TERMOCZUŁE GWIEŹDZISTE POLIMETAKRYLANY W ROZTWORZE I NA POWIERZCHNI

Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych Polskiej Akademii Nauk Autoreferat rozprawy doktorskiej Iwona Żymełka-Miara TERMOCZUŁE GWIEŹDZISTE POLIMETAKRYLANY W ROZTWORZE I NA POWIERZCHNI Promotor: Dr hab. inż. Agnieszka Kowalczuk Zabrze 2018

Spis treści 1. Wstęp... 2 2. Cel i zakres pracy... 3 3. Omówienie wyników badań... 4 3.1. Polimery gwieździste metakrylanów synteza i charakterystyka... 4 3.1.1. Hiperrozgałęziony poli(aryleno oksindol) rdzeń gwiazd... 4 3.1.2. Otrzymywanie gwiazd metodą polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomu (ATRP)... 5 3.1.3. Wyznaczenie liczby ramion gwiazd... 10 3.1.4. Zachowanie gwiazd w roztworach... 10 3.1.4.1. Termoczułość gwiazd poli(metakrylanów glikolu oligoetylenowego) w roztworach wodnych... 10 3.1.4.2. Rozmiary i agregacja gwiazd w roztworach... 12 3.1.5. Obrazowanie gwiazd metodami AFM i krio-tem... 16 3.1.6. Enkapsulacja małocząsteczkowego związku modelowego w rdzeniu gwiazdy... 17 3.1.7. Cytotoksyczność gwiazd... 19 3.2. Warstwy gwieździstych poli(metakrylanów glikolu oligoetylenowego) na podłożach... 20 3.2.1. Funkcjonalizacja podłoży szklanych i krzemowych... 20 3.2.2. Immobilizacja gwiazd na powierzchni... 21 3.2.3. Adhezja, proliferacja i odczepianie fibroblastów od termowrażliwych warstw polimerów gwieździstych... 23 4. Podsumowanie i wnioski... 25 5. Literatura... 27 6. Dorobek naukowy doktoranta... 28 1

1. Wstęp Na przestrzeni ostatnich kilkunastu lat obserwuje się stały wzrost zainteresowania polimerami o rozgałęzionej budowie, do których należą między innymi polimery gwieździste. Ramiona gwieździstych makrocząsteczek tworzą liniowe homopolimery lub kopolimery połączone kowalencyjnie z jednym, centralnym elementem tzw. rdzeniem (rys. 1). Rys. 1. Gwiazdy z ramionami zbudowanymi z a) homopolimeru b) z kopolimeru Szczególnym przykładem są amfifilowe polimery gwieździste o rozbudowanej strukturze rdzeń-powłoka (ang. core-shell ) zawierające centralny rdzeń, który różni się od powłoki budową, składem chemicznym oraz właściwościami. Powłokę takiej struktury tworzą często polimery reagujące na bodźce zewnętrzne m.in. temperaturę czy ph. Jedną z najczęściej opisywanych grup takich makrocząsteczek stanowią polimery termowrażliwe, które pod wpływem temperatury zmieniają w sposób odwracalny swoje właściwości fizykochemiczne. Najszerzej opisanym w literaturze i powszechnie stosowanym polimerem wrażliwym na temperaturę jest poli(n-izopropyloakryloamid) (PNIPAM) i jego kopolimery. Jednak w ostatnim czasie zainteresowanie badaczy skupia się na grupie poli(metakrylanów glikolu oligoetylenowego) (POEGMA), które stanowią alternatywę dla PNIPAM. Polimery te można w łatwy sposób otrzymać stosując techniki kontrolowanych polimeryzacji rodnikowych. Wykorzystując do kopolimeryzacji monomery OEGMA o różnej długości łańcuchów bocznych glikolu oligoetylenowego, można sterować dolną krytyczną temperaturą rozpuszczalności (LCST) otrzymanych materiałów. POEGMA są nietoksyczne, rozpuszczalne w wodzie i obojętne dla układu odpornościowego, dlatego znalazły szerokie zastosowanie w biomedycynie. Unikalny kształt, zwarta budowa, duża liczba grup funkcyjnych i własności makrocząsteczek gwieździstych powodują, że te wielofunkcyjne nanostruktury o zdefiniowanej budowie, mające z góry ustalony skład chemiczny, mogą być ściśle dedykowane do badań nad systemami kontrolowanego uwalniania leków czy do inżynierii komórkowej. Bardzo często gwiazdy wykazują wyższą bioaktywność w porównaniu z analogicznymi polimerami liniowymi. 2

