ZAŁĄCZNIK NR 2 AUTOREFERAT

ZAŁĄCZNIK NR 2 AUTOREFERAT Dr n. med. Miłosz P. Kawa Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie Wydział Lekarski z ONWJA Ul. Rybacka 1 70-204 Szczecin Szczecin 2018

Załącznik nr 2 do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego 1. Dane osobowe: Imię i nazwisko: Miłosz Piotr Kawa Miejsce pracy: Zakład Patologii Ogólnej Katedra Fizjopatologii Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie Ul. Powstańców Wlkp. 72 70-111 Szczecin Dane kontaktowe: Zakład Patologii Ogólnej Katedra Fizjopatologii Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie Ul. Powstańców Wlkp. 72 70-111 Szczecin Tel. 91-466-15-46 Fax. 91-466-15-48 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej: 17.09.2002 Pomorska Akademia Medyczna, Wydział Lekarski, dyplom lekarza 16.09.2008 Pomorska Akademia Medyczna, Wydział Lekarski, uzyskanie stopnia doktora nauk medycznych na podstawie rozprawy doktorskiej: Rekrutacja endotelialnych komórek progenitorowych (EPC) do wątroby i jej efekty terapeutyczne w eksperymentalnym modelu ostrego uszkodzenia miąższu wątroby o podłożu immunologicznym, Promotor: Prof. dr hab. n. med. Bogusław Machaliński Recenzenci w przewodzie doktorskim: Prof. dr hab. Jacek Roliński (Lubelski Uniwersytet Medyczny) Prof. dr hab. Tadeusz Dębniak (Pomorski Uniwersytet Medyczny) 20.04.2018 Centrum Egzaminów Medycznych, Łódź, dyplom specjalisty w dziedzinie radiologii i diagnostyki obrazowej 3. a. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych: Doktorant, Studium doktoranckie na Wydziale Lekarskim w Zakładzie Patologii Ogólnej Katedry Fizjopatologii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie, 2003-2008r.; Asystent naukowo-dydaktyczny, Zakład Fizjologii, Katedra Fizjopatologii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie, 2008-2010r.; Strona 2

Asystent naukowo-dydaktyczny, Zakład Patologii Ogólnej, Katedra Fizjopatologii Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie, 2010-2011r.; Adiunkt naukowo-dydaktyczny, Zakład Patologii Ogólnej, Katedra Fizjopatologii Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie, od 01.10. 2011r. - obecnie; 3. b. Podsumowanie dorobku naukowego: Liczba wszystkich publikacji: 34 Liczba publikacji wchodzących w skład habilitacji: 4 Streszczenia konferencyjne: 54 Udział w projektach badawczych: a) Kierownik projektów NCN/MNiSW: 5 b) Lokalny Koordynator projektu o charakterze konsorcjum badawczego: 1 projekt badawczo-rozwojowy NCBiR: STRATEGMED; c) Wykonawca: 8, w tym 1 projekt międzynarodowy (HARMONIA) oraz 1 projekt strukturalny POIG: Innowacyjna Gospodarka; Promotor pomocniczy w przewodzie doktorskim: 1 Promotor prac magisterskich: 4 Recenzje dla czasopism: 1 Sumaryczny IF opublikowanych artykułów (JCR): 89,736 Sumaryczna punktacja KBN/MNiSW opublikowanych prac: 877 Liczba cytowań wg bazy Web of Science Core Collection: 199 Indeks Hirscha wg bazy Web of Science: 10 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U.2016 poz. 882 ze zm. W Dz. U. z 2016 poz. 1311.): a. Tytuł osiągnięcia naukowego Osiągnięciem naukowym będącym podstawą do wnioskowania o uzyskanie stopnia naukowego doktora habilitowanego jest cykl publikacji powiązanych tematycznie pod tytułem: Strona 3

Ocena aktywności biologicznej krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych w wybranych chorobach gruczołów wydzielania wewnętrznego u ludzi Opracowanie wydzielonego zagadnienia jest indywidualnym wkładem w naukę dotyczącym roli wybranych hormonów w regulacji ludzkiej hematopoezy ustalonej na podstawie oceny aktywności biologicznej ludzkich krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych w określonych chorobach gruczołów wydzielania wewnętrznego u ludzi, mogących stanowić modelowe warunki in vivo dla oceny regulacji hormonalnej mechanizmów komórkowych kluczowych dla ludzkiej hematopoezy. b. Autorzy, tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa, recenzent wydawniczy: 1. Miłosz P. Kawa, Katarzyna Grymuła, Edyta Paczkowska, Magdalena Baśkiewicz- Masiuk, Elżbieta Dąbkowska, Monika Koziołek, Maciej Tarnowski, Patrycja Kłos, Violetta Dziedziejko, Magdalena Kucia, Anhelli Syrenicz, Bogusław Machaliński. Clinical relevance of thyroid dysfunction in human haematopoiesis : biochemical and molecular studies. Eur. J. Endocrinol. 2010;162(2):295-305. Impact Factor: 3,482; punktacja MNiSW: 27 2. Miłosz P. Kawa, Bogusław Machaliński. Hematopoiesis dysfunction associated with abnormal thyroid hormones production. Tytuł książki: Thyroid disorders: focus on hyperthyroidism. Wydawnictwo: InTech, Rijeka; Rok wydania: 2014. Strony: 181-205. Recenzent wydawniczy: Gonzalo Diaz Soto. Punktacja MNiSW: 5 3. Miłosz P. Kawa, Iwona Stecewicz, Katarzyna Piecyk, Ewa Pius-Sadowska, Edyta Paczkowska, Dorota Rogińska, Anna Sobuś, Karolina Łuczkowska, Elżbieta Gawrych, Elżbieta Petriczko, Mieczysław Walczak, Bogusław Machaliński. Effects of growth hormone therapeutic supplementation on hematopoietic stem/progenitor cells in children with growth hormone deficiency: focus on proliferation and differentiation capabilities. Endocrine. 2015;50(1):162-175. Impact Factor: 3,279; punktacja MNiSW: 25 4. Miłosz P. Kawa, Iwona Stecewicz, Katarzyna Piecyk, Edyta Paczkowska, Dorota Rogińska, Anna Sobuś, Karolina Łuczkowska, Ewa Pius-Sadowska, Elżbieta Gawrych, Elżbieta Petriczko, Mieczysław Walczak, Bogusław Machaliński. The impact of growth hormone therapy on the apoptosis assessment in CD34+ hematopoietic cells from children with growth hormone deficiency. Int. J. Mol. Sci. 2017;18(1)111:21. Impact Factor: 3,226; punktacja MNiSW: 30 Strona 4

