaangażowanych w proces spermatogenezy [2-4]. Białko HE4 jest produkowane przez zdrowe tkanki tchawicy, gruczołów ślinowych, płuc, tarczycy, nerek, przysadki mózgowej, okrężnicy, w tkance gruczołowej nabłonka żeńskiego narządu płciowego, piersi, najądrzy, nasieniowodu i prostaty [5-8]. Ekspresję tego białka wykryto w wielu patologicznych liniach komórkowych, m.in. nowotworowych liniach komórkowych śluzówki macicy, płuc, okrężnicy, piersi, nerek, żołądka, trzustki, w pierwotnym raku wątroby. Autorzy są zgodni, że największa ekspresja występuje w nabłonkowych rakach jajnika. Białko HE4 jest uważane za dobry marker dla raka jajnika z wyraźnie wyższą swoistością i specyficznością niż CA125 i lepszą wrażliwością dla rozróżnienia wczesnych postaci guzów złośliwych od łagodnych [7,9,10-13]. Jego przewaga nad CA125 wynika także z faktu, iż wykazuje mniejsze różnice związane z wiekiem pacjentek [14,15]. Marker ten nie tylko wykazuje wyższą czułość w diagnozowaniu raka jajnika niż CA125 [16], ale także wskazuje na nawrót choroby. Podczas 20. miesięcznej obserwacji wzrost jego stężenia w przypadkach wznowy choroby pojawia się wcześniej niż CA125 [6,17]. Ponadto stężenie HE4 może być prognostykiem przeżywalności chorych. Przeżywalność pacjentek z zaawansowanym rakiem jajnika ze znacznie podniesionymi stężeniami HE4 była krótsza niż kobiet z prawidłowymi wartościami [18]. Do chwili obecnej nie określono jednoznacznych wartości prawidłowych dla tego 54

I. Janosz et al. Ocena stężeń białka HE4 w poszczególnych trymestrach ciąży fizjologicznej białka u kobiet ciężarnych bez złośliwych i/lub łagodnych zaburzeń ginekologicznych. W piśmiennictwie nie ma także doniesień na temat ewentualnej roli tego białka w etiopatogenezie, predykcji i ustaleniu rokowania w patologiach ciąży. Celem pracy była ocena stężenia białka HE4 u kobiet ciężarnych w poszczególnych trymestrach ciąży oraz porównanie z grupą zdrowych kobiet nie będących w ciąży. MATERIAŁ I METODY Ryc. 1. Średnie stężenie HE4 [pmol/l] pomiędzy I trymestrem Badania przeprowadzono w okresie 01 stycznia 31 marca 2015 roku w Katedrze i Oddziale Klinicznym Ginekologii, Położnictwa i Ginekologii Onkologicznej w Bytomiu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego. Badaniom poddano łącznie 59 kobiet w ciąży fizjologicznej w poszczególnych trymestrach ciąży (I trymestr 20 ciężarnych, II trymestr 19 ciężarnych, III trymestr 20 ciężarnych). Grupę kontrolną stanowiło 20 zdrowych kobiet nie będących w ciąży w tym samym wieku. Pacjentki były rekrutowane spośród kobiet uczęszczających do poradni przyklinicznych. Krew do badań pobierano w trakcie rutynowej diagnostyki klinicznej. Pobieranie krwi do badań (ok. 5 ml objętości) przeprowadzano każdorazowo rano, na czczo, z żył zgięcia łokciowego. U kobiet grupy kontrolnej pobranie krwi odbywało się w tych samych warunkach. Krew po wytworzeniu się skrzepu odwirowywano, a uzyskaną surowicę przechowywano w temperaturze -70 o C do chwili przeprowadzenia oznaczeń. Wszystkie chore zostały poinformowane o celu badania i wyraziły pisemną zgodę na uczestnictwo. Na badania uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego. Oznaczenia zostały wykonane wykorzystując zjawisko chemiluminescencji przy użyciu aparatu Architect firmy Abbott (USA) w Zakładzie Immunodiagnostyki Klinicznej i Markerów Nowotworowych WSS Nr 5 im. Św. Barbary w Sosnowcu. Uzyskane wyniki przedstawiono wykorzystując podstawowe