2. Cel i zakres pracy Celem pracy doktorskiej było otrzymanie nowego typu termoczułych polimerów gwieździstych metakrylanów glikolu oligoetylenowego oraz zbadanie wpływu temperatury na ich zachowanie w roztworze i na powierzchni. Ponadto, w pracy wykazano możliwość zastosowania otrzymanych układów jako nośników substancji małocząsteczkowej w procesach enkapsulacji, a także jako termowrażliwych warstw polimerowych do hodowli i odczepiania fibroblastów. W pierwszej części pracy doktorskiej poświęcono uwagę syntezie, szczegółowej charakterystyce i zachowaniu makrocząsteczek gwieździstych wyżej wspomnianych polimetakrylanów w roztworach organicznych oraz wodnych poniżej i powyżej temperatury przejścia fazowego. Gwiazdy o dobrze zdefiniowanej budowie zostały wykorzystane jako nośniki modelowej substancji hydrofobowej. W drugiej części pracy opisane zostały termowrażliwe warstwy polimerów gwieździstych z ramionami poli(metakrylanów glikolu oligoetylenowego) immobilizowanych na podłożach stałych metodą szczepienia do. Metoda ta pozwoliła na uzyskanie stabilnej warstwy o dobrze zdefiniowanych właściwościach poprzez kowalencyjne przyłączenie gwiazd do podłoża. Zakres pracy obejmował: syntezy polimerów gwieździstych z hiperrozgałęzionym rdzeniem na drodze polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomu, metodą rdzeń najpierw, potwierdzenie struktury otrzymanych polimerów, wyznaczenie mas molowych za pomocą chromatografii żelowej z wielokątowym rozpraszaniem światła, zbadanie termowrażliwości wodnych roztworów polimerów za pomocą spektroskopii UV-VIS, ustalenie temperatur przejścia fazowego, zbadanie zachowania otrzymanych polimerów gwieździstych w roztworach organicznych oraz wodnych poniżej i powyżej temperatury przejścia fazowego techniką dynamicznego i statycznego rozpraszania światła, charakterystykę otrzymanych gwiazd na powierzchni za pomocą mikroskopii sił atomowych oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej, enkapsulację hydrofobowej substancji małocząsteczkowej w rdzeniu gwiazd, określenie cytotoksyczności otrzymanych makrocząsteczek gwieździstych, przygotowanie podłoży szklanych i krzemowych, immobilizację polimeru gwieździstego na podłożu oraz szczegółowe zbadanie właściwości otrzymanych powierzchni pod kątem morfologii oraz zwilżalności po każdym etapie funkcjonalizacji podłoża, hodowlę fibroblastów na otrzymanej warstwie polimeru gwieździstego i odczepienie wyhodowanego arkusza komórek po obniżeniu temperatury. 3

3. Omówienie wyników badań 3.1. Polimery gwieździste metakrylanów synteza i charakterystyka Poli(metakrylany glikolu oligoetylenowego) to nowa generacja rozpuszczalnych w wodzie polimerów zawierających w łańcuchu bocznym do kilkudziesięciu jednostek glikolu etylenowego [1]. Ze względu na swoją termowrażliwość polimery tej grupy są obecnie szeroko badane. Przejście fazowe tych polimerów wywołane zmianą temperatury przebiega w sposób odwracalny, bez histerezy. Polimery te mogą być otrzymane na drodze kontrolowanych polimeryzacji rodnikowych, które pozwalają otrzymać makrocząsteczki o różnej topologii łańcucha. Polimery o budowie gwieździstej zostały otrzymane na drodze polimeryzacji ATRP metodą rdzeń najpierw. W metodzie tej ramiona gwiazd powstają w wyniku polimeryzacji odpowiednich monomerów w obecności wielofunkcyjnych makroinicjatorów (rdzeni gwiazd) mających ściśle określoną liczbę centrów aktywnych, co prowadzi do powstania gwiazd o określonej liczbie ramion [2, 3] (rys. 2). Metoda ta obejmuje następujące etapy: syntezę wielofunkcyjnego makroinicjatora, polimeryzację wybranego monomeru z wykorzystaniem inicjujących centrów aktywnych makroinicjatora. Rys. 2. Schemat metody rdzeń najpierw 3.1.1. Hiperrozgałęziony poli(aryleno oksindol) rdzeń gwiazd Do otrzymania polimerów gwieździstych metodą rdzeń najpierw został wykorzystany wielofunkcyjny, hiperrozgałęziony inicjator poli(aryleno oksindol) PArOx (rys. 3). Polimer ten został zsyntezowany w zespole prof. M. Smeta z Katolickiego Uniwersytetu w Leuven, w Belgii podczas odbytego przez doktorantkę stażu badawczego. 4

