Ćwiczenie 1. Pomiar ilości drobnoustrojów Metody bezpośredniego liczenia drobnoustrojów A. Liczenie drobnoustrojów przy użyciu komór BÜRKERA i THOMA Komory do liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem to najczęściej szklane płytki z wyciętym wgłębieniem, podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej powierzchni. Po naniesieniu rozcieńczenia do komory dokonuje się liczenia komórek widocznych w obrazie mikroskopowym, a następnie przelicza się ich liczbę na 1 cm³ badanego materiału. Najczęściej stosuje się komory BÜRKERA i THOMA Liczbę komórek przelicza się według wzorów: Komora Thoma: 4x 10 6 an a-średnia liczba komórek w małym kwadracie n- rozcieńczenie badanej próby Komora Bürkera: 2,5 x 10 5 an a - średnia liczba komórek w małym kwadracie n- rozcieńczenie badanej próbki B. Mikroskopia fluorescencyjna (DEFT) Wykonanie oznaczenia obejmuje filtrowanie odpowiednio przygotowanej próby a następnie barwienie osiadłych na filtrze drobnoustrojów fluorescencyjnym barwnikiem (oranżem akrydyny) i policzenie liczby bakterii przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. W metodzie tej komórki żywe barwią się na kolor ZIELONY, natomiast martwe na kolor POMARANCZOWY. Metody hodowlane stosowane do oznaczania liczby drobnoustrojów A. Oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów(npl) Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą płytkową Metoda oznaczania liczby drobnoustrojów na podłożu stałym zakłada, że liczba powstających kolonii odpowiada liczbie żywych komórek w badanej próbie. Wynik podaje się w jednostkach tworzących kolonie jtk (ang.cfu- colony forming units)w 1g lub 1 cm³ produktu. a. posiewy wgłębne Na płytki Petriego nanosi się po 1cm³ wybranych kolejnych rozcieńczeń w dwóch powtórzeniach, a następnie wylewa się określone podłoże ogrzane do temp.42-44 C w łaźni wodnej. W przypadku badania w kierunku bakterii mezofilnych płytki inkubuje się w 30 C przez 72 godziny lub w temperaturach optymalnych dla wybranych grup drobnoustrojów. Do odczytu wybiera się płytki z 2 kolejnych rozcieńczeń, na których wyrosło od 30 do 300 kolonii. Liczbę drobnoustrojów (L) w 1 cm³ lub 1 g próbki oblicza się wg wzoru: C d / (N1+ 0,1N2) C-suma kolonii na wszystkich płytkach wybranych do liczenia N1-liczba płytek z pierwszego liczonego rozcieńczenia N2-liczba płytek z drugiego liczonego rozcieńczenia d - wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu (najniższemu) liczonemu rozcieńczeniu Do odczytu wyników, można wybrać jedno rozcieńczenie, zliczyć kolonie na płytkach z równoległych powtórzeń, wyliczyć średnią liczbę kolonii w rozcieńczeniu i przeliczyć na 1 cm³ lub 1 g próby, mnożąc przez odwrotność rozcieńczenia. b. posiewy powierzchniowe Na płytki Petriego z zestalonym podłożem nanosi się po 0,1 cm³ wybranych, kolejnych rozcieńczeń próby w dwóch powtórzeniach. Materiał rozprowadza się jałową głaszczką na powierzchni całego podłoża, aż do wyschnięcia. Przy oznaczaniu liczby bakterii mezofilnych płytki inkubuje się w temp.30 C przez 72 h, przy oznaczaniu innych grup drobnoustrojów należy stworzyć optymalne warunki temperaturowe i czasowe potrzebne do wzrostu drobnoustrojów. Do odczytu wybiera się płytki z 2 kolejnych rozcieńczeń, na których wyrosło od 15 do 150 kolonii. Liczbę drobnoustrojów (L) w 1 cm³ lub 1g próbki oblicza się wg wzoru: C d a/ (N1+0.1N2) C - suma kolonii na wszystkich płytkach wybranych do liczenia N1 - liczba płytek z pierwszego liczonego rozcieńczenia N2 - liczba płytek z drugiego liczonego rozcieńczenia D - wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu (najniższemu) liczonemu rozcieńczeniu A - współczynnik posianej ilości materiału przy posiewie 0,1 cm³,a=10
