Czas trwania: 1, 5 godz. Specjalność: TECHNOLOGIA ZYWNOŚCI Ćwiczenie 1. Temat: Charakterystyka mikroorganizmów wodnych (cz. I) Część teoretyczna 1) Grupy organizmów wodnych 2) Charakterystyka mikroorganizmów wodnych (cz. I bakterie i grzyby) 3) Grzyby wodne suplement (dołączony do konspektu) Część praktyczna 1) Izolacja, hodowla i identyfikacja różnych grup fizjologicznych bakterii wodnych 2) Izolacja i hodowla grzybów wodnych na podłożach sztucznych 3) Oznaczenie ilości grzybów mikroskopowych 4) Obserwacje mikroskopowe grzybów wodnych (z uwzględnieniem grzyba patogennego Candida albicans) wyhodowanych na podłożach sztucznych zestalonych agarem 1) Izolacja, hodowla i identyfikacja różnych grup fizjologicznych bakterii wodnych Materiał: woda rzeczna i źródlana; A. Wykrywanie bakterii amonifikacyjnych Azot występuje w wodach zanieczyszczonych i ściekach m.in. w postaci białka. Bakterie amonifikacyjne są grupą drobnoustrojów heterotroficznych, mających zdolność enzymatycznego rozkładu organicznych związków azotu, zwłaszcza aminokwasów, z wytworzeniem amoniaku (dezaminacja). Ich działalność w wodach powierzchniowych lub urządzeniach do biologicznego oczyszczania ścieków świadczy o zachodzącej mineralizacji organicznych połączeń azotowych. 1. Jałową pipetą (1cm 3 ) zaszczepić nierozcieńczoną wodą probówki z pożywka dla amonifikatorów, w której jedynym źródłem azotu jest pepton. 2. Po posiewie, w każdej probówce należy umieścić jałowy papierek wskaźnikowy nasycony odczynnikiem Krupa. 3. Po włożeniu papierków zabezpieczyć korki z waty kapturkami z folii aluminiowej i recepturkami. 4. Inkubować w temp. 26 C przez 7 dni. 5. Aby stwierdzić obecność wytworzonego amoniaku, będącego dowodem rozwoju bakterii amonifikacyjnych, bierze się pod uwagę zmianę barwy papierka wskaźnikowego na kolor różowy lub intensywnie czerwony oraz zmętnienie pożywki. 1
B. Wykrywanie bakterii denitryfikacyjnych Bakterie denitryfikacyjne wykorzystują azotany jako akceptory wodoru i elektronów, dzieki czemu redukują je enzymatycznie do azotynów, amoniaku, a nawet wolnego azotu. Należą one do bezwzględnych lub względnie beztlenowych heterotrofów. Przedstawicielami tej grupy są m.in. Thiobacillus denitryficans, Pseudomonas fluorescens oraz Micrococcus denitryficans. Azotany (NO 3 ) są bezpośrednio użyteczne jako pożywka dla roślin wodnych. Wysoki ich poziom może podwyższyć stopień eutrofizacji wody. 1. Przed wykonaniem posiewu należy rozpuścić zestalone w probówkach podłoża bulionowe z azotanami i ułożyć w pólskosy. 2. Po zastygnięciu podłoża dokonać posiewu i inkubować w temp. 28 C przez 7 dni. 3. Po okresie inkubacji na powierzchnię badanej hodowli nanieść 0,2-0,3 cm 3 odczynnika Griessa 4. Czerwone zabarwienie występuje w ciągu 1-5 min. Oznacza wynik dodatni i świadczy o obecności azotynów. Ujemny wynik testu nie zawsze dowodzi nieobecności bakterii denitryfikacyjnych, gdyż redukcja azotanów mogła już doprowadzić do powstania amoniaku lub nawet azotu elementarnego. Potwierdzeniem takiego przypuszczenia jest zanik azotanów dodanych do pożywki. 5. W celu sprawdzenia dalszej obecności lub braku azotanów, należy z prób, w których stwierdzono ujemny wynik testu, przenieść do czystej, porcelanowej parowniczki nieco zawartości probówki i dodać odrobinę sproszkowanego cynku, Pojawienie się czerwonego zabarwienia świadczy o obecności w pożywce nie rozłożonych azotanów (potwierdzenie wyniku ujemnego). Brak zabarwienia świadczy o wyniku dodatnim. C. Wykrywanie bakterii asymilujących wolny azot Bakterie asymilujące wolny azot są grupą heterotrofów wykorzystujących różne substraty organiczne jako źródła węgla i energii: cukry, wyższe alkohole, skrobię i kwasy organiczne. Zródlem azotu jest azot atmosferyczny, w związku, z czym rosną one na pożywakch bezazotanowych. Bakterie te są przeważnie bezwzględnymi tlenowcami. Przedstawicielami są m.in. Azotobacter i Azomonas agilis. Wody zawierające azot mogą być wykorzystywane do nawożenia. 1. Posiewać nierozcieńczone próbki (1 cm 3 ) do probówek zawierających po 10 ml płynnego podłoża z mannitolem. 2. Inkubować w temp. 28-30 C przez 7 dni. 3. Wyniki odczytywać na podstawie zmętnienia. 2
2) Izolacja i hodowla grzybów na podłożach sztucznych Materiał: woda rzeczna i źródlana; Wykonanie oznaczenia 1. Wykonać oznaczenia metodą płytkową Kocha, stosując posiew powierzchniowy (na podłoże agarowe wg Sabourauda) wody pobranej z odpowiedniego źródła. 2. Podpisać płytki Petriego (data, nr grupy, nr podgrupy, rodzaj badanego materiału, rozcieńczenie) 3. Posiewy wykonać z prób nierozcieńczonych oraz z rozcieńczeń 10 1. 4. Inkubacje prowadzić w temp. 26 C w ciągu 7 dni. 3) Oznaczenie ilości grzybów mikroskopowych Materiał: hodowle wyizolowanych grzybów pleśniowych (wyrosłych na podłożu wg Sabourauda); 1. Po okresie inkubacji policzyć kolonie grzybów wyrosłe na podłożu wg Sabourauda. Do określenia liczby kolonii wybrać płytki, na których wyrosło od 10 do 50 kolonii. 2. Wyniki badań wpisać do tabeli 1. W przypadku próbki rozcieńczonej, średnią liczbę grzybów w 1 cm 3 badanej wody uzyskuje się po wymnożeniu liczby kolonii wyrosłych na plytce przez odwrotność rozcieńczenia. 3. Wyciągnąć wnioski. Tabela 1. Zestawienie wyników analizy mikrobiologicznej wody liczba grzybów mikroskopowych Badana próba: Oznaczenie Warunki hodowli Liczba kolonii w ilości badanej próby (cm 3 ) Podłoże temp. próba rozcieńczenie i czas nierozcieńczona inkubacji Ogólna liczba agarowe 26 C grzybów wg 7 dni mikroskopowych Sabourauda Średnia liczba grzybów w 1 cm 3 Wnioski:... 3
4) Obserwacje mikroskopowe grzybów wodnych pleśniowych i drożdżopodobnych (z uwzględnieniem grzyba patogennego Candida albicans) wyhodowanych na podłożach sztucznych zestalonych agarem Materiał: kliniczne hodowle grzyba drożdżopodobnego Candida albicans oraz hodowle wyizolowanych grzybów pleśniowych (wyrosłych na podłożu wg Sabourauda); 1. W przypadku C. albicans wykonać barwienie fioletem krystalicznym. Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym wykonać rozmaz hodowli badanych drobnoustrojów. Preparat wysuszyć w powietrzu i utrwalić przeciągając szkiełko w płomieniu palnika. Powierzchnie preparatu zalać barwnikiem na 2 minuty. Po zlaniu fioletu preparat płukać bieżącą wodą. Preparat po wysuszeniu bibułą oglądać pod immersją. Wynik barwienia: komórki grzyba fioletowe. Ocenę preparatu C. albicans przeprowadzić przy zastosowaniu obiektywu immersyjnego mikroskopu. 2. W przypadku grzybów pleśniowych otworzyć płytkę Petriego i za pomocą lupy lub binokularu obserwować powierzchnię grzybów wyrosłych na zestalonych podłożach odżywczych. 3. Przygotować preparat mokry z kolonii grzybów pleśniowych. Na odtłuszczone szkiełko przedmiotowe nanieść kroplę płynu fizjologicznego, a następnie za pomocą ezy niedużą ilość grzybni wraz z zarodnikami (czynności te należy prowadzić bardzo delikatnie!), dodając 2 krople płynu Lugola. Po nakryciu szkiełkiem nakrywkowym obserwować pod małym, a następnie średnim powiększaniem. 4. Wyniki obserwacji wpisać do tabeli 2. Tabela 2. Zestawienie wyników analizy obserwacji mikroskopowych grzybów wodnych wyhodowanych na podłożach sztucznych zestalonych agarem Rodzaj grzyba wodnego (pow. mikroskopu) Charakter grzybni Barwa grzybni Kształt, rozmieszczenie zarodników mikroskopowa Budowa grzyba (schematyczny rysunek) charakter grzybni: zwarta, puszysta, filcowata, zamszowa, pojedyncze kolonie o postrzępionym brzegu, pojedyncze kolonie o gładkim brzegu itp. 4
Grzyby wodne suplement do części teroretycznej Część teoretyczna 1) Zagrożenia dla człowieka wynikające z obecności grzybów patogennych. Grzyby (Mycota) jest to zróżnicowana grupa organizmów. Nie można przeprowadzić wyraźnej granicy między grzybami wodnymi a lądowymi. W środowisku wodnym występują w postaci wegetatywnej plechy lub w postaci zarodników lub form przetrwanych. Grzyby pasożytnicze są często wprowadzane do naturalnych zbiorników wodnych wraz ze ściekami bytowo-gospodarczymi. Mogą atakować rośliny (także glony), zwierzęta, oraz stanowią zagrożenie dla człowieka. Wybrane grzyby chorobotwórcze dla człowieka Candida albicans Grzyby drożdżopodobne Jest to grzyb wywołujący kandydozę (bielnicę). Choroba ta, powodująca zakażenie błon śluzowych oraz skóry, może przebiegać bezobjawowo. Obniżenie odporności ustroju lub intensywne leczenie antybiotykami, powoduje nasilenie rozwoju grzyba i powstanie widocznych gołym okiem zmian w błonie śluzowej jamy ustnej i gardła, zakażenie narządów wewnętrznych prowadząc do poważnych komplikacji. Szczególnie niebezpieczne jest zakażenie u pacjentów hospitalizowanych oraz noworodków. Grzyby pleśniowe Patogenność grzybów jest wielokierunkowa. Mogą zakażać narządy wewnętrzne, skórę i paznokcie. Mają zdolność przenikania do tkanek narządów gospodarza (aspergilloza płuc). Mogą wystąpić wewnątrz oskrzeli lub w jamach pogruźliczych, powodując tzw. grzybniak płuc. Pewne grzyby działają jako czynnik alergizujący, odgrywając istotną rolę w patogenezie części przypadków dychawicy oskrzelowej, czy zapalenia skóry. Dokładna diagnostyka wymaga zróżnicowania grzybów pleśniowych na podstawie m.in. obserwacji cech morfologicznych w makro- i mikrohodowlach (określenie charakteru grzybni i narządów owocowania). 5
Grzyby pleśniowe wywołują: grzybice głębokie (narządowe, systemowe); do grzybów tych zaliczyć można: Aspergillus flavus, A. nidulans, A. niger, Rhizopus oryzae, Mucor sp.; zmiany skórne; do grzybów tych zaliczyć można: Cladosporium sp, Cephalosporium sp., Fusarium sp., Trichoderma sp., Aspergillus sp., Pecnicillium sp.; zatrucia powodowane przez toksyny grzybów (mykotoksyny)-może pojawić się masowa ekspansja grzybów pleśniowych w silosach w wyniku niedostatecznie regulowanych warunków temperatury i wilgotności produktu i otoczenia. Znanych jest kilkaset mykotoksyn. W Polsce największe znaczenie ze względu na częstotliwość występowania i możliwość spowodowania zatruć maja aflatoksyny, ochratoksynaa, cytrynina oraz patulina. Przegląd wybranych mykotoksyn Aflatoksyny to metabolity pleśni Aspergillus flavus. Pod względem chemicznym są związkami zawierającymi pierścień laktozowy połączony pierścieniem benzenowym z 2 pierścieniami furanowymi o masie ok. 300 Da. Rozpuszczalne są w roztworach wodnych, dyfundują przez błony biologiczne tkanek roślinnych i zwierzęcych (śluzówka, powierzchnia skóry), akumulują się w organizmie powodując jego zaburzenia oraz choroby wątroby, zatrucia nerek, krwawe wylewy do płuc i mózgu, a także choroby nowotworowe. OchratoksynaA jest metabolitem pleśni Aspergillus, zaś cytrynina pleśni Penicillium. Obie toksyny należą do nefrotoksyn, tj. związków uszkadzających nerki. Często pojawiają się na ziarnach zbóż (żyta, pszenicy) i w ich przetworach (mąka, kasza, pieczywo). Rozwijają się w środowisku wilgotnym, a zatem nie należy przechowywać ziaren w pomieszczeniach o zawartości wody większej niż 13%. Patulina wytwarzana jest przez wiele gatunków pleśni z rodzaju Penicillim, Aspergillus, czy Byssochlamys (saprofity występujące na owocach, warzywach, mięsie, serach, ziarnie zbóż i pieczywie). Łatwo reagują z białkami i kwasami nukleinowymi, są podatne na działanie enzymów trawiennych, co zmniejsza niebezpieczeństwo zatrucia pokarmowego. Wykazują działanie rakotwórcze dla człowieka, powodują zmiany w wątrobie, nerkach i w korze mózgowej. 6