Rys. 3. Struktura PArOx z grupami 2-bromoestrowymi Makroinicjator PArOx został otrzymany w wyniku reakcji polikondensacji monomerów typu AB 2. Liczba grup 2-bromoestrowych rdzenia zdolnych do inicjowania polimeryzacji ATRP metakrylanów wyniosła 28, a stopień rozgałęzienia PArOx był równy 100 % [4]. Liczbowo średnia masa molowa rdzenia wyznaczona za pomocą GPC-MALLS wynosiła M n =21 000 g/mol, a dyspersja M w /M n =1,70. 3.1.2. Otrzymywanie gwiazd metodą polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomu (ATRP) W pracy zsyntezowano gwiazdy z trzema rodzajami ramion: ramionami homopolimeru metakrylanu glikolu dietylenowego tzw. gwiazdy PDEGMA, ramionami bezładnego kopolimeru metakrylanu glikolu dietylenowego i metakrylanu glikolu oligoetylenowego zwane dalej P(DEGMA-ran-OEGMA), ramionami bezładnego kopolimeru metakrylanu glikolu dietylenowego, metakrylanu glikolu oligoetylenowego i metakrylanu glicydylu tzw. gwiazdy P(DEGMA-ran-OEGMA-ran-GMA). Gwiazdy z ramionami homopolimeru metakrylanu glikolu dietylenowego Polimeryzacja przebiegała według schematu przedstawionego na rysunku 4. Rys. 4. Schemat syntezy gwiazd z ramionami PDEGMA 5

W polimeryzacji jako układ katalityczny zastosowano bromek miedzi (I), bromek miedzi (II) i pentametylodietylenotriaminę (PMDETA) w stosunku molowym [CuBr]:[CuBr 2 ]:[PMDETA]=1:0,2:2. Stosunek molowy [DEGMA]:[PArOx] wynosił 2800, co odpowiadało 100 molom monomeru na jeden mol cząsteczek inicjatora. Reakcja była prowadzona w anizolu, w temperaturze 40 C. Takie warunki pozwoliły na uzyskanie szeregu dobrze zdefiniowanych polimerów o monomodalnych rozkładach mas molowych (gwiazdy G1-G5, tabela T1). Chromatografia żelowa z detekcją wielokątowego rozpraszania światła (GPC-MALLS) umożliwia pomiar absolutnych wartości mas molowych otrzymanych polimerów o strukturze rozgałęzionej. Tabela T1. Polimeryzacja DEGMA w obecności makroinicjatora PArOx w anizolu Próbka Czas polimeryzacji [min] Konwersja DEGMA [%] DP ramienia a M teor [g/mol] M n GPCb MALLS [g/mol] M w /M n dn/dc [ml/g] G1 60 21 21 130 667 111 600 1,41 0,102 G2 120 23,4 23,4 143 321 138 000 1,37 0,101 G3 240 25,8 25,8 155 970 168 400 1,40 0,100 G4 300 26,8 26,8 161 240 172 600 1,42 0,099 G5 360 27,1 27,1 162 821 189 700 1,37 0,099 a obliczony z konwersji monomeru b zmierzona za pomocą GPC-MALLS w THF Masy molowe gwiazd wyznaczone z pomiarów GPC-MALLS są zbliżone do wartości teoretycznych (tabela T1), co świadczy o dobrej kontroli polimeryzacji. Zwiększenie stosunku molowego [DEGMA]:[PArOx] do 4200 pozwoliło na otrzymanie gwiazdy o wyższej masie molowej. W reakcji, podobnie jak w poprzednich syntezach, jako układu katalitycznego użyto bromku miedzi (I), bromku miedzi (II) i jako ligandu PMDETA w stosunku molowym [CuBr]:[CuBr 2 ]:[PMDETA]=1:0,2:2. Otrzymano gwiazdę G6 o masie molowej M n =420 000 g/mol; M w /M n =1,82 i stopniu polimeryzacji ramion DP=97. Gwiazdy z ramionami kopolimeru bezładnego metakrylanu glikolu dietylenowego i metakrylanu glikolu oligoetylenowego Głównym celem wprowadzenia do ramion gwiazd drugiego komonomeru metakrylanu glikolu oligoetylenowego (M n =300 g/mol) (OEGMA) było obniżenie temperatury przejścia fazowego (T cp ) takich polimerów do zakresu temperatury fizjologicznej. W syntezie gwiazd założony stosunek DEGMA do OEGMA wynosił 4:1 na jedną cząsteczkę makroinicjatora. 6