parametry statystyki opisowej. Zgodność rozkładu zmiennych z rozkładem normalnym sprawdzano testem Szapiro-Wilka. Do porównań pomiędzy grupami używano nieparametrycznych testów Kołmogorowa- Smirnowa i U Manna Whitney a. Do badania zmienności w obrębie grupy stosowano test ANOVA rang Kruskala-Wallisa. Za statystycznie znamienny przyjęto poziom istotności p<0,05. Do obliczeń wykorzystano program komputerowy STATISTICA. Ryc. 2. Średnie stężenie HE4 [pmol/l] pomiędzy II trymestrem Ryc. 3. Średnie stężenie HE4 [pmol/l] pomiędzy III trymestrem 55

GinPolMedProject 1 (43) 2017: 054-058 WYNIKI Średni wiek (29,5 ± 6,5 lat) badanych kobiet ciężarnych z ciążą fizjologiczną był porównywalny do wieku (27,9 ± 7,3 lat) kobiet grupy kontrolnej. W tabeli 1. przedstawiono średnie stężenia białka HE4 w grupie kobiet ciężarnych w poszczególnych trymestrach ciąży oraz w grupie kontrolnej. Średnie stężenie HE4 u zdrowych kobiet nie będących w ciąży (grupa kontrolna) wynosi 22,5 ± 11,8 pmol/l i jest znamiennie statystycznie niższe w porównaniu do kobiet ciężarnych ogółem, jak i w poszczególnych trymestrach ciąży (tab.1.). Stężenie HE4 w III trymestrze ciąży wynosi 48,9 ± 12,3 pmol/l i jest statystycznie znamiennie wyższe niż u ciężarnych zarówno w I trymestrze ciąży (38,0 ± 9,2 pmol/l), jak i II trymestrze ciąży (36,1 ± 6,1 pmol/l). Nie znaleziono różnic pomiędzy stężeniem HE4 pomiędzy I i II trymestrem ciąży u zdrowych ciężarnych. Uzyskane zależności prezentują ryciny 1-5. DYSKUSJA Dotychczas wykazano użyteczność białka HE4 jako markera do wykrycia i monitorowania raka jajnika. Szczególnie połączenie HE4 z CA125 aktualnie uważane jest za złoty standard diagnostyki biochemicznej dla tego nowotworu, poprawia wykrywalność różnych typów histologicznych oraz we wszystkich stadiach choroby [9,10]. Do tej pory nie określono jednoznacznych wartości prawidłowych dla tego białka u kobiet ciężarnych bez złośliwych i/lub łagodnych zaburzeń ginekologicznych. Moore i wsp. [19] badali stężenia HE4 w poszczególnych trymestrach ciąży i nie odnotowali istotnych statystycznie różnic w średnich stężeniach tego białka w zależności od trymestru ciąży i pomiędzy trymestrami. Jednak różnica pomiędzy drugim a trzecim trymestrem zbliżyła się do istotności statystycznej (p=0,059) odnotowano wzrost stężeń HE4 w surowicy pomiędzy drugim a trzecim trymestrem. Trend ten jest zgodny z wynikami badań własnych, gdzie także odnotowaliśmy znaczący wzrost stężeń HE4 w trymestrze III w porównaniu z trymestrem II. Ci sami autorzy odnotowali, iż wartości HE4 były znacząco niższe u kobiet w każdym trymestrze ciąży w porównaniu z nieciężarnymi kobietami przed menopauzą. Górną granicę normy stężenia białka HE4 u kobiet ciężarnych Moore i wsp. [19] ustalili na 49,6 pmol/l dla I trymestru ciąży fizjologicznej, 35,1 pmol/l dla II trymestru oraz 50,2 pmol/l dla III trymestru. Średnie stężenie u wszystkich kobiet ciężarnych niezależnie od trymestru wyniosło 49,7 pmol/ Ryc. 4. Średnie stężenie HE4 [pmol/l] pomiędzy I trymestrem ciąży a III trymestrem ciąży kobiet z ciążą fizjologiczną (p=0,01) Ryc. 5. Średnie stężenie HE4 [pmol/l] pomiędzy II trymestrem ciąży a III trymestrem ciąży kobiet z ciążą fizjologiczną (p=0,001) Tab. 1. Średnie stężenia białka HE4 [pmol/l] w grupie kobiet ciężarnych w poszczególnych trymestrach ciąży oraz w grupie kontrolnej Średnia ± SD [pmol/l] Łącznie ciężarne (n=59) I trymestr II trymestr (n=19) III trymestr Grupa kontrolna HE4 39,6 ± 10,0 a) 38,0 ± 9,2 a) 36,1 ± 6,1 a) 48,9 ± 12,3 a) b) c) 22,5 ± 11,8 a) p<0,001 w porównaniu do grupy kontrolnej; b) p=0,01 w porównaniu do I trymestru ciąży; c) p<0,001 w porównaniu do II trymestru ciąży 56