SCHEMAT WYKONANIA ROZCIEŃCZEŃ I POSIEWÓW METODĄ WGŁĘDNĄ I POWIERZCHNIOWĄ Produkt badany 10 ml lub 10 mg produktu badanego +90 ml płynu fizjologicznego (rozcieńczenie 10¹) 1 ml rozcieńczenia 10¹ +9 ml płynu fizjologicznego (rozcieńczenie 10²) 1 ml rozcieńczenia 10²+9 ml płynu fizjologicznego (rozcieńczenie 10³) Posiew wgłębny (po 1 ml rozcieńczeń) Posiew powierzchniowy (po 0,1 ml rozcieńczeń) B. Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą sączenia przez filtry membranowe Dla prób o niewielkiej liczbie drobnoustrojów można zastosować metodę polegającą na przesączeniu badanej próbki (np. określona objętość) przez sączek membranowy, a następnie położeniu sączka na podłożu stałym i po okresie inkubacji policzeniu kolonii wyrosłych na powierzchni sączka. C. Określenie ilości bakterii na podstawie zmętnienia zawiesiny według skali McFarlanda Oryginalne standardy zawierają określone ilości chlorku baru i kwasu siarkowego razem. Mieszanie tych dwóch związków powoduje zmętnienie roztworu wskutek powstawania osadu siarczanu baru. Zmętnienie odpowiadające 0.5 w skali McFarland powstaje poprzez zmieszanie 0,05 ml -1,175% dwuwodnego chlorku baru (BaCl 2 2H 2 O), z 9,95 (H 2 SO 4) ml 1% kwasu siarkowego. Standard McFarlanda 0.5 1 2 3 4 1,0% chlorekbaru (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 1,0% Kwassiarkowy (ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6 Gęstość komórek (1x10 8 cfu/ml) 1.5 3.0 6.0 9.0 12.0 % Transmitancji 74.3 55.6 35.6 26.4 21.5 Absorbancja * 0.132 0.257 0.451 0.582 0.669 Ćwiczenie 2. Określenie cech metabolicznych drobnoustrojów wykorzystywanych w celach przemysłowych. A.Określenie zdolności proteolitycznych Posiew szczepów na bulion z żelatyną w celu wykrycia drobnoustrojów rozkładających żelatynę B.Określenie zdolności do rozkładu cukrów Posiew na podłoże Hugh- Leifsona- zdolność rozkładu glukozy Posiew na podłoże trójcukrowe z cytrynianem żelaza- określenie zdolności do rozkładu glukozy, laktozy, sacharozy i siarkowodoru. C.Określenie innych cech metabolicznych drobnoustrojów Posiew na wodę peptonową określenie zdolności do reakcji Voges- Proskaurea służącą do różnicowanie bakterii ze względu na zdolność do wytwarzania acetylometylokarbinolu (acetoiny) Posiew na podłoże z mocznikiem- Christensena- zdolność do rozkładu mocznika do dwutlenku węgla i amoniaku. Posiew na podłoże Simonsa- zdolność do wykorzystywania cytrynianu jako źródła węgla. D.Oznaczanie kwasowości miareczkową w ᵒSH 24-godzinnych hodowli szczepów fermentacji mlekowej. W tym celu 20 cm³ hodowli przenieść do suchej kolbki stożkowej i wobec fenoloftaleiny zobojętniać 0,25M roztworem NaOH. Kolejno podać kwasowość hodowli w ᵒSH ( ilość zużytej do zobojętnienia 100cm³ roztworu/ produktu zasady). Następnie obliczyć ilość produkowanego przez szczepy kwasu mlekowego, korzystając z przelicznika: 1ᵒSH= 0,0225% kwasu mlekowego
Ćwiczenie 1 i 2 karta zaliczeniowa Test Wzory Candida Bacillus E. coli komorabürkera komorathoma DEFT Filtr membranowy Metoda rozcieńczeniowa Posiew wgłębny Metoda rozcieńczeniowa Posiew powierzchniowy Oznaczenie liczby drobnoustrojów metodą filtracji membranowej Określenie zdolności proteolitycznych szczepów Określenie zdolności do rozkładu cukrów Określenie zdolności do wytwarzania acetoiny Określenie zdolności do rozkładu mocznika Określenie zdolności wytwarzania cytrynianu Nazwisko i imię: Zaliczenie:
Ćwiczenie 3. Izolacja szczepów Bacillus z gleby 1. Izolacja szczepów Bacillus z gleby. Sprawdzanie cech użytkowych wyizolowanych szczepów z rodzaju Bacillus. Izolacja szczepów Bacillus z gleby: Procedura wykonania: W celu izolacji szczepów Bacillus z gleby należy napełnić łaźnię wodną do połowy objętości i podgrzać do osiągnięcia temperatury 80 o C. Próbkę gleby w warunkach sterylnych dodać do kolbki z 90 ml jałowej soli fizjologicznej, wytrząsać intensywnie przez 10 minut (otrzymane w ten sposób rozcieńczenie to 10-1 ). Próbę pozostawić na 10 min w celu sedymentacji makrocząstek glebowych, a po zsedymentowaniu próbki wykonać kolejne rozcieńczenia (od 10-2 do10-4 ) w probówkach z 9 ml soli fizjologicznej.przygotowane rozcieńczenia roztworu glebowego umieścić w gorącej łaźni wodnej (<80 0 C) na 10 minut. Upewnić się, że poziom wody w łaźni jest wyższy od poziomu roztworu w probówkach. Jest to ważne ze względu na konieczność równomiernego ogrzania próbki. Podgrzane próbki schłodzić do temperatury pokojowej. Z przygotowanych, schłodzonych roztworów wykonać posiew metodą płytek mazanych (na płytki Petriego z zestalonym podłożem stałym bulion agarowy nanieść po 0,1 ml z rozcieńczeń 10-2 -10-4 ). Inkubować płytki przez 7 dni. Sprawdzanie cech użytkowych wyizolowanych szczepów z rodzaju Bacillus. Procedura wykonania: A. Określenie zdolności wyizolowanych szczepów Bacillus do produkcji enzymów amylolitycznych. Szybki test określający zdolność szczepów do degradacji skrobi: Z wybranych kolonii bakterii wyrosłych na podłożu bulion-agar sporządzić zawiesinę w soli fizjologicznej poprzez przeniesienie ezą mikrobiologiczną materiału do kropli soli fizjologicznej na szkiełku podstawowym.przygotować następujące próby na szkiełku podstawowym: - roztwór skrobi + zawiesina bakteryjna, - woda destylowana + zawiesina bakteryjna, - roztwór skrobi + woda destylowana. Należy pamiętać o dokładnych oznaczeniu poszczególnych prób! Do każdej próby delikatnie wprowadzić po kropli płynu Lugola odczekać 30 min. Zmiana barwy na czerwoną, żółtą lub odbarwienie próby wskazuje na zdolność bakterii do rozkładu skrobi. Barwa niebieska świadczy o braku rozkładu skrobi. B. Określenie zdolności wyizolowanych szczepów Bacillus do produkcji enzymów lipolitycznych: Pojedyncze kolonie szczepu Bacillus wyrosłe na podłożu z dodatkiem tłuszczu zalać 20% roztworem siarczanu miedzi (II). Pojawienie się zielonego zabarwienia kolonii świadczy o zdolności hydrolizy tłuszczu C. Określenie zdolności wyizolowanych szczepów Bacillus do produkcji enzymów proteolitycznych: Powierzchnię płytki przesianej redukcyjnie z podłożem żelatynowym Fraziera zalać nasyconym roztworem siarczanu amonowego lub odczynnikiem Fraziera, zamknąć płytkę i pozostawić na 5 minut. Nadmiar płynu ostrożnie odpipetować. Obecność kolonii wokół których powstały strefy przejaśnienia świadczy o hydrolizie białka. Wzrost bakterii w probówce z 1% wodą peptonową w postaci zmętnienia, kożucha czy osadu świadczy o aktywności proteolitycznej. Po dodaniu kilku kropel odczynnika Nesslera pojawienie się pomarańczowej zabarwienia wskazuje na aktywność amonifikacyjną wyizolowanych szczepów. D. Identyfikacja wyizolowanych szczepów metodą Grama, wykrywanie przetrwalników.
ĆWICZENIA 3 - Karta zaliczeniowa Rodzaj testu Szczep badany Barwienie metodą GRAMA(obecność przetrwalników) Zdolność do produkcji enzymów amylolitycznych Zdolność do produkcji enzymów lipolitycznych Zdolność do produkcji enzymów proteolitycznych (podłoże stałe) Zdolność do produkcji enzymów proteolitycznych (podłoże płynne) Imię i Nazwisko Zaliczenia
Ćwiczenie 4. Mikroflora wybranych produktów żywnościowych 4. Mikroflora wybranych produktów żywnościowych - wykonanie posiewów wybranych produktów spożywczych: kefir, ser pleśniowy, sok owocowy, mięso drobiowe, mleko odtłuszczone w proszku - określenie bakterii kwaszących typu mlekowego - oznaczanie liczby bakterii z grupy coli metodą płytkową - wykrywanie obecności bakterii Campylobacterspp. - oznaczanie liczby drożdży i pleśni metodą płytkową - oznaczanie liczby drobnoustrojów tlenowych, mezofilnych metodą płytkową - oznaczanie liczby gronkowców koagulazododatnich - oznaczanie liczby Bacillus cereus metodą płytkową Kontynuacja ćwiczenia Odczyt wykonanych poprzedniego dnia posiewów oraz wykonanie testów diagnostycznych służących identyfikacji drobnoustrojów Określenie liczby bakterii kwaszących typu mlekowego wg. Normy PN-90-A-75052/07:1990 Materiał badany: kefir, mleko odtłuszczone w proszku Roztwór fizjologiczny z peptonem (10 g +90 ml rozcieńczenia) Zmodyfikowane podłoże Blickfeldta- posiew metodą zalewową, inkubacja -30-24 h Testy potwierdzające Test katalazy barwienie metodą Grama Oznaczanie liczby bakterii z grupy coli metodą płytkową wg normy PN-ISO 4832:3007 Materiał badany: kefir, sok owocowy, mięso drobiowe, mleko odtłuszczone w proszku Roztwór fizjologiczny z peptonem (10 g/ml + 90 ml rozcieńczenia) - zawiesina wyjściowa Agar z fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i laktozą (VRBL) - posiew metodą zalewową 2 etapową: -1 ml próbki produktu płynnego lub 1 ml zawiesiny wyjściowej przenieść na 2 płytki, zalać 15 ml pożywki VRBL o temp.45 C. Po zestaleniu płytki zalać 4 ml pożywki VRBL o temp.45 C (inkubacja odwróconych płytek -37 C -24 h) -płytka kontrolna z pożywką (w przypadku mleka i produktów mlecznych ) -inkubacja -30 C- 24 h W przypadku obecności nietypowych kolonii pobrać 5 kolonii i posiać do probówek z bulionem z zielenią brylantynową, laktozą i żółcią inkubacja 37 C- 24 h Wynik: Podłoże VRBL- ciemno- purpurowo-czerwone kolonie otoczone czerwoną strefą wytrącanej żółci(wynik+) Bulion z zielenią brylantynową, laktozą i żółcią wynik += gaz + Wykrywanie obecności bakterii Campylobacterspp. Materiał badany: mięso drobiowe Naważka x g/ml + 9 ml bulionu TSB- inkubacja w atmosferze mikroareofilnej - 37 C- 48 h Posiew zawiesiny na podłoże mccda- inkubacja 41,5 C- 44 C Testy potwierdzające na 5 typowych lub podejrzanych koloniach Przesiew na agar z dodatkiem krwi metodą powierzchniową inkubacja 41,5 C- 24h Barwienie metodą Grama - test oksydazy - test katalazy - wrażliwość na kwas nalidyksowy i cefalotynę - test z hipuranem - test z krążkiem zawierającym octan indoksylu
Oznaczanie liczby drożdży i pleśni metodą płytkową wg normy PN-ISO 21527-1:2009 Materiał badany: ser pleśniowy, jogurt, sok owocowy Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wody niż 0,95 0,1% wody peptonowej (x g/ml próby + 9 ml rozcieńczalnika) Płytka agarowa z dichloranem, różem bengalskim i chloramfenikolem (DRBC) lub podłoże Sabouradou - posiew 0,1 ml próbki produktu płynnego oraz wykonanie kolejnych rozcieńczeń dziesiętnych - posiew na 1 płytkę Petriego po 0,1 ml zawiesiny wyjściowej. Inkubacja wieczkiem do góry 25 C- 5dni W celu ułatwienia oznaczenia niskiej liczby drożdży i pleśni można zwiększyć objętość posiewanego inokulum do 0,3 ml i posiewać na 3 równoległe płytki Oznaczanie liczby