Schemat przebiegu reakcji powstawania gwiazd z ramionami P[DEGMA-ran-OEGMA] przedstawiono na rysunku 5. Rys. 5. Schemat syntezy polimerów gwieździstych z ramionami kopolimeru P(DEGMA-ran-OEGMA) Otrzymano gwiazdy GK1-GK4 o liczbowo średnich masach molowych od M n =150 000 do prawie 250 000 g/mol (tabela T2) i M w /M n nieprzekraczającym 1,50. Tabela T2. Kopolimeryzacja DEGMA i OEGMA w obecności makroinicjatora PArOx w anizolu Próbka Czas polimeryzacji [min] Konwersj a DEGMA/ OEGMA [%] DP ramienia a M teor [g/mol] M n b [g/mol] M w /M n dn/dc [ml/g] GK1 60 18,7/15,9 18 125 554 153 300 1,44 0,100 GK2 120 31,2/26,4 30 195 895 203 500 1,41 0,093 GK3 180 32,7/26,6 32 202 555 238 600 1,42 0,093 GK4 300 37,8/32,5 37 233 970 247 300 1,36 0,091 a obliczony z konwersji monomerów b zmierzona za pomocą GPC-MALLS w THF W celu otrzymania gwiazd z dłuższymi ramionami zwiększono stosunek molowy monomerów do inicjatora, uzyskując polimery o masach molowych zestawionych w tabeli T3. Tabela T3. Kopolimeryzacja DEGMA i OEGMA w obecności makroinicjatora PArOx w anizolu (większe stosunki molowe) Próbka Czas [min] Stosunek molowy [DEGMA]: [OEGMA]: [PArOx] konwersja DEGMA/ OEGMA [%] DP ramienia a DEGMA/ OEGMA M n GPC- b MALLS [g/mol] M w /M n dn/dc [ml/g] GK5 1440 2240:560:1 36/30 29/6 480 000 2,08 0,083 GK6 1440 4480:1120:1 46/35 147/28 880 000 1,88 0,083 a obliczony z konwersji monomerów b mierzona za pomocą GPC-MALLS w THF 7