Łączna wartość bibliometryczna wybranych publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe: Sumaryczny współczynnik oddziaływania (IF) wg bazy Journal of Citation Reports (JCR) 9,987 punktów Punktacja KBN/MNiSW 87 punktów c. Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania: Opis osiągnięcia naukowego: Podstawę rozprawy habilitacyjnej tworzy cykl czterech publikacji, w tym trzech oryginalnych oraz jednej przeglądowej, które stanowią uzupełnienie obecnego stanu wiedzy na temat roli czynników hormonalnych w regulacji aktywności biologicznej ludzkich krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych, z każdorazowym szczególnym uwzględnieniem regulacji cyklu komórkowego oraz indukcji procesu proliferacji i apoptozy komórkowej. Przedstawione do oceny dorobku w postępowaniu habilitacyjnym publikacje są wynikiem pracy naukowej wykonanej w toku realizacji dwóch odrębnych projektów badawczych finansowanych przez Narodowe Centrum Nauki i zrealizowanych w Zakładzie Patologii Ogólnej Katedry Fizjopatologii PUM w Szczecinie. Autor habilitacyjnego cyklu publikacji był kierownikiem jednego projektu oraz głównym wykonawcą drugiego projektu badawczego NCN. Wprowadzenie: W ciągu ostatnich kilku dekad, wpływ substancji biologicznie czynnych na proces regulacji ludzkiej hematopoezy i jego konsekwencje dla zdrowia człowieka były przedmiotem licznych badań. Wiodącym celem naukowym prezentowanego cyklu publikacji było pogłębienie wiedzy na temat roli hormonów w złożonym procesie ludzkiej hematopoezy czyli rozwoju komórek krwi, ze szczególnym uwzględnieniem dwóch typów hormonów o odmiennym mechanizmie działania, tj. hormonów tarczycy oraz hormonu wzrostu. Oprócz aspektów poznawczych, wyniki omawianych badań mogą mieć zastosowanie praktyczne, ponieważ nieprawidłowa aktywność procesu hematopoezy na tle możliwych zaburzeń hormonalnych rodzi poważne implikacje kliniczne, zarówno w okresie dziecięcym, jak również u osób dorosłych. Strona 5

Komórki krwi obwodowej produkowane są w mikrośrodowisku szpiku kostnego. Ciągłość krwiotworzenia zapewniają krwiotwórcze komórki macierzyste (KKM) znajdujące się w tzw. niszach hematopoetycznych szpiku kostnego. Komórki te mają zdolność zarówno samoodnawiania jak i różnicowania się w kierunku krwiotwórczych komórek ukierunkowanych (KKU) należących do różnych szeregów hematopoetycznych. Powstałe z KKM krwiotwórcze komórki ukierunkowane proliferują, tworząc klony komórek dojrzewających i dojrzałych, które stopniowo opuszczają szpik kostny przechodząc do krwi obwodowej. Na proliferację i metabolizm populacji KKM i KKU oddziałują różne cytokiny i czynniki troficzne zarówno stymulujące jak i hamujące ich wzrost. Czynniki te są wydzielane zarówno miejscowo w niszy tkankowej przez komórki podścieliska szpiku kostnego lub właściwe komórki krwiotwórcze oraz w niektórych przypadkach, jak np. erytropoetyna, przez komórki odległych narządów (nerka, wątroba) i z krwią docierają do szpiku kostnego. Jednakże istnieją przesłanki w literaturze naukowej, że w proliferacji i różnicowaniu, a także w regulacji cyklu komórkowego oraz zaprogramowanej śmierci komórek krwiotwórczych, pewną rolę mogą odgrywać hormony wydzielane przez układ gruczołów dokrewnych (przysadka, tarczyca, kora i rdzeń nadnerczy, gonady, trzustka), które z krwią również docierają do szpiku kostnego. Dowody te poparte są obserwacjami klinicznymi, że wiele typów zaburzeń endokrynologicznych wynikających zarówno z niedoboru jak i nadmiaru określonych hormonów w organizmie człowieka współwystępuje łącznie z nieprawidłowymi parametrami hematologicznymi krwi obwodowej u ludzi. W ostatnich latach dzięki przeprowadzonym badaniom podstawowym o charakterze in vitro znacznie poszerzył się zakres dostępnej wiedzy na temat roli wybranych hormonów oraz możliwych mechanizmów ich wpływu na wzrost, różnicowanie się i metabolizm dojrzałych komórek krwi tworzących poszczególne szeregi hematopoetyczne. Jednak fizjologiczna rola i efekty biologiczne oddziaływania hormonów na komórki macierzyste i progenitorowe krwiotworzenia w niszach hematopoetycznych szpiku nie są ostatecznie poznane i wymagają intensywnych badań o charakterze klinicznym i pre-klinicznym. Do tej pory nie rozstrzygnięto ostatecznie czy zaburzenia funkcji układu krwiotwórczego obserwowane w określonych zaburzeniach endokrynologicznych człowieka są skutkiem pośrednim wynikającym z hormonalnych zaburzeń ogólnoustrojowych czy też są efektem bezpośredniej interakcji hormonów z ludzkimi krwiotwórczymi komórkami macierzystymi. Pytania wokół przyczyny częstego występowania nieprawidłowych parametrów hematologicznych wykrywanych w różnych stanach charakteryzujących się zaburzonym wydzielaniem hormonów z gruczołów dokrewnych stały się dla mnie inspiracją do badań nad procesami bezpośredniej regulacji procesu krwiotworzenia przez hormony na poziomie molekularnym i do poszukiwania potencjalnych patomechanizmów odpowiedzialnych za obserwowane zaburzenia parametrów hematologicznych krwi obwodowej, które mogą być indukowane już we wczesnych stadiach rozwojowych szeregów krwiotwórczych zlokalizowanych w niszach hematopoetycznych szpiku kostnego. Strona 6

Badania zawarte w publikacjach stanowiących osiągnięcie naukowe zostały podzielone na dwie części: a) Pierwszy etap obejmował zbadanie molekularnych aspektów wpływu hormonów tarczycy na regulację hematopoezy w warunkach in vivo u pacjentów z zaburzeniami gruczołu tarczowego pod postacią jego nadczynności i niedoczynności. b) Drugi etap obejmował ocenę efektów biologicznych niedoboru hormonu wzrostu na regulację hematopoezy w warunkach in vivo u pacjentów w wieku rozwojowym z somatotropinową niedoczynnością przysadki prowadzącą do przewlekłego niedoboru hormonu wzrostu oraz ocenę wpływu na komórki krwiotwórcze hormonu wzrostu w przebiegu terapeutycznej suplementacji. Omówienie głównych wyników badań uzyskanych w każdym z dwóch etapów pracy naukowej: 1. Rola hormonów tarczycy w regulacji ludzkiej hematopoezy w warunkach in vivo Pierwszy kierunek badawczych związany jest z oceną wpływu hormonów tarczycy na funkcję krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych u pacjentów z niedoczynnością tarczycy oraz u pacjentów z nadczynnością tarczycy został przedstawiony w 2 publikacjach (publikacji nr 1 i nr 2), które są rezultatem zbiorczych analiz wyników otrzymanych przed oraz podczas realizacji grantu NCN (nr NN402 476237) pt. Wpływ hormonów tarczycy na regulację hematopoezy u pacjentów z zaburzeniami gruczołu tarczowego pod postacią hipo- i hipertyroidyzmu, którego byłem kierownikiem. Gruczoł tarczowy naturalnie wytwarza dwa hormony (tj. 3, 3, 5, 5 -czterojodotyroninę (T4) i 3, 3, 5-trijodotyroninę (T3)). Produkcja hormonów tarczycy jest uzależniona od stałej podaży jodu w diecie. T4 stanowi 85% produkowanych przez tarczycę hormonów, która krąży we krwi w postaci związanej z białkami i jest biologicznym pro-hormonem dla T3. Pod wpływem enzymu dejodynazy, która odszczepia cząsteczkę jodu, następuje konwersja T4 do T3, która jest głównym, biologicznie czynnym hormonem tarczycy, działającym na poziomie komórek efektorowych [1]. HT wiążąc się ze specyficznymi receptorami jądrowymi (thyroid hormone receptors, TR) indukują w jądrze komórkowym transkrypcję genów wrażliwych na działanie HT dzięki aktywacji domeny DNA w regionach promotorów genowych, tzw. sekwencji odpowiedzialnej za odpowiedź hormonów tarczycy (thyroid-hormone response elements, TRE). Interakcja kompleksu hormon-receptor z TRE może inicjować lub blokować proces transkrypcji materiału genetycznego kodującego komórkowe białka strukturalne i regulatorowe. Ustalono, że hormony tarczycy mogą aktywować transkrypcję genów dla np. hormonu wzrostu, mieliny, dejodynazy typu 1 oraz niektórych białek odpowiedzialnych za różnicowanie komórek mięśniowych. HT mogą również hamować transkrypcję genów dla innych składników osi regulacyjnej podwgórze-przysadka-tarczyca takich jak tyreoliberyna (TRH), tyreotropina (TSH), dejodynaza typu 2, czy czynnik transkrypcyjny E2F1, będący ważnym regulatorem cyklu komórkowego [1]. Istnieją dwie grupy TR określanych jako typ α i β, a każdy z receptorów posiada dwie izoformy: TRα1 i 2 oraz TRβ1 i 2, powstające na drodze alternatywnego składania mrna. Każda z izoform TR wykazuje tkankowo-specyficzną ekspresję [1]. Wysoką ekspresję TRα1 na poziomie mrna i białka stwierdzono m.in. w mózgu Strona 7