I. Janosz et al. Ocena stężeń białka HE4 w poszczególnych trymestrach ciąży fizjologicznej l. Podobne wnioski opublikowali Li i wsp. [20], którzy stwierdzili, iż surowicze stężenie HE4 u kobiet ciężarnych było statystycznie niższe niż u zdrowych nieciężarnych (43,0 vs 48,9 pmol/ l; p=0,007). Autorzy jednak nie badali stężeń HE4 w poszczególnych trymestrach ciąży [19]. Do odmiennych wniosków doszli Park i wsp. [14]: w ich badaniach obejmujących grupę 72 zdrowych ciężarnych. Średnie stężenie białka HE4 wyniosło 22,8 pmol/l (zakres 20,7 25,6 pmol/l) i było znamiennie statystycznie wyższe w porównaniu do zdrowych kobiet nie będących w ciąży (21,2; zakres 18,7 24,3 pmol/ l; p=0,0098). Badacze ci także nie oceniali stężeń HE4 w poszczególnych trymestrach ciąży. Wyniki Park i wsp. [14] są zgodne z wynikami badań własnych. W prezentowanym materiale udowodniliśmy znacząco wyższe stężenia HE4 zarówno wśród wszystkich ciężarnych, jak i w poszczególnych trymestrach w porównaniu do kobiet nie będących w ciąży (tab.1.). Podobnie do HE4 stężenia niektórych markerów nowotworowych (CA19-9, CA15-3, antygen karcynoembrionalny, antygen raka płaskonabłonkowego, mucynopodobny antygen raka) również wzrastają w ciąży [21, 22]. Stężenie CA125 wzrasta podczas ciąży, zwłaszcza podczas pierwszego trymestru, być może dlatego, że odgrywa rolę we wczesnym etapie rozwoju płodowego oraz powodem może być zwiększony klirens nerkowy u ciężarnych [14, 19,22,23]. Podczas ciąży CA125 występuje w stosunkowo wysokich stężeniach w komórkach doczesnej, płynie owodniowym i komórkach owodni, znacznie niższe stężenia występują we krwi pępowinowej. Sugeruje to, iż doczesna i komórki owodni, a nie płód produkują i wydzielają do płynu owodniowego cząsteczki tej glikoproteiny [22, 24]. Przeciwnie do CA125 inne markery nowotworowe podczas ciąży zmniejszają swoje stężenia (inhibina B, dehydrogenaza mleczanowa LDH), zaś wartości stężeń hormonu anty-mullerowskiego były podobne do stwierdzanych u kobiet nieciężarnych w fazie folikularnej i wykazywały tendencję do zmniejszania się wraz z rozwojem ciąży [22]. Znajomość prawidłowych stężeń markerów nowotworowych u kobiet ciężarnych ma niezwykle istotne znaczenie. Od lat sześćdziesiątych ubiegłego stulecia obserwuje się ciągły wzrost zachorowalności na nowotwory u kobiet ciężarnych [25], najczęściej stwierdza się raka piersi, szyjki macicy i nowotwory krwi [26]. Ciąża po leczeniu onkologicznym staje się coraz częściej spotykana, przede wszystkim z powodu rozwoju technik leczenia przeciwnowotworowego oszczędzających płodność kobiet oraz coraz lepszym rokowaniu chorych z nowotworami złośliwymi [22]. Sugerowany przez Moore i wsp. [19] spadek stężenia HE4 powoduje, że szczególnie u kobiet ciężarnych białko to jest wiarygodnym markerem raka jajnika, mogącym mieć użyteczność w diagnostyce torbieli i guzów miednicy u kobiet ciężarnych. CA125 może w tej grupie dostarczać wyników fałszywie dodatnich, w literaturze wykazano, że stężenia CA125 są wyższe u jednej czwartej kobiet w ciąży [14,27]. Wyniki stężeń HE4 uzyskane przez tego autora [18] wykazane przy pomocy testów HE4 EIA (Fujirebio Diagnostics Inc). Jednak, jak sam zauważa ten autor [19] oraz inni [11], obecnie jedynymi wiarygodnymi narzędziami do pomiaru stężenia HE4 są testy Roche and Abbott Diagnostics i wyniki uzyskane tymi testami są być może bardziej wiarygodne i powinny stanowić układ odniesienia. W oznaczeniach własnych, jak również w badaniach Park i wsp. [14], którzy podobnie, jak w naszych badaniach udowodnili wzrost HE4 w ciąży wykorzystano testy firmy Abbott (USA). W piśmiennictwie znajdują się pojedyncze prace traktujące o roli wybranych markerów nowotworowych podczas wybranych patologii ciąży. Fiegler i wsp. [28] po przebadaniu 200 kobiet z objawami poronienia zagrażającego pomiędzy 5. a 12. tygodniem ciąży stwierdzili wzrost stężenia CA125. W innych badaniach He i wsp. [29] stwierdzono wzrost stężeń dehydrogenazy mleczanowej LDH u kobiet ciężarnych z objawami stanu przedrzucawkowego i zespołu HELLP. Nie ma jednak doniesień traktujących o roli HE4 w patologiach ciąży. Zgodnie z aktualnym stanem wiedzy dokładna rola białka HE4 nie została całkowicie zbadana. Nasze wstępne wyniki, nawet jeżeli trudne do porównania z powodu braku podobnych wyników w literaturze, są interesujące i sugerują potencjalną rolę białka HE4, jako czynnika mogącego mieć wpływ na predykcję ciężkości schorzeń u kobiet ciężarnych. WNIOSKI Stężenia białka HE4 rosną wraz z rozwojem ciąży i są wyższe niż u zdrowych kobiet nieciężarnych. Wzrost HE4 u kobiet ciężarnych należy brać pod uwagę w diagnostyce guzów przydatków w ciąży. Białko HE4 może okazać się czynnikiem mogącym mieć wpływ na predykcję ciężkości schorzeń położniczych u ciężarnych, badania nad rolą tego białka w ciąży wymagają dalszych opracowań. 57

GinPolMedProject 1 (43) 2017: 054-058 PIŚMIENNICTWO 1. Kirchhoff C, Habben I, Ivell R et al. A major human epididymis-specific cdna encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors. Biol Reprod 1991,45:350-357. 2. Hua L, Liu Y, Zhen S et al. Expression and biochemical characterization of recombinant human epididymis protein 4. Protein Expression and Purification 2014,102:52-62. 3. Jiang SW, Chen H, Dowdy S et al. HE4 transcription - and splice variants - specific expression in endometrial cancer and correlation with patient survival. Int J Mol Sci 2013;14:22655-22677. 4. Jaszczyńska-Nowinka K. Ocena stężeń SDF1 i ekspresji jego receptora CXCR4 u chorych na raka jajnika. Rozprawa doktorska. Katedra Onkologii Klinika Onkologii Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Poznań 2011. 5. Galgano MT, Hampton GM, Frierson HF Jr. Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant human tissues. Modern Pathology 2006;19:847-853. 6. Kappelmayer J, Antal-Szalmas P, Nagy Jr B. Human epididymis protein 4 (HE4) in laboratory medicine and an algorithm in renal disorders. Clinica Chimica Acta 2015; 438:35-42. 7. Hertlein L, Stieber P, Kirschenhofer A et al. Human epididymis protein 4 (HE4) in benign and malignant diseases. Clin Chem Lab Med 2012;50:2181-2188. 8. Tokuishi K, Yamashita S, Ohbo K, et al. Splice variant HE4-V3 expression is associated with favorable prognosis in pulmonary adenocarcinoma. Tumor Biol 2012;33:103-109. 9. Moore RG, Miller MC, Steinhoff MM et al. Serum HE4 levels are less frequently elevated than CA125 in women with benign gynecologic disorders. Am J Obstet Gynecol, 2012, 206 (4): 351e1-351e8. 10. Escudero JM, Auge JM, Filella X et al. Comparision of serum human epididymis protein 4 with cancer antigen 125 as a tumor marker in patients with malignant and non-malignant diseases. Clinical Chemistry 2011; 57,11: 1534-1544. 11. Kulpa JK, Wójcik E, Rychlik U i wsp. HE4 i CA 125 porównanie metod oznaczeń. Diagnostyka Laboratoryjna 2012;48,1:41-49. 12. Yu S, Yang H, Xie S et al. Diagnostic value of HE4 for ovarian cancer: a meta-analysis. Clin Chem Lab Med 2012;50:1439-1446. 13. Kułak K, Polak G, Bednarek W et al. Wartość oznaczania HE4 we wczesnej diagnostyce raka jajnika. GinPolMed- Project 2013;4(30):52-57. 14. Park Y, Kim Y, Lee EY et al. Reference ranges for HE4 and CA125 in a large Asian population by automated assays and diagnostic performances for ovarian cancer. Int J Cancer 2012;130:1136-1144. 15. Anastasi E, Granato T, Coppa A et al. HE4 in the differential diagnosis of a pelvic mass: a case report. Int J Mol Sci 2011;12:627-632. 16. Michalak M, Gąsiorowska E, Nowak-Markwitz E. Wartość diagnostyczna CA125, HE4, ROMA oraz modelu regresji logistycznej w diagnostyce guzów miednicy mniejszej doświadczenia własne. Ginekol Pol 2015, 86: 256-261. 17. Anastasi E, Marchei GG, Viggiani V et al. HE4: a new potential early biomarker for the recurrence of ovarian cancer. Tumour Biol 2010, 31: 113-9. 18. Paek J, Lee SH, Yim GW et al. Prognostic significance of human epididymis protein 4 in epithelial ovarian cancer. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2011;158: 338-42. 19. Moore RG, Miller MC, Eklund EE et al. Serum levels of the ovarian cancer biomarker HE4 are decreased in pregnancy and increase with age. Am J Obstet Gynecol 2012; 206 (4): 349.e1-349.e7. 20. Li P, Zhang X, Li T et al. Combined detection of sialic acid and hydroxyproline in diagnosis of ovarian cancer and its comparison with human epididymis protein 4 and carbohydrate antigen 125. Clinica Chimica Acta 2015; 439:148-153. 21. Sarandakou A, Protonotariou E, Rizos D. Tumor markers in biological fluids associated with pregnancy. Crit Rev Clin Lab Sci 2007;44 (2): 151-178. 22. Han SN, Lotgerink A, Gziri MM et al. Physiologic variations of serum tumor markers in gynaecological malignancies during pregnancy: a systematic review. BMC Medicine 2012,10: 86-95. 23. Seki K, Kikuchi Y, Uesato T et al. Increased serum CA125 levels during the first trimester of pregnancy. Acta Obstet Gynecol Scand 1986; 65(6):583-585. 24. Sarandakou A, Kontoravdis A, Kontogeorgi Z, [et al.]. Expression of CEA, CA-125 nad SCC antigen by biological fluids associated with pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1992; 44: 215-220. 25. Stensheim H, Cvancarova M, Moller B et al. Pregnancy after adolescent and adult cancer: a population-based matched cohort study. Int J Cancer 2011;129:12235-1236. 26. Stensheim H, Moller B, van Dijk T et al. Cause-specific survival for women diagnosed with cancer during pregnancy or lactaction: a registry-based cohort study. J Clin Oncol 2009; 27: 45-51. 27. Halila H, Stenman UH, Seppala M. Ovarian cancer antigen CA125 levels in pelvic inflammatory disease and pregnancy. Cancer 1986;57: 1327-1329. 28. Fiegler P, Katz M, Kaminski K et al. Clinical value of a single serum CA-125 level in women with symptoms of imminent abortion during the first trimester of pregnancy. J Reprod Med 2003;48:982-8. 29. He S, Bremme K, Kallner A et al. Increased concentrations of lactate dehydrogenase in pregnancy with preeclampsia: a predictor for the birth of small-for-gestationalage infants. Gynecol Obstet Invest 1995;39:234-238. 58