Aby uniknąć reakcji sprzęgania gwiazd, polimeryzacje prowadzono do niskich konwersji monomerów (<50 %). Wartości M w /M n struktur gwieździstych z dłuższymi ramionami (gwiazdy GK5 i GK6, tabela T3) były wyższe, przy czym obserwowano nadal monomodalne rozkłady mas. Obecność DEGMA i OEGMA w ramionach gwiazd potwierdzono techniką NMR. Amfifilowy charakter gwiazd P(DEGMA-ran-OEGMA) potwierdzono wykonując widma w rozpuszczalnikach o różnym powinowactwie do rdzenia i ramion gwiazd. Gwiazdy z ramionami z kopolimeru bezładnego metakrylanu glikolu dietylenowego, metakrylanu glikolu oligoetylenowego i metakrylanu glicydylu Trzecim komonomerem wprowadzonym do ramion gwiazd był metakrylan glicydylu. Wprowadzenie reaktywnego pierścienia epoksydowego, pozwoliło na chemiczną immobilizację gwiazd poli(metakrylanów glikolu oligoletylenowego) na odpowiednio sfunkcjonalizowanych podłożach. Na rysunku 6 przedstawiono przebieg reakcji syntezy gwiazd z ramionami z kopolimeru metakrylanu glikolu dietylenowego, metakrylanu glikolu oligoetylenowego i metakrylanu glicydylu. Rys. 6. Schemat syntezy kopolimerów gwieździstych z ramionami P[DEGMA-ran-OEGMA-ran-GMA] Synteza gwiazd z ramionami P(DEGMA-ran-OEGMA-ran-GMA) była prowadzona w takich samych warunkach jak gwiazd GK5 i GK6. Otrzymano dwa polimery GP1 i GP2 o różnej zawartości merów OEGMA. Gwiazdy te różniły się długością ramion, a tym samym masą molową. Odpowiedni dobór udziału jednostek OEGMA w składzie ramion struktur gwieździstych pozwoliły na uzyskanie gwiazd o pożądanej temperaturze przejścia fazowego. Stosunek molowy dla gwiazdy GP1 [DEGMA]:[OEGMA]:[GMA]:[PArOx] wynosił odpowiednio 3360:840:840:1, co odpowiadało 120 molom DEGMA, 30 molom OEGMA i 30 molom GMA na jeden mol cząsteczek PArOx. Gdy konwersja DEGMA wynosiła 29 %, 8

a konwersja OEGMA 14 % do układu reakcyjnego wprowadzono trzeci komonomer metakrylan glicydylu. Polimeryzację zatrzymano, gdy konwersja GMA wynosiła 22 %. Stosunek molowy monomerów do inicjatora dla gwiazdy z ramionami P(DEGMA-ran-OEGMAran-GMA) GP2 wynosił odpowiednio [DEGMA]:[OEGMA]:[GMA]:[PArOx]=2800:700:700:1, co odpowiadało 100 molom DEGMA, 25 molom OEGMA i GMA na jeden mol cząsteczek inicjatora. Zestawienie warunków polimeryzacji oraz uzyskane wartości liczbowo średnich mas molowych i ich dyspersje przedstawiono w tabeli 4. Tabela T4. Polimeryzacja monomerów DEGMA, OEGMA, GMA w obecności makroinicjatora PArOx w anizolu Próbka Czas polimeryzacji [min] Stosunek molowy [DEGMA]: [OEGMA]: [GMA]:[PArOx] konwersja DEGMA/ OEGMA/ GMA [%] DP ramienia a DEGMA/ OEGMA/ GMA M n GPCb MALLS [g/mol] M w /M n dn/dc [ml/g] GP1 1440 3360:840:840:1 GP2 1440 2800:700:700:1 a obliczony z konwersji monomerów b zmierzona za pomocą GPC-MALLS w DMF 40/20/2 2 36/40/2 0 48/6/7 380 000 1,43 0,063 36/10/5 300 000 1,24 0,060 Rozkłady mas molowych gwiazd GP1 i GP2 były monomodalne i stosunkowo wąskie. Obecność komonomerów w ramionach gwiazd P[DEGMA-ran-OEGMA-ran-GMA] została potwierdzona metodą NMR. Na widmie 1 H NMR obserwowano charakterystyczne sygnały pochodzące od grup CH i CH 2 występujące w pierścieniu epoksydowym merów metakrylanu glicydylu. Obecność tych sygnałów świadczy o tym, że pierścień epoksydowy pozostał nienaruszony podczas reakcji polimeryzacji oraz w trakcie oczyszczania produktu. 9