czy mięśniach szkieletowych oraz mięśniu sercowym, podczas gdy TRβ1 wykazuje dominującą ekspresję w wątrobie i nerkach. Jednakże, obie izoformy receptora TRα1 i TRβ1 wykazują dość szeroką dystrybucję tkankową w organizmie obejmującą np. wątrobę, nerki, mózg i serce. Przeciwnie, konstytutywna ekspresja TRβ2 jest ograniczona jedynie do niektórych rejonów centralnego układu nerwowego jak hipokamp oraz przysadka mózgowa. Natomiast izoforma TRα2 jest nieaktywną formą TR, niezdolną do wiązania HT, ale zaobserwowano, że samodzielnie forma ta działa jako inhibitor aktywności innych izoform TR [1]. Dotychczas opisano wiele różnych aspektów odnoszących się do HT jako czynników niezbędnych do utrzymania skoordynowanego rozwoju organizmu, różnicowania tkanek i utrzymania homeostazy a także podstawowej przemiany materii. Hormony tarczycy są HT są zaliczane do elementarnych czynników biologicznych, które modulują podstawowe procesy biologiczne związane z rozwojem i funkcją komórek i tkanek, jak proliferacja, różnicowanie oraz zaprogramowana śmierć komórek w wielu tkankach organizmu. Funkcje tkankowe HT od lat stanowiły przedmiot wielu badań, dlatego dość dokładnie poznany jest efekt fizjologiczny ich działania m.in. na układ nerwowy, skórę, układ kostny czy układ rozrodczy. Z piśmiennictwa również wiadomo, że HT w istotny sposób wpływają na układ krążenia, a jeden z mechanizmów ich działania oparty jest na bezpośrednim oddziaływaniu HT na komórki mięśnia sercowego w mechanizmie receptorowym. Ponadto ustalono, że HT wywołują zmiany objętości krwi krążącej oraz wpływają na wielkość oporu obwodowego poprzez oddziaływanie na mięśniówkę gładką w ścianach naczyń, a także zwiększają zapotrzebowanie na tlen w tkankach obwodowych [2]. Pomimo intensywnych prac dotyczących wpływu HT na różnorodne procesy przebiegające w stanie zdrowia i choroby, wiele elementów pozostaje jednak nie do końca wyjaśnionych. Jednym z takich zagadnień jest ustalenie wpływu HT na proces regulacji ludzkiej hematopoezy w stanach zdrowia i choroby. Powszechnie uważa się, że HT mają potencjalny wpływ na przebieg krwiotworzenia. Postuluje się, iż działanie HT na erytropoezę szpikową może przebiegać dwoma sposobami. Z jednej strony poprzez wpływ na tkankową przemianę materii, z innej strony poprzez stymulację produkcji i wydzielania erytropoetyny (EPO) w nerkach, co wpływa na wzrost linii erytroidalnej. Jednakże w pojedynczych doniesieniach wykazywano stymulujący wpływ HT na proces erytropoezy prowadzonej w warunkach in vitro [3]. Periin i współpr. potwierdzili funkcję hormonów tarczycy w procesie proliferacji izolowanych komórek progenitorowych linii erytroidalnej, zwłaszcza istotny dla wczesnych prekursorów erytroblastycznych, zarówno w badaniach hematopoezy u myszy jak i u człowieka [4]. Interesujący jest fakt, że w badaniach in vitro nie obserwowano wyraźnego wpływu hormonów tarczycy na wzrost kolonii granulocytowo-monocytowych [5]. Powyższe kontrowersje na temat odmiennego wpływu HT na różne szeregi rozwojowe ludzkiej hematopoezy, wynikające z dotychczasowych badań prowadzonych głównie w warunkach in vitro, stały się inspiracją moich badań nad patofizjologiczną rolą hormonów tarczycy w organizmie człowieka w warunkach nieprawidłowej ich produkcji i zaburzeń ich wydzielania in vivo. Zaburzenia funkcji gruczołu tarczowego należą do najczęstszych chorób układu endokrynnego i mogą przebiegać w postaci niedoczynności lub nadczynności. Według danych statystycznych szczyt zapadalności przypada na 30-50 rok życia. Częściej występują u Strona 8

kobiet niż mężczyzn. Szacuje się, że nawet ok. 30-40% populacji ogólnej cierpi na choroby tarczycy. U kilkunastu milionów występuje wole endemiczne, a corocznie odnotowuje się ok. 600 nowych zachorowań na raka tarczycy w Polsce. Podstawowe dysfunkcje tarczycy rozwijające się na pierwotnym lub wtórnym podłożu można podzielić na niedoczynności oraz zaburzenia charakteryzujące się zwiększoną aktywnością syntezy HT na tle nadczynności gruczołu tarczowego, co prowadzi do nadmiaru HT w organizmie. U chorych z niedoczynnością oraz nadczynnością tarczycy stwierdzane są liczne zaburzenia w funkcjonowaniu wielu narządów i tkanek, a u podłoża tych zaburzeń leży wielokierunkowość działania HT. Sformułowałem hipotezę badawczą, że udział HT w przebiegu najwcześniejszych stadiów procesu hematopoezy ludzkiej jest następstwem bezpośredniego działania hormonów tarczycy na KKM i KKU. Choroby gruczołu tarczowego charakteryzujące się niedoczynnością oraz nadczynnością tarczycy mogą stanowić formę modelu przewlekłego wpływu hormonów na komórki macierzyste w niszach tkankowych i mogłyby posłużyć do oceny regulacji hormonalnej mechanizmów komórkowych kluczowych dla ludzkiej hematopoezy w naturalnych warunkach in vivo. Moja współpraca z zespołem Kliniki Endokrynologii, Chorób Metabolicznych i Chorób Wewnętrznych PUM w Szczecinie pod kierownictwem prof. dr hab. Anhellego Syrenicza zaowocowała badaniami dotyczącymi wpływu HT na aktywność proliferacyjną i regulację cyklu komórkowego, mechanizm różnicowania oraz dojrzewania komórek macierzystych oraz proces apoptozy w KKM i KKU (publikacja nr 1). Fundamentalnym, dotychczas nie wyjaśnionym wystarczająco problemem, pozostaje odpowiedź na pytanie o molekularne podłoże występowania istotnych z punktu widzenia klinicznego zaburzeń parametrów hematologicznych u pacjentów z dysfunkcją gruczołu tarczowego i wyrównywania tych zmian w odpowiedzi na leczenie określonej dysfunkcji tarczycy. W celu ustalenia wpływu HT na wczesne stadia rozwojowe szeregów hematopoetycznych za główne cele tego etapu badań ustanowiono: 1. Dokonanie analizy ekspresji najważniejszych izoform receptorów dla HT, tj. TRα-1 i TRβ-1 w ludzkich najwcześniejszych komórkach hematopoetycznych na poziomie posttranskrypcyjnym (mrna) i posttranslacyjnym (jądrowe białka receptorowe); 2. Określenie wpływu zaburzeń gruczołu tarczowego na wzrost klonogenny i różnicowanie ludzkich KKM i KKU pochodzących od pacjentów z dysfunkcjami tarczycy i należących do dwóch podstawowych szeregów hematopoetycznych: granulocytowo-makrofagowego (CFU-GM) i erytroidalnego (BFU-E); 3. Ustalenie wpływu zaburzeń gruczołu tarczowego na aktywność procesu apoptozy w ludzkich najwcześniejszych komórkach hematopoetycznych pochodzących od pacjentów z dysfunkcjami tarczycy. 4. Ocena zmiany wartości parametrów hematologicznych krwi obwodowej pacjentów w badanych grupach i ich korelacja z wynikami uzyskanymi w badaniach in vitro. Do realizacji ww. celów pozyskano krew obwodową od 22 zdrowych osobników oraz od pacjentów z zaburzeniami funkcji gruczołu tarczowego, w tym 25 osób z nadczynnością i 25 osób z niedoczynnością tarczycy hospitalizowanych w Klinice Endokrynologii Pomorskiego Strona 9

Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie. Z pozyskanego materiału wstępnie wyizolowano frakcję komórek jednojądrzastych, a następnie za pomocą zestawu magnetycznych kolumn separacyjnych i kuleczek ferromagnetycznych wyizolowano populację komórek CD34+, stanowiących frakcję komórek o cechach krwiotwórczych komórek macierzystych (KKM) i ukierunkowanych komórek progenitorowych (KKU) do dalszych analiz. Oceny ekspresji receptorów dla HT (TRα-1 i TRß-1) dokonano za pomocą techniki RT-PCR na poziomie mrna oraz metodą western blot na poziomie białka. Ocena ekspresji receptorów dla HT na poziomie mrna wykazała obecność ekspresji obu badanych izoform TR we wszystkich analizowanych grupach. Na poziomie białka wykryto TRα-1 u pacjentów z nadczynnością i niedoczynnością tarczycy, jakkolwiek, obecności TRß-1 w komórkach KKM i KKU nie udało się potwierdzić. Jednakże, obie analizowane izoformy receptora dla HT występowały na poziomie białkowym w komórkach krwiotwórczych pozyskanych od osób zdrowych, co świadczy o ich potencjalnej bezpośredniej podatności na regulacyjne wpływy nieprawidłowych stężeń HT. W kolejnej fazie badań przeprowadzono testy klonogenne krwiotwórczych komórek CD34+ wykonywane w celu ilościowej oceny wzrostu dwóch typów kolonii: CFU-GM i BFU- E. Stwierdzono spadek potencjału klonogennego linii mieloidalnej CFU-GM we wszystkich grupach badanych w porównaniu z grupą kontrolną. Potencjał klonogenny linii erytroidalnej BFU-E zmniejszył się jedynie w grupie pacjentów z niedoczynnością tarczycy. Natomiast jego wzrost był istotny w grupie pacjentów z nadczynnością tarczycy. W wyniku tej obserwacji przeprowadziłem wraz z zespołem analizę ekspresji genów zaangażowanych w regulację cyklu komórkowego, tj. Cykliny D1 oraz Polimerazy DNA delta zwanej powszechnie jako antygen jądrowy związany z proliferacją komórek (PCNA). Badanie ekspresji na poziomie transkrypcyjnym wykazało, że u pacjentów z nadczynnością tarczycy ekspresja obu genów w komórkach KKM i KKU jest znacząco zwiększona w stosunku do grupy kontrolnej, co może świadczyć o istotnej roli HT w procesie stymulacji cyklu komórkowego progenitorów linii erytroidalnej, co ma pozytywny wpływ na proces ich proliferacji i różnicowania. Dodatkowo, zaobserwowałem korelację pomiędzy wynikami badań molekularnych w zakresie linii erytroidalnej a parametrami hematologicznymi krwi obwodowej w postaci wzrostu liczby krwinek czerwonych oraz wzrostu wartości tzw. trzech podstawowych wskaźników erytrocytarnych, do których zalicza się: średnią objętość krwinki czerwonej (MCV), średnią masę hemoglobiny w krwince (MCH) i średnie stężenie hemoglobiny w krwince (MCHC). Korelacja o podobnym charakterze została również zaobserwowana w grupie pacjentów z niedoczynnością tarczycy, w której stwierdzono istotny spadek liczby krwinek czerwonych oraz spadek stężenia hemoglobiny we krwi obwodowej, czemu towarzyszyła niższa wartość wskaźnika MCH i MCHC krążących erytrocytów, co świadczy o niedokrwistości, która może wynikać z supresji linii erytroidalnej wskutek braku stymulującego wpływu HT na cykl komórkowy. Nie odnotowano jednak zmiany w poziomie ekspresji genów cyklu komórkowego w KKM i KKU z grupy pacjentów z niedoczynnością tarczycy, co może wskazywać, że w tym przypadku supresja wzrostu linii BFU-E może być regulowana przez inne pośrednie mechanizmy molekularne. Analiza aktywności apoptotycznej komórek KKM i KKU u pacjentów ze schorzeniami tarczycy dostarczyła wielu ciekawych obserwacji. Proces apoptozy oceniano zgodnie z Strona 10

zasadami sztuki badań molekularnych apoptozy, tj. za pomocą dwóch odmiennych metod przy użyciu cytometru przepływowego: metodą barwienia komórek na obecność aneksyny-v oraz metodą detekcji stopnia fragmentacji DNA (TUNEL), z których pierwsza służy do detekcji fazy wczesnej (odwracalnej), a druga służy do detekcji późnej (nieodwracalnej) fazy apoptozy. Analizując posiadany materiał biologiczny wykazano, że wyższą aktywnością procesu zaprogramowanej śmierci w komórkach KKM i KKU odznaczały się obie badane grupy pacjentów w porównaniu do grupy kontrolnej. Istotny jest również fakt, że przeprowadzona trzymiesięczna właściwa terapia farmakologiczna badanych zaburzeń endokrynologicznych nie przyniosła istotnych zmian w odpowiedzi komórek z obu badanych grup pacjentów tyreologicznych. Z uwagi na krótki czas trwania obserwacji klinicznej w trakcie badania in vivo (3 miesiące) ustalenie rzeczywistego efektu działania korygującego zaburzenia hormonalne powinno być prawdopodobnie prowadzone w dłuższym okresie obserwacji klinicznej. Należy podkreślić, że powyższe wyniki zostały opublikowane w wiodącym czasopiśmie endokrynologicznym European Journal of Endocrinology, którego organem wydawniczym jest Europejskie Towarzystwo Endokrynologiczne i w którym są publikowane europejskie wytyczne ds. diagnostyki i leczenia zaburzeń endokrynologicznych. Również na tym etapie pracy naukowej dokonano omówienia stanu wiedzy odnośnie potencjalnego wpływu hormonów tarczycy na biologię komórek macierzystych i progenitorowych krwiotworzenia, z wykazaniem dotychczasowych doświadczeń naszego zespołu badawczego, w którym byłem współprowadzącym część eksperymentalną zrealizowaną w warunkach in vitro w zakresie zastosowania wybranych niefizjologicznych stężeń trójjodotyroniny w populacji izolowanych KKM i KKU pochodzących z trzech różnych podstawowych źródeł biologicznych komórek krwiotwórczych w organizmie człowieka, tj. ze szpiku kostnego, krwi obwodowej i krwi pępowinowej (publikacja nr 2). W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano, że podstawowe funkcjonalne receptory dla hormonów tarczycy, tj. receptor TRα-1 i TRβ-1, podlegają ekspresji w KKM i KKU o fenotypie CD34+ pochodzących ze szpiku kostnego i krwi obwodowej dorosłych osób zarówno na poziomie transkryptomu oraz białka. W przypadku krwi pępowinowej pozyskiwanej od świeżo narodzonych noworodków wykryto na poziomie białka jedynie ekspresję receptora TRα-1 oraz brak ekspresji TRβ-1, co może świadczyć o niedojrzałości mechanizmów regulacyjnych biorących udział w przekaźnictwie sygnału wewnątrzkomórkowego zależnego od hormonów tarczycy na tym poziomie rozwojowym organizmu człowieka. Zaobserwowano także, że niefizjologicznie wysokie stężenia trójjodotyroniny są odpowiedzialne za zmniejszenie poziomu ekspresji receptora TRα-1, co wykazało podobieństwo do zmian obserwowanych w KKM i KKU w grupie pacjentów z nadczynnością tarczycy. W przypadku analizy wpływu trójjodotyroniny na wzrost i różnicowanie progenitorów erytroidalnych w stężeniach niefizjologicznych obserwowano dwojaki efekt. Stężenie tego hormonu wielokrotnie przekraczające stężenia fizjologiczne okazało się mieć negatywny wpływ na wzrost i rozwój różnicujący linii erytropoetycznej i istotny spadek potencjału klonogennego tych progenitorów w tych warunkach. W klinice, takie bardzo wysokie stężenia obserwuje się w trakcie przełomów tarczycowych np. w przebiegu choroby Gravesa-Basedowa Strona 11

lub tyreotoksykozy na tle autonomicznego gruczolaka. Z kolei stężenie tego hormonu tylko kilkukrotnie przekraczające stężenia fizjologiczne, co może odpowiadać najczęstszej formie łagodnej nadczynności tarczycy, prowadziły w hodowli komórkowej do istotnej aktywacji wzrostu klonogennego progenitorów erytroidalnych szpikowych i pozaszpikowych, co mogło być potwierdzone w dalszych badaniach w warunkach in vivo w grupie pacjentów z nadczynnością tarczycy, u których obserwowano podwyższone ilości krążących erytrocytów względem zdrowych osobników kontrolnych. W ocenie wpływu trójjodotyroniny na wzrost i różnicowanie przedstawicieli linii leukocytarnej pochodzenia szpikowego w stężeniach niefizjologicznych obserwowano jedynie efekt negatywny. Wszystkie badane poziomy podwyższonego stężenia trójjodotyroniny wywołały w efekcie spadek wzrostu klonalnego progenitorów leukopoezy w testach klonogennych. Natomiast analizując w podobnych warunkach in vitro wzrost progenitorów leukopoezy pochodzenia pozaszpikowego zaobserwowano odmienny efekt bardzo wysokich stężeń badanego hormonu, który działał hamująco na leukopoezę, w przeciwieństwie do umiarkowanie wysokich stężeń trójjodotyroniny, która w tym wypadku działała stymulująco na klonalny wzrost progenitorów linii leukocytarnej. Te przeciwstawne efekty wpływu hormonów tarczycy na leukopoezę szpikową i pozaszpikową mogą być również odpowiedzialne za brak globalnych zmian ilościowych w zakresie układu białokrwinkowego obserwowanego we krwi obwodowej pacjentów z nadczynnością tarczycy badanych przez nasz zespół. Unikatowa zdolność KKM do samoodnowy i różnicowania się w komórki progenitorowe, dające początek jednej lub wielu liniom komórek potomnych jest również efektem wpływów regulacyjnych zależnych od zjawiska apoptozy i podatności komórek we wczesnych stadiach rozwojowych na ten mechanizm zaprogramowanej śmierci komórkowej. Analizując wpływ niefizjologicznych stężeń hormonów tarczycy na indukcję apoptozy w KKM i KKU pozyskanych ze szpiku kostnego oraz ze źródeł pozaszpikowych ustalono, że w przypadku stężeń bardzo wysokich oraz umiarkowanie wysokich trójjodotyroniny następowała istotna indukcja apoptozy w ludzkich komórkach krwiotwórczych, a przedłużający się okres bezpośredniego wpływu tego hormonu z 24 godzin do 72 godzin ten proces jeszcze bardziej nasilał i dotyczył głównie późnej fazy wykonawczej tego zjawiska, która prowadzi do indukcji szlaków związanych z nieodwracalnym etapem zaprogramowanej śmierci komórkowej. Podobne efekty biologiczne, tj. nasilenie aktywacji późnej fazy apoptozy komórek krwiotworzenia krążących we krwi obwodowej, obserwowaliśmy w badaniu prowadzonym w warunkach in vivo u pacjentów z nadczynnością tarczycy. Wiedzę zdobytą w modelu laboratoryjnym z użyciem niefizjologicznych stężeń biologicznie aktywnej trójjodotyroniny wykorzystałem w realizacji badań klinicznych u pacjentów objętych procesem endokrynopatii tarczycowych o charakterze nadczynności i niedoczynności stanowiących omawiane osiągnięcie naukowe. Podsumowując, w wyniku badań przeprowadzonych w pierwszym etapie oceny aktywności biologicznej komórek macierzystych i progenitorowych krwiotworzenia w wybranych chorobach gruczołów wydzielania wewnętrznego u ludzi i opublikowanych w publikacjach naukowych sformułowano następujące wnioski końcowe z zakresu oceny wpływu Strona 12

endokrynopatii tarczycowych na biologię ludzkich komórek KKM i KKU odpowiedzialnych za fizjologiczną hematopoezę: 1. Wyniki przeprowadzonych badań dowodzą, że u chorych z dysfunkcją gruczołu tarczowego procesy hematopoezy są zaburzone. Obecność niefizjologicznych stężeń hormonów tarczycy prowadzi do istotnej zmiany potencjału proliferacyjnego oraz indukcji zaprogramowanej śmierci komórek w ludzkich KKM i KKU u pacjentów z nadczynnością i niedoczynnością tarczycy (publikacja 1). 2. Główne izoformy receptorów dla trójjodotyroniny u człowieka, TRα-1 i TRβ-1, podlegają ekspresji w ludzkich krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych, co wskazuje na możliwość istnienia bezpośredniego, regulacyjnego wpływu hormonów tarczycy na proces krwiotworzenia. Poziom ekspresji poszczególnych izoform receptorów hormonów tarczycy jest zmienny i istotnie zależy od aktualnego stężenia hormonów tarczycy w organizmie (publikacja 1). 3. Konsekwencją zaburzonej hematopoezy jest wiele zmian dotyczących parametrów hematologicznych we krwi obwodowej, co bezpośrednio może wiązać się ze wzrostem ryzyka rozwoju zaburzeń hematologicznych u pacjentów z dysfunkcją gruczołu tarczowego (publikacja 1). 4. Uzyskane wyniki z badań w warunkach in vivo u pacjentów z endokrynopatiami tarczycowymi wydają się być zgodne z wcześniejszymi badaniami dotyczącymi funkcji hormonów tarczycy w regulacji ludzkiej hematopoezy prowadzonymi w modelach in vitro dla odpowiednich chorób tarczycy. Zaobserwowano podobne zmiany aktywności biologicznej komórek krwiotworzenia zarówno w przypadku nadmiaru jak i niedoboru trójjodotyroniny w hodowli komórkowej oraz w poszczególnych grupach pacjentów badanych, jednak nie wszystkie różnice były istotne statystycznie. Ograniczeniami przedstawionych badań u ludzi są: naturalna niejednorodność biologiczna badanej populacji pacjentów, a także wielkość grupy badanej z określoną jednostką chorobową, co z kolei wpływa w określonym zakresie na moc statystyczną badania (publikacja 2). 5. Dokonana próba ustalenia biologicznych mechanizmów regulacji funkcji układu krwiotwórczego przez hormony tarczycy w grupie osób z rozpoznaną dysfunkcją gruczołu tarczowego może przyczynić się do stworzenia nowych strategii leczniczych prowadzących do skuteczniejszego eliminowania zaburzeń hematologicznych u pacjentów z endokrynopatiami tarczycowymi. 2. Wpływ niedoboru hormonu wzrostu i jego egzogennej suplementacji na regulację ludzkiej hematopoezy w warunkach in vivo Drugi etap moich badań naukowych obejmował ocenę wpływu niedoboru hormonu wzrostu na ludzką hematopoezę dokonaną u pacjentów z wrodzoną niedoczynnością przysadki (SNP) stanowiącą przewlekłą chorobę endokrynologiczną. Zwróciłem także uwagę na efekty biologiczne standardowej hormonoterapii chorych z SNP o charakterze suplementacyjnym. Wnioski zostały sformułowane na podstawie wyników analizy zmiany aktywności ważnych Strona 13

procesów biologicznych, tj. proliferacji i apoptozy, zachodzących w komórkach macierzystych krwiotworzenia. Są one rezultatem badań prowadzonych przed oraz podczas realizacji grantu NCN (nr NN402 476237) pt. Wpływ hormonu wzrostu na proces regulacji ludzkiej hematopoezy pod kierownictwem Pana Profesora dr hab. n. med. Bogusława Machalińskiego oraz przy moim głównym wykonawstwie projektu. Moja współpraca z zespołem Kliniki Klinika Pediatrii, Endokrynologii, Diabetologii, Chorób Metabolicznych i Kardiologii Wieku Rozwojowego PUM w Szczecinie pod kierownictwem Pana Profesora dr hab. n. med. Mieczysława Walczaka zaowocowała pracą dotyczącą wpływu izolowanego niedoboru GH na aktywność proliferacyjną i cykl komórkowy w KKM i KKU (publikacja nr 3 i nr 4). Hormon wzrostu (GH), znany jako somatotropina, jest substancją hormonalną wytwarzaną przez komórki somatotropowe przedniego płata przysadki mózgowej [6]. Jego synteza i cykliczne wydzielanie podlegają precyzyjnej kontroli przez wiele czynników hormonalnych, metabolicznych i fizjologicznych, na różnych poziomach osi regulacyjnej [6]. Hormon wzrostu odgrywa ważną rolę w mechanizmach regulacyjnych dla prawidłowego rozwoju organizmu oraz różnicowania tkanek w trakcie jego okresu rozwojowego i wzrastania. GH ma szeroki zakres biologicznej aktywności. Do najbardziej spektakularnych efektów biologicznych GH należy stymulacja wzrostu kości i tkanek miękkich [7]. GH wywiera znaczną część swoich biologicznych działań poprzez stymulację wytwarzania peptydu pośredniczącego (IGF-1), produkowanego w hepatocytach, który stymuluje chondrogenezę i osteogenezę w chrząstkach wzrostowych kości, w których znajdują się aktywnie dzielące się komórki chrząstki zależne od IGF-1 chondroblasty i chondrocyty [8]. Dodatkowo, GH wpływa bezpośrednio (już bez udziału IGF-1) na gospodarkę węglowodanową powodując pobudzenie glikogenolizy i wzrost uwalniania glukozy z wątroby, a w tkance tłuszczowej zwiększa lipolizę i zmniejsza lipogenezę. Efekty metaboliczne GH są więc przede wszystkim rezultatem działania GH na komórki docelowe. Dane eksperymentalne wskazują, że GH wywołuje bezpośrednie działanie stymulującego różnicowanie i klonalną ekspansję komórek tj. fibroblasty, chondrocyty lub adipocyty [9]. Wielu autorów uważa, że hormon wzrostu poprzez swoje anaboliczne działanie stymulujące wzrost i różnicowanie komórek i tkanek może również mieć wpływ na przebieg hematopoezy obok znanych cytokin, chemokin i hematopoetycznych czynników wzrostu. Dane te są poparte obserwacjami w modelach zwierzęcych, że GH ma stymulujący wpływ na proces proliferacji zwłaszcza form rozwojowych limfocytów T, gdyż suplementacja GH indukowała znaczne pobudzenie aktywności szeregów limfopoetycznych [10]. W badaniach prowadzonych na szczurach w różnym wieku rozwojowym obserwowano, że podawanie GH wywołuje pobudzenie wzrostu szeregu rozwojowego limfocytów T poprzez namnażanie wczesnych progenitorów oraz poprzez nasilenie migracji do grasicy [11]. W grupie chorych z AIDS również obserwowano przyrost masy grasicy oraz wzrost ilości krążących naiwnych limfocytów T w wyniku suplementacji GH [12]. Szpik kostny wydaje się być ważnym narządem docelowym dla działania GH. Badania laboratoryjne wykazały, że GH stymuluje wzrost kolonii erytroidalnych i mieloidalnych w warunkach in vitro [13-14]. Jakkolwiek, badania te nie wykluczyły pośredniej roli IGF-1. Kolejną przesłanką o bezpośrednim wpływie GH na układ krwiotwórczy mogą być nieprawidłowości obserwowane u pacjentów z zaburzeniami produkcji tego hormonu wskutek somatotropinowej niedoczynności przysadki. Pacjenci zwykle prezentują nieprawidłowości w zakresie parametrów hematologicznych. Strona 14

Najczęściej stwierdza się mikrocytozę, anizocytozę i poikilocytozę we krwi obwodowej. Pacjentów z niedoborem GH również charakteryzują niedokrwistości. Częstym zjawiskiem towarzyszącym niskorosłości jest niedokrwistość tarczowato-krwinkowa [15]. Równocześnie liczba leukocytów jest obniżona u pacjentów przy zaburzeniach produkcji GH [16]. Pomimo intensywnych prac dotyczących wpływu GH na różnorodne procesy przebiegające w stanie zdrowia i choroby, wiele elementów pozostaje jednak nie do końca wyjaśnionych. Jednym z takich zagadnień jest ustalenie charakteru wpływu GH na proces regulacji ludzkiej hematopoezy. Wcześniejsze badania in vitro te nie wykluczyły pośredniej roli IGF-1 w obserwowanych zmianach aktywności proliferacyjnej badanych progenitorów hematopoetycznych. Sformułowałem hipotezę badawczą, że udział GH w przebiegu najwcześniejszych stadiów procesu hematopoezy ludzkiej jest następstwem oddziaływania GH na KKM i KKU. Dzięki zastosowaniu jako modelu badawczego trwałego niedoboru GH w przebiegu wrodzonej dysfunkcji komórek somatotropowych przysadki jaki występuje u pacjentów z SNP możliwa jest ocena jego efektów biologicznych. Dodatkowo, należało porównać zmiany aktywności hematopoezy przed rozpoczęciem leczenia oraz po zastosowaniu leczniczej suplementacji GH. W celu ustalenia wpływu GH na wczesne stadia rozwojowe szeregów hematopoetycznych sformułowano następujące główne cele drugiego etapu badań: 1. Zbadanie ekspresji poszczególnych receptorów dla GH i IGF-1 w komórkach KKM i KKU pochodzących od pacjentów ze wrodzonym niedoborem GH na poziomie transkrypcyjnym (mrna) oraz posttranskrypcyjnym (białka receptorowe). 2. Zbadanie ekspresji wybranych genów regulujących cykl komórkowy, a podlegających hormonalnym wpływom regulacyjnym oraz określenie wpływu zaburzeń wydzielania GH na wzrost klonogenny i różnicowanie ludzkich KKM i KKU pochodzących od pacjentów z SNP i należących do podstawowych szeregów hematopoetycznych: erytroidalnego (BFU-E), granulocytowo-makrofagowego (CFU- GM) i limfoidalnego (CFU-Lymph); 3. Ustalenie wpływu zaburzeń wydzielania GH na poziom ekspresji wybranych genów pro-apoptotycznych i anty-apoptotycznych oraz ocena aktywność procesu apoptozy w ludzkich KKM i KKU pochodzących od pacjentów z SNP. 4. Analiza zmian wartości parametrów hematologicznych krwi obwodowej pacjentów z SNP i ich korelacja z wynikami uzyskanymi w badaniach molekularnych. Do realizacji ww. celów pozyskano krew obwodową od 38 dzieci w wieku 11 ± 4,2 lat obojga płci z endogennym, izolowanym niedoborem hormonu wzrostu (SNP), które zostały zakwalifikowane do terapii rekombinowanym GH. SNP rozpoznawano zgodnie z obowiązującymi kryteriami diagnostycznymi. Grupę kontrolną stanowiło 60 dzieci, dobranych pod względem wieku oraz płci z grupą badaną. Z pozyskanej krwi obwodowej izolowano frakcję komórek jednojądrzastych, a następnie za pomocą zestawu magnetycznych kolumn separacyjnych i kuleczek ferromagnetycznych wyizolowano populację komórek CD34+, stanowiących frakcję komórek o cechach krwiotwórczych komórek macierzystych (KKM) i ukierunkowanych komórek progenitorowych (KKP) do dalszych analiz. Oceny ekspresji receptora dla GH (GHR) i dla IGF-1 (IGF-1R) dokonano za pomocą techniki qrt-pcr na Strona 15

poziomie mrna oraz metodą immunofluorescencyjną na poziomie białka. Badanie ekspresji mrna dla GHR i IGF-1R wykazało obecność obu rodzajów transkryptu w populacji wczesnych komórek krwiotwórczych od pacjentów z SNP i osób zdrowych. Wyniki uzyskane z analizy ekspresji białek receptorowych potwierdziły nasze obserwacje. Badanie koekspresji wykazało jednoczesną ekspresję receptora GHR i IGF-1R na komórkach CD34+ od dzieci z SNP. Interesujący jest fakt, że istotnie wyższą ekspresję obu transkryptów wykazały komórki KKM i KKU izolowane w trakcie terapii hormonalnej w porównaniu do komórek izolowanych przed rozpoczęciem leczenia oraz z grupy kontrolnej (publikacja nr 3 i nr 4). Następnie oceniano, czy terapia hormonalna ma wpływ na zmianę ekspresji genów związanych z regulacją cyklu komórkowego oraz proliferacją (MAP2K1, PCNA, cyklina-d1 i -E1) w komórkach KKM i KKU. Zaobserwowano, że komórki krwiotwórcze wykazywały istotnie większą ekspresję badanych genów w trakcie suplementacji hormonalnej w porównaniu do okresu przed rozpoczęciem leczenia oraz do grupy kontrolnej. Istotnie, populacja komórek KKM i KKU u pacjentów leczonych GH posiadała większy odsetek komórek w fazie G1, S i G2/M, co może wskazywać na ich większą aktywność proliferacyjną. Potwierdzenie funkcjonalnej aktywności regulacyjnych genów pro-proliferacyjnych, uzyskano za pomocą oceny potencjału klonogennego w hodowlach komórkowych. Stwierdzono wtedy istotny wzrost klonogenności progenitorów erytroidalnych w porównaniu przed rozpoczęciem leczenia. Poza tym, potencjał ten był istotnie niższy w grupie przed leczeniem w porównaniu do grupy kontrolnej. Przeciwnie, obie analizowane linie hematopoetyczne związane z leukopoezą nie wykazały istotnych różnic w żadnej z analizowanych grup pacjentów (publikacja nr 3). Globalna analiza ekspresji genów w populacji KKM i KKU wykonana w systemie macierzy ekspresyjnych RNA obejmujących około 19 tysięcy transkryptów mrna wykazała nadreprezentację genów o istotnie większej ekspresji, które są związane z takimi procesami jak kontrola i progresja cyklu komórkowego, proliferacja komórek krwiotwórczych, jak również z ich różnicowaniem, migracją i syntezą czynników wzrostu przez komórki krwiotwórcze w grupie osób leczonych hormonem wzrostu. Należy podkreślić, że powyższe wyniki zostały opublikowane w wiodącym czasopiśmie endokrynologicznym Endocrine, w którym publikowane są wyniki badań podstawowych oraz translacyjnych z zakresu schorzeń gruczołów wydzielania wewnętrznego. Analiza zmian poziomu ekspresji genów kluczowych w procesie zaprogramowanej śmierci w komórkach krwiotwórczych u pacjentów z SNP dostarczyła interesujących obserwacji. W badaniu ilościowym wykazano znaczący wzrost (ok. 20 30%) poziomu transkryptu ważnego genu pro-apoptotycznego BAX w KKM i KKU u pacjentów z SNP zarówno przed, jak i w trakcie leczenia GH w stosunku do grupy kontrolnej. Przeciwnie, po trzech i sześciu miesiącach od rozpoczęcia terapii GH zaobserwowano w tej grupie istotny wzrost ekspresji genów anty-apoptotycznych (BCL-2, BCL-xL) w porównaniu do osób z SNP przed leczeniem oraz do grupy kontrolnej. W dalszym etapie badań wyniki te potwierdzono poprzez analizę uszkodzonych fragmentów DNA, która wykazała istotne zmniejszenie odsetka komórek w późnej fazie apoptozy w grupie osób z SNP po trzech i sześciu miesiącach od rozpoczęcia leczenia GH. Analiza ekspresji aneksyny-v na powierzchni badanych komórek także wykazała istotny spadek odsetka komórek podlegających wczesnej fazie zaprogramowanej śmierci w grupie pacjentów z SNP po trzech i sześciu miesiącach leczenia w Strona 16

porównaniu do momentu sprzed terapii oraz do grupy kontrolnej. Wyniki te mogą wskazywać, że hormon wzrostu odgrywa bezpośrednią rolę w aktywnej modulacji ekspresji genów regulujących apoptozę wczesnych komórek krwiotworzenia (publikacja nr 4). Globalna analiza ekspresji genów w populacji KKM i KKU wykonana w systemie macierzy ekspresyjnych RNA obejmujących około 19 tysięcy transkryptów mrna wykazała, że pacjentów z SNP cechowała niższa ekspresja genów kodujących niektóre białka hamujące apoptozę (np. MAPK14, MDM2, HCK, BCL3, BCL6, BCL2A1 i CFLAR). Porównując kompleksowe dane z analizy bioinformatycznej ekspresji genów w komórkach krwiotwórczych od osób z SNP przed leczeniem i po terapii wykazano, że wśród najbardziej indukowanych w wyniku leczenia za pomocą GH znalazły się także geny związane z regulacją śmierci komórkowej i apoptozy. Wyniki te mogą wskazywać, że hormon wzrostu wpływając anabolicznie na metabolizm komórkowy reguluje procesy biologiczne indukując sygnały o charakterze anty-apoptotycznym (publikacja nr 4). Z uwagi na właściwości hormonu wzrostu związane z jego działaniem proproliferacyjnym i chemotaktycznym w dalszych badaniach skoncentrowano się na analizie dotyczącej korelacji kliniczno-molekularnych. W tym celu skorelowano uzyskane dane z badań molekularnych z obrazem krwi obwodowej u osób z SNP przed rozpoczęciem terapii GH i w jej trakcie oraz u zdrowych ochotników. Stwierdzono, że wrodzony niedobór hormonu wzrostu związany był z obniżeniem wartości kluczowych parametrów czerwonokrwinkowych (RBC, HGB, HCT, MCH, MCV). Przeciwnie, terapeutyczna suplementacja hormonu wzrostu powodowała wzrost uprzednio obniżonych wartości parametrów i różnice te były istotne statystycznie. Co więcej, wartości parametrów oceniane w 6 miesiącu terapii GH osiągnęły wartości parametrów podobne do obserwowanych w grupie kontrolnej. Nie zaobserwowano jednak istotnych różnic ilości leukocytów ani płytek krwi pomiędzy badanymi grupami, a także pomiędzy różnymi punktami czasowymi suplementacji hormonalnej (publikacja nr 3). Podsumowując, w wyniku badań przeprowadzonych w drugim etapie oceny aktywności biologicznej komórek macierzystych i progenitorowych krwiotworzenia w wybranych chorobach gruczołów wydzielania wewnętrznego u ludzi i opublikowanych w publikacjach naukowych sformułowano następujące wnioski końcowe z zakresu oceny wpływu wrodzonego niedoboru GH i terapeutycznej suplementacji rekombinowanego GH na biologię i metabolizm komórek KKM i KKU odpowiedzialnych za fizjologiczną hematopoezę: 1. Na podstawie przeprowadzonych kompleksowych badań wczesnych krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych, które według naszej wiedzy zostały wykonane kompleksowo po raz pierwszy na świecie, ustalono, że procesy hematopoezy są zaburzone w populacji dzieci z SNP. Ludzkie komórki krwiotworzenia wykazują ekspresję dla receptora dla GH i mogą zatem podlegać jego bezpośrednim działaniom regulacyjnym. Ekspresja GHR w komórkach KKM i KKU jest dodatkowo indukowana w warunkach terapii hormonem wzrostu (publikacja 3). 2. Niedobór hormonu wzrostu prowadzi do istotnej zmiany potencjału proliferacyjnego oraz indukcji zaprogramowanej śmierci komórek w ludzkich KKM i KKU u pacjentów z SNP. Terapeutyczna suplementacja GH w warunkach trwałego niedoboru tego hormonu u pacjentów z SNP wykazuje pozytywny wpływ na przeżycie i proliferację Strona 17

oraz hamowanie apoptozy krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych (publikacja 3 i 4). 3. Konsekwencją zaburzonej hematopoezy jest obecność zmian dotyczących parametrów hematologicznych we krwi obwodowej, co bezpośrednio może wiązać się ze wzrostem ryzyka rozwoju zaburzeń hematologicznych u pacjentów z SNP. Uzupełnianie terapeutyczne niedoboru GH prowadziło do zwiększenia ilości erytrocytów, wzrostu klonogenności progenitorów szeregu erytroidalnego oraz niwelowała zaburzenia morfologii erytrocytów obserwowane u dzieci z SNP. Wyniki zrealizowanych badań wskazują zatem na istotny wpływ GH na wczesne etapy ludzkiej erytropoezy. (publikacja 3). 4. Obserwowane efekty biologiczne związane z regulacją funkcji układu krwiotwórczego przez hormon wzrostu w grupie osób z rozpoznaną SNP mają implikacje do stworzenia nowych strategii leczniczych, prowadzących do skuteczniejszego eliminowania zaburzeń hematologicznych u pacjentów z dysfunkcją przedniego płata przysadki (publikacja 3 i 4). W mojej opinii omawiane prace wniosły nowe spojrzenie na rolę obu hormonów, których dysfunkcyjna produkcja jest spotyka często w praktyce klinicznej i potwierdziły że zarówno hormon wzrostu jak i hormony tarczycy w sposób bezpośredni mogą modulować procesy biologiczne w komórkach krwiotworzenia i wpływać na regulację wielu procesów biologicznych we wczesnych krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych u człowieka. W związku z tym, wyniki moich badań mogą zmienić częściowo obecne poglądy na temat roli hormonów w regulacji ludzkiej hematopoezy w warunkach zaburzeń wydzielania wewnętrznego oraz uzupełniły posiadaną wiedzę na temat zjawisk zachodzących w obrębie niszy hematopoetyczne u pacjentów z dysfunkcjami endokrynologicznymi. Uzyskane wyniki potwierdzają potrzebę jak najszerszego uwzględniania odziaływań czynników hormonalnych w badaniach uwarunkowań biologicznych chorób gruczołów wydzielania wewnętrznego. Wiedza ta może również w przyszłości posłużyć do opracowania odpowiednich nowych metod terapeutycznych w populacji pacjentów dorosłych oraz dzieci. Literatura uzupełniająca: 1. Yen P.M. Physiological and molecular basis of thyroid hormone action. Physiol Rev. 2001;81(3):1097-142. 2. Czarkowski M, Tarnowska I. Thyrotoxicosis and the cardiovascular system--selected pathophysiological aspects. Pol Arch Med Wewn. 2005;114(4):1003-9. 3. Golde DW, Bersch N, Chopra IJ, Cline MJ. Thyroid hormones stimulate erythropoiesis in vitro. Br J Haematol. 1977;37(2):173-7. 4. Perrin MC, Blanchet JP, Mouchiroud G. Modulation of human and mouse erythropoiesis by thyroid hormone and retinoic acid: evidence for specific effects at different steps of the erythroid pathway. Hematol Cell Ther. 1997;39(1):19-26. Strona 18