drobnoustrojów tlenowych mezofilnych metodą płytkową w 30 C wg normy PN- EN ISO 4833:2004 + Ap 1:2005 Materiał badany: mięso drobiowe, mleko odtłuszczone w proszku Roztwór fizjologiczny z peptonem Podłoże do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów posiew metodą zalewową na 2 płytki 1 ml zawiesiny wyjściowej +12-15 ml pożywki o temp.44 C-47 C (przetwory mleczne- pożywka z dodatkiem 1 g mleka w proszku na 1 litr pożywki) - inkubacja 30 C- 72 h Oznaczanie liczby gronkowców koagulazododatnich wg normy PN- EN ISO 6888:1:2001+A 1:2004 Materiał badany: mleko odłtłuszczone w proszku, ser pleśniowy, kefir Roztwór fizjologiczny z peptonem Podłoże agar Baird-Parkera- posiew metodą powierzchniową po 0,1 ml zawiesiny na 2 płytki lub 1 ml zawiesiny na jedną dużą płytkę agarową Inkubacja 37 C 24 h- 48h Z każdej płytki przenieść 5 kolonii typowych lub 5 kolonii nietypowych do bulionu mózgowo-sercowego inkubacja 37 C- 24h Test koagulazy Oznaczanie liczby Bacillus cereus metodą płytkową wg normy PN-EN ISO 7932:2005 Materiał badany: sok owocowy, mleko w proszku, kefir, ser pleśniowy Roztwór fizjologiczny z peptonem Podłoże agarowe MYP rozprowadzić po 0,1 ml zawiesiny wyjściowej na 2 płytki z pożywką Inkubacja 30 C- 18-24 h 5 podejrzanych kolonii przesiewamy na agar z dodatkiem krwi baraniej Preparat barwiony metodą Grama Wynik: Podłoże MYP- duże, różowe kolonie (zdolność do fermentacji mannitolu)otoczone strefą zmętnienia (wytwarzanie lecytynazy) Podłoże agar z dodatkiem krwi baraniej- zdolność do wytwarzania hemolizy
ĆWICZENIE 4- Karta zaliczeniowa Test Określenie liczby bakterii kwaszących Obserwacje i wnioski Określenie liczby bakterii z grupy coli Wykrywanie obecności bakterii Campylobacter spp. Określenie liczby drożdży i pleśni Określenie liczby bakterii mezofilnych Określenie liczby gronkowców koagulazododatnich Określenie liczby bakterii Bacillus cereus Imię i nazwisko Zaliczenie
Kontrola stanu sanitarno-higienicznego zakładu przemysłowego Ćwiczenie 6. 1. Analiza mikrobiologiczna wody - określenie liczby bakterii tlenowych rosnących w temp.22 ⁰C - określenie liczby bakterii tlenowych rosnących w temp.37⁰c - określenie liczby pałeczek grupy coli metodą filtrów membranowych - określenie liczby paciorkowców kałowych z rodzaju Enterococcus 2. Analiza mikrobiologiczna powietrza i powierzchni - ocena czystości powietrza metodą sedymentacyjna - badanie czystości powierzchni metodą szablonową - badanie czystości powierzchni z zastosowaniem płytek kontaktowych (Count-tact) 3. Analiza czystości mikrobiologicznej rąk pracowników - określenie liczby bakterii tlenowych mezofilnych - wykrywanie obecności gronkowców koagulazo-dodatnich 4. Analiza czystości opakowań - określenie liczby bakterii tlenowych mezofilnych - wykrywanie obecności pałeczek grupy coli 4b. Kontynuacja ćwiczenia 2.a. Odczyt wykonanych poprzedniego dnia posiewów oraz wykonanie testów diagnostycznych służących identyfikacji drobnoustrojów 1. Analiza mikrobiologiczna wody Określenie liczba bakterii tlenowych rosnących w temp. 22⁰C 1ml wody wodociągowej posiać metodą posiewu wgłębnego na szalkę Petriego,a następnie zalać upłynnionym agarem odżywczym. Płytki inkubować w temp. 22⁰C przez 24h. Po inkubacji zliczyć wyrosłe kolonie. Określenie liczby bakterii tlenowych rosnących w temp.37 ⁰C 1ml wody wodociągowej posiać metodą posiewu wgłębnego na szalkę Petriego,a następnie zalać upłynnionym agarem odżywczym. Płytki inkubować w temp. 37⁰C przez 24h. Po inkubacji zliczyć wyrosłe kolonie. Określenie liczby pałeczek grupy coli metodą filtrów membranowych. Przefiltrować 2 porcje po 100 cm³ prez filtry membranowe o średnicy porów 0,45µm. Filtry umieścić na płytkach z podłożem MacConkey a i inkubować w temp. 37⁰C przez 24 godziny. Po inkubacji sprawdzić wyrosłe kolonie i wykonać szybkie testy identyfikacyjne (indol, malonian, KOH) Określenie liczby paciorkowców kałowych z rodzaju Enterococcus Przefiltrować 100 cm³ wody przez filtr membranowy. Filtr umieścić na płytce z podłożem Enterococcosel agar. Płytki inkubować w temp.37⁰c przez 24 godziny. Po inkubacji zliczyć charakterystyczne czarne kolonie wyrosłe na podłożu. 2. Analiza mikrobiologiczna powietrza i powierzchni Ocena czystości powietrza metodą sedymentacyjną Płytki z podłożem agar odżywczy oraz podłoże Sabourauda ustawić w miejscu gdzie chcemy przeprowadzić badanie powietrza. Płytki otworzyć i pozostawić na 5, 10 lub 15 minut podczas których następuje sedymentacja komórek na powierzchnię płytki. Po tym czasie zamknąć płytki i wstawić do inkubacji. Po inkubacji zliczyć wyrosłe kolonie,a liczbę bakterii i grzybów w 10 litrach powietrza (X) obliczyć ze wzoru: X= ( a x 100) / ( b x c ), a- Liczbakoloniiwyrosłychnapłytce b- Powierzchniapłytki c- C-współczynnik czasu ekspozycji wynoszący 1 dla 5 min, 2-10 min, 3-15 min. Wynik: Pomieszczenie produkcyjne przemysłu spożywczego Sale wykładowe i sale ćwiczeń Liczba bakterii tlenowych 500-600 jtk/m³ Nie więcej niż 2000 jtk/m³ Liczba grzybów 0-50 jtk/m³ Nie więcej niż 2000 jtk/m³ Badanie czystości powierzchni z zastosowaniem płytek kontaktowych (Count-Tact) Zdjąć pokrywkę płytki i przyłożyć podłoże bezpośrednio do badanej powierzchni, po czym nałożyć pokrywkę i inkubować. Po inkubacji zliczyć kolonie wyrosłe na powierzchni podłoża.
3. Analiza czystości mikrobiologicznej rąk pracowników Określenie liczby bakterii tlenowych mezofilnych Wykonać wymaz z wewnętrznej strony dłoni, a następnie wymazówkę umieścić w kolbie z solą fizjologiczną i wytrząsać 5 minut. Pobrać po 1 cm³ popłuczyn i metodą umieścić na sterylnej płytce Petriego. Płytkę zalać upłynnionym agarem odżywczym i inkubować w temp. 30⁰C przez 72 godziny. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie i przeliczyć na 40 cm³ płynu. Wykrywanie obecności gronkowców koagulazo-dodatnich Wykonać wymaz z wewnętrznej strony dłoni, a następnie wymazówkę umieścić w kolbie z solą fizjologiczną i wytrząsać 5 minut. Pobrać po 1 cm³ popłuczyn i posiać metodą powierzchniową na płytkę z podłożem Chapmana. Inkubować 37 ⁰C przez 24 h. Po inkubacji określić obecności żółtych kolonii, a następnie wykonać test koagulazy. Wymagania: Liczba bakteriit lenowych mezofilnych Obecność gronkowców koagulazododatnich Stopień czystości rąk Poniżej 100 Nb. Ręce czyste 100-1000 Nb. Ręce dostatecznie czyste Powyżej 1000 Nb. Ręce brudne 4. Analiza czystości opakowań Określenie liczby bakterii mezofilnych Do badanego naczynia np. butelki wlać 20 cm³ NaCl z dodatkiem 0,05 % tiosiarczanu sodu, który jest inaktywatorem pozostałości detergentów i środków dezynfekujących. Naczynie zamknąć korkiem a następnie ustawić w pozycji poziomej obracając ją płukać 20- krotnie całą jej powierzchnię. Po 1 cm³ popłuczyn przenieś na sterylną płytkę Petriego, po czym zalać upłynnionym agarem odżywczym. Inkubować w temp.30 ⁰C przez 72 h. Po inkubacji policzyć wyrosłe kolonie i przeliczyć na 20 cm³ płynu płuczącego. Wykrywanie obecności pałeczek grupy coli Do badanego naczynia np. butelki wlać 20 cm³ NaCl z dodatkiem 0,05 % tiosiarczanu sodu, który jest inaktywatorem pozostałości detergentów i środków dezynfekujących. Naczynie zamknąć korkiem a następnie ustawić w pozycji poziomej obracając ją płukać 20- krotnie całą jej powierzchnię. Po 1 cm³ popłuczyn przenieść na podłoże McConkey a. Inkubować w temp.30⁰c przez 48 h. Wymagania: Pojemność opakowania Liczba bakterii tlenowych Obecność pałeczek grupy coli Stopień czystości 1 litr Poniżej 1000 Nb. Dobry 1 litr Poniżej 1500 Nb. Dostateczny 0,5 litra Powyżej 500 Nb. Dobry 0,5 litra Poniżej 750 Nb. Dostateczny 0,25 litra Poniżej 200 Nb. Dobry 0,25 litra Poniżej 500 Nb. dostateczny
Ćwiczenie 6 - karta zaliczeniowa Test Określenie liczby bakterii tlenowych rosnących w temp.22 C Obserwacje i wnioski Określenie liczby bakterii tlenowych rosnących w temp.37 C Określenie pałeczek grupy coli metodą filtrów membranowych Określenie liczby paciorkowców kałowych z rodzaju Enterococcus Ocena czystości powietrza metodą sedymentacyjna Ocena czystości powierzchni z zastosowaniem płytek kontaktowych (Counttact) Określenie liczby bakterii tlenowych mezofilnych na rękach Wykrywanie obecności gronkowców koagulazododatnich na rękach Określenie liczby bakterii tlenowych mezofilnych na opakowaniu Wykrywanie obecności pałeczek grupy coli na opakowaniu Imię i nazwisko Zaliczenie
Ćwiczenie 7. Immobilizacja (unieruchomienie) enzymu i komórek drożdży. 1. W zlewce o objętości 100 cm³ przygotować 80 ml 1,5% roztwór CaCl2 w wodzie destylowanej 2. W próbówce sporządzić 2% roztwór alginianu sodu, w 5 ml wody destylowanej. Alginian sodu niezbyt dobrze rozpuszcza się w wodzie, wymaga ciepłej wody, wytrząsania i cierpliwości w czasie rozpuszczania ( roztwór alginianu ogrzewamy umieszczając w ciepłej wodzie- ogrzanej w małej zlewce na kuchence elektrycznej, lub w łaźni wodnej w temperaturze ok. 50-60ᵒC). 3. Odważyć/ odmierzyć 2g/ml drożdży piekarniczych/winiarskich. 4. Rozpuścić i wymieszać ( vortex) odważone drożdże w probówce zawierającej 5 ml wody destylowanej. Zakryć probówkę folią aluminiową i pozostawić do wyrośnięcia przez 10 minut w temperaturze pokowej. 5. Do probówki z rozpuszczonym alginianem wlać zawiesinę drożdży i wsypać całą zawartość kapsułki zawierającej bakterie z rodzaju Lactobacillus. Całość dokładnie wymieszać ( wytrząsanie, vortex). 6. Nabrać ok. 10 ml mieszaniny drożdży, bakterii i alginianu sodu do strzykawki- użyć wężyka gumowego, następnie zdjąć wężyk i dodawać powoli, po kropli roztwór do zlewki z 1,5% CaCl2. Nie wolno dopuścić aby końcówka strzykawki zetknęła się z roztworem CaCl2. Po wkropleniu całości należy dokładnie umyć strzykawkę, wężyk i używane probówki z pozostałości alginianu!!! 7. Pozostawić kulki immobilizowanych komórek drożdży i bakterii do utwardzenia w roztworze CaCl2 przez 10 minut. 8. Odcedzić powstałe kuleczki z roztworu CaCl2 za pomocą sitka ( przelewając zawartość przez sitko do drugiej zlewki) i pozostawić aż odciekną. 9. Kuleczki przechowywać w zlewce z jałową wodą destylowaną. 7. Przygotowanie fermentowanego mleka 1. Wlać ok. 300 ml mleka do zlewki 800-1000 ml, przykryć folią aluminiową i wstawić do łaźni wodnej o temperaturze ok. 40-45ᵒC na 10 minut (do kontroli temperatury wody użyc termometru) 2. Ogrzane mleko poddać procesowi homogenizacji- ok. 5 minut. 3. Po homogenizacji mleko spasteryzować zagotowując je na kuchence- w trakcie gotowania mleko należy od czasu do czasu zamieszać!!! 4. Po pasteryzacji mleko schłodzić do temperatury ok. 40ᵒC w zimniej wodzie. 5. Rozlać po ok. 150ml mleka do 2 jałowych kolb o pojemności 250-300 cm³, do pierwszej dodać 3-4 łyżeczki jogurtu naturalnego, do drugiej kuleczki immobilizowanych komórek drożdży i bakterii ( po uprzednim odcedzeniu, kuleczki pobrać łyżeczką plastikową). Całość delikatnie zamieszać. 6. Dokonać pomiaru ph mleka. Należy pamiętać, aby dokładnie płukać elektrodę wodą destylowaną i delikatnie ją osuszyć bibułą przed każdym pomiarem. 7. Szczelnie zakryć kolby folią aluminiową, opisać i inkubować w temperaturze ok. 30ᵒC przez ok. 1-2 godziny. 8. Po tym czasie wyciągnąć kolby z termostatu i przechowywać w chłodnym miejscu do kolejnych zajęć.
Ćwiczenie 7. - kontynuacja Wytwarzanie i analiza produktów mlecznych 1. Analiza wyników fermentacji mlekowej. Dokonać pomiaru ph otrzymanych produktów i opisać zaobserwowane zmiany ( konsystencja, barwa itd.) 2. Immobilizacja laktazy UWAGA!!! Wszystkie roztwory używane w doświadczeniu muszą być przygotowane na bazie wody destylowanej ( jony wapnia w wodzie kranowej mogą wchodzić w reakcje z alginianem sodu). 1. W zlewce o objętości 100 cm³ przygotować 80 ml 1,5 % roztwór CaCl2 w wodzie destylowanej. 2. W probówce sporządzić 2% roztwór alginianu sodu, w 5 ml wody destylowanej. Alginian sodu niezbyt dobrze rozpuszcza się w wodzie, wymaga ciepłej wody, wytrząsania i cierpliwości w czasie rozpuszczania ( roztwór alginianu ogrzewamy umieszczając w ciepłej wodzie- ogrzanej w małej zlewce na kuchence elektrycznej, lub w łaźni wodnej w temperaturze ok. 50-60ᵒC). 3. Za pomocą glukometru oznaczyć w mleku ( nie UHT), które będzie używane w doświadczeniu poziom glukozy 4. Wprowadzić do probówki z roztworem alginianu sodu zawartość kapsułki z enzymem laktazą. Całość dokładnie wymieszać (vortex) 5. Mieszaninę enzymu i alginianu pobrać do strzykawki- użyć wężyka gumowego i delikatnie wkraplać do zlewki z CaCl2. Nie wolno dopuścić aby końcówka strzykawki zetknęła się z roztworem CaCl2. Po wkropleniu całości należy dokładnie umyć strzykawkę, wężyk i używane probówki z pozostałości alginianu!!! 6. Pozostawić kulki immobilizowanego enzymu do utwardzenia w roztworze CaCl2 przez 10 minut. 7. Odcedzić powstałe kuleczki z roztworu Ca Cl2 za pomocą sitka ( przelewając zawartość przez sitko do drugiej zlewki) i pozostawić aż odciekną. 8. Jako kolumny wypełnionej immobilizowaną laktazą użyć cylindra strzykawki ( 10 ml). W tym celu należy wyjąć tłoczek ze strzykawki, umieścić w środku kawałeczek waty i ubić go delikatnie tłoczkiem tak aby grubość warstwy nie przekraczała 1 cm. Wata lub gaza zapobiegną blokowaniu wylotu cylindra strzykawki przez kuleczki enzymu. 9. Do strzykawki wprowadzić kuleczki unieruchomionego w alginianie enzymu (użyć plastikowej łyżeczki). 10. Przez tak przygotowaną kolumnę przelać powoli ok. 50 ml mleka. Otrzymaną frakcję zebrać do czystej zlewki o pojemności 50-100 ml i po kilku minutach oznaczyć w niej poziom glukozy za pomocą glukometru. OPRACOWANIE WYNIKÓW: - pomiary ph, opis otrzymanego produktu i na tej podstawie wyciągnięte wnioski o przebiegu i skutkach fermentacji, - pomiary poziomu glukozy w mleku i na tej podstawie wyciągnięte wnioski dotyczące aktywności laktazy.
Ćwiczenie 7 - karta zaliczeniowa Ćwiczenie Obserwacje Wnioski Immobilizacja (unieruchomienie) enzymu i komórek drożdży Fermentacja mleka Analiza fermentacji mlekowej Immobilizacja laktazy Pomiar glukozy za pomocą glukometru Imię i nazwisko Zaliczenie