3.1.3. Wyznaczenie liczby ramion gwiazd Reakcja hydrolizy w warunkach alkalicznych jest bardzo często stosowana do wyznaczenia funkcyjności polimerów gwieździstych zawierających w swojej budowie wiązania estrowe pomiędzy rdzeniem i ramionami. Jest to reakcja selektywna, nienaruszająca ugrupowań estrów metakrylowych znajdujących się w ramionach gwiazdy. Reakcję hydrolizy gwiazd PDEGMA i P(DEGMA-ran-OEGMA) prowadzono w KOH w etanolu. Produkt hydrolizy oczyszczano przez dializę i charakteryzowano za pomocą GPC-MALLS, wyznaczając liczbowo średnią masę molową odciętych ramion gwiazdy (M n ramion ). Uzyskane wyniki dla gwiazd G6, GK5 i GK6 zebrano w tabeli T5. Tabela T5. Charakterystyka gwiazd G6, GK5 i GK6 przed hydrolizą po hydrolizie Nazwa próbki gwiazda ramiona M n [g/mol] M w /M n DP ramienia M n [g/mol] M w /M n f teor f obl a G6 420 000 1,82 97 18 300 1,13 28 22 GK5 480 000 2,08 96 22 700 1,12 28 20 GK6 880 000 1,88 166 39 000 1,12 28 22 a f obliczona ze wzoru Niska dyspersja mas molowych ramion (M w /M n <1,2) wskazuje na ich jednakową długość oraz potwierdza pośrednio dobrą kontrolę nad syntezą gwiazd. 3.1.4. Zachowanie gwiazd w roztworach 3.1.4.1. Termoczułość gwiazd poli(metakrylanów glikolu oligoetylenowego) w roztworach wodnych Wszystkie gwiazdy otrzymane w pracy doktorskiej były rozpuszczalne w wodzie i wykazywały termowrażliwość. Do badań termowrażliwości wybrano gwiazdy o stosunkowo wysokich masach molowych, w tym gwiazdę z ramionami PDEGMA (próbka G6), oraz gwiazdy z ramionami kopolimeru P(DEGMAran-OEGMA) (próbki GK5, GK6). Wyznaczenie wartości T cp gwiazd było istotne dla badań agregacji tych polimerów pod wpływem zmiany temperatury roztworu. 10

Termowrażliwość wodnych roztworów badano w zakresie temperatur od 15 C do 30 C dla gwiazdy G6, a dla gwiazd GK5 i GK6 w zakresie od 20 C do 45 C. Na rysunku 8 przedstawiono zależność transmitancji od temperatury dla dwóch różnych struktur - gwiazdy G6 i polimeru liniowego DEGMA L1. Masa molowa polimeru liniowego była zbliżona do masy molowej ramienia gwiazdy i wynosiła M n =8100 g/mol. Temperatura przejścia fazowego gwiazdy G6 wyniosła 22 C i była niższa o 4 C od T cp jej odpowiednika liniowego dla roztworów o tym samym stężeniu. Rys. 8. Zależność transmitancji od temperatury dla roztworu a) gwiazdy z ramionami PDEGMA (próbka G6) i liniowego PDEGMA (próbka L1) (c=1g/l), b) gwiazd z ramionami P(DEGMA-ran-OEGMA) (próbki GK5 i GK6) (c=1g/l) Zaobserwowana niższa T cp gwiazdy G6 związana jest z obecnością w makrocząsteczce silnie hydrofobowego rdzenia gwiazd. Rdzeń powoduje zwiększenie hydrofobowego charakteru całej makrocząsteczki, obniżając tym samym temperaturę przejścia fazowego, co zaobserwowano również dla gwiazd typu core-shell opisanych w pracach [5, 6]. Temperatura przejścia fazowego T cp gwiazdy homopolimeru G6 wynosiła 21 C, co było niekorzystne dla planowanych zastosowań otrzymanych polimerów gwieździstych. Jak wiadomo z doniesień literaturowych wprowadzenie drugiego, bardziej hydrofilowego monomeru metakrylanu glikolu oligoetylenowego powoduje podwyższenie temperatury przejścia fazowego [5]. Dla gwiazd P(DEGMA-ran-OEGMA) temperatury przejścia fazowego wyniosły odpowiednio dla gwiazdy GK5 T cp =33 C i dla gwiazdy GK6 T cp =34 C. Wartości te były wyższe od T cp gwiazdy z ramionami homopolimeru (rys. 8b). Jednym z celów pracy doktorskiej było otrzymanie warstw polimerów gwieździstych, które znalazłyby zastosowanie w badaniach adhezji, proliferacji i odczepiania komórek fibroblastów. Wymagało to przygotowania odpowiedniego podłoża polimerowego, które reagowałoby na zmiany temperatury, czyli było termowrażliwe. Aby otrzymać takie podłoże, konieczne było otrzymanie termowrażliwej gwiazdy, o składzie ramion zapewniającym zmianę filowości podłoża w wymaganym zakresie temperatur hodowli komórkowej. W tym celu otrzymano gwiazdę z ramionami P(DEGMA-ran-OEGMA-ran-GMA) GP1. Temperaturę przejścia fazowego dla gwiazdy GP1 wyznaczono w roztworze wodnym o stężeniu 1 g/l i wyniosła ona 37 C. Ze względu na badania biologiczne, temperatura 11

przejścia fazowego gwiazdy GP1 została również wyznaczona w pożywce DMEM ATMP, w której prowadzi się hodowle komórkowe. Temperaturę przejścia fazowego badano w zakresie temperatur od 20 C do 45 C. Gwiazda GP1 w roztworze DMEM ATMP o stężeniu 1 g/l wykazywała przejście fazowe w temperaturze 29 o C. Do badań cytotoksyczności wybrano gwiazdę o większym udziale OEGMA (GP2) wykazującą odpowiednio wyższą temperaturę przejścia fazowego (w porównaniu z GP1), co zapewniło jej rozpuszczalność w warunkach badania przeżywalności komórek. Uzyskane wyniki zależności transmitancji w funkcji temperatury dla roztworów wodnych i w pożywce DMEM ATMP gwiazd GP1 i GP2 zebrano w tabeli T6. Tabela T6. Wartości temperatur przejścia fazowego dla gwiazd GP1 i GP2 w roztworach wodnych i medium hodowlanym WODA T cp [ C] DMEM ATMP GP1 37 29 GP2 52 45 3.1.4.2. Rozmiary i agregacja gwiazd w roztworach Wyznaczenie rozmiarów polimerów gwieździstych otrzymanych w pracy doktorskiej ma istotne znaczenie dla ich dalszego badania np. w systemach kontrolowanego uwalniania substancji aktywnych lub w otrzymywaniu warstw polimerów rozgałęzionych. Rozmiary gwiazd z ramionami PDEGMA i P(DEGMA-ran-OEGMA) (G6, GK5 i GK6) wyznaczono za pomocą techniki dynamicznego i statycznego rozpraszania światła w roztworach wodnych oraz dla porównania w rozpuszczalnikach organicznych. Pomiary statycznego i dynamicznego rozpraszania światła w acetonie W pierwszym etapie badań gwiazdy (G6, GK5 i GK6) charakteryzowano w acetonie, który jest dobrym rozpuszczalnikiem zarówno dla rdzenia jak i ramion tych struktur. Otrzymane wyniki uzyskane z pomiarów rozpraszania światła przeprowadzonych w acetonie zestawiono w tabeli T7. W tabeli, dla porównania, zamieszczono również wartości M w i R g zmierzone w THF metodą GPC-MALLS. 12

Tabela T7. Wartości masy molowej, rozmiarów, drugiego współczynnika wirialnego oraz współczynnika dyfuzji gwiazd z ramionami PDEGMA (G6) i z ramionami P(DEGMA-ran-OEGMA) (GK5 i GK6) Próbka GPC-MALLS THF SLS w acetonie DLS w acetonie R g [nm] M w [g/mol] M w [g/mol] R g [nm] A 2 [ml mol/g 2 ] R h [nm] D 0 [m 2 /s] (ρ) w acetonie ρ G6 15 770 000 750 000 9.8 10-5 14.3 4.63 10-11 GK5 15 1 000 000 980 000 16 8.9 10-5 16.7 3.98 10-11 0.96 GK6 20,6 1 660 000 1 700 000 22 1.5 10-5 24.4 2.72 10-11 0.90 Wartości wagowo średnich mas molowych badanych gwiazd wyznaczone techniką SLS w acetonie były podobne do wartości uzyskanych metodą GPC-MALLS w THF, co potwierdziło, że gwiazdy w rozpuszczalnikach organicznych są izolowanymi makrocząsteczkami i nie wykazują tendencji do agregowania. Uzyskane wartości R h gwiazd G6, GK5 i GK6 (tabela T7) wskazują, że makrocząsteczki gwieździste są izolowane w acetonie i nie agregują do większych struktur (rys. 9). Rys. 9. Rozkład rozmiarów gwiazdy z ramionami PDEGMA (a) oraz gwiazd z ramionami P(DEGMA-ran-OEGMA) (b) i (c) w acetonie, przy kącie pomiaru θ=90 (próbki G6, GK5 i GK6, tabela T13, c=1 g/l) Do charakterystyki makrocząsteczek w roztworach wykorzystano również tzw. współczynnik kształtu () [7]. Obliczone wartości współczynnika kształtu dla badanych polimerów gwieździstych GK5 i GK6 są wyższe niż przewidywane dla zwartej, gęsto upakowanej kuli (0,775 ale niższe niż przewidziane teoretycznie dla regularnej gwiazdy z dyspersyjnymi ramionami w warunkach teta (θ) (1,225) [7, 8]. W literaturze takie struktury w dobrym rozpuszczalniku są określane przez niektórych autorów jako tzw. miękkie sfery (ang. soft spheres ) [9-11]. 13

Rozmiary gwiazd z ramionami P(DEGMA-ran-OEGMA-ran-GMA) GP1 i GP2 zostały zmierzone techniką DLS pod kątem 90. Uzyskano wartości pozornego R h 90 w acetonie. Dla gwiazdy GP1 pozorny promień hydrodynamiczny w 90 wynosił 16 nm, a dla gwiazdy GP2 14 nm. Rozkład rozmiarów gwiazd z ramionami kopolimeru P(DEGMA-ran-OEGMAran-GMA) był wąski i monomodalny. Z uzyskanych wartości R h 90 wynika, że gwiazdy GP1 i GP2 podobnie jak opisane wcześniej gwiazdy G6, GK5 i GK6 również występują w acetonie jako izolowane makrocząsteczki. Rozkłady rozmiarów promieni hydrodynamicznych dla gwiazd GP1 i GP2 przedstawiono na rysunku 10. Rys. 10. Rozkłady rozmiarów gwiazd z ramionami P(DEGMA-ran-OEGMA-ran-GMA) w acetonie, przy kącie pomiaru θ=90 (próbka GP1 a), próbka GP2 b) c=1 g/l) Pomiary statycznego i dynamicznego rozpraszania światła w wodzie Zachowanie gwiazd PDEGMA oraz P(DEGMA-ran-OEGMA) (G6, GK5, GK6) zbadano również w roztworach wodnych. Woda jest selektywnym rozpuszczalnikiem dla takich makrocząsteczek stanowi dobry rozpuszczalnik jedynie dla ramion i nie penetruje silnie hydrofobowego rdzenia. Wyniki uzyskane z pomiarów SLS i DLS dla gwiazd G6, GK5, GK6 w roztworze wodnym poniżej i powyżej T cp zostały zebrane w tabeli T8. Tabela T8. Rozmiary, współczynnik dyfuzji D 0 (<T cp ) i współczynnik kształtu (ρ) gwiazd PDEGMA, P(DEGMA-ran-OEGMA) w wodzie poniżej i powyżej T cp Poniżej T cp Powyżej T cp Próbka D 0 [m 2 /s] R h [nm] R g [nm] ρ R h 90 [nm] R g [nm] ρ G6 1,8 10-11 12 18 1,50 145 98 0,68 GK5 1,9 10-11 11 19 1,72 100 100 1,00 GK6 0,96 10-11 22 24 1,09 90 112 1,24 14

Poniżej temperatury przejścia fazowego wartości promieni R g oraz R h badanych gwiazd były zbliżone do wartości uzyskanych w dobrym rozpuszczalniku. Rozmiary gwiazd odpowiadały rozmiarom pojedynczych makrocząsteczek zmierzonych w acetonie. Dla wszystkich gwiazd rozkład rozmiarów promienia hydrodynamicznego był monomodalny. Zbadano również wpływ stężenia na rozmiar uzyskanych polimerów gwieździstych w temperaturze 18 C gwiazdy G6 i w 25 C gwiazd GK5 i GK6. Badanie przeprowadzono w zakresie stężeń od c=1 do 6 g/l.w całym zakresie stosowanych stężeń, poniżej temperatury przejścia fazowego, nie zaobserwowano zmiany wartości promieni hydrodynamicznych gwiazd G6, GK5 i GK6, co świadczy o braku agregacji (rys. 11) Rys. 11. Zależność promienia hydrodynamicznego od stężenia gwiazd w wodzie poniżej T cp (próbki G6, GK5, GK6) Badania zachowania gwiazd w roztworze wodnym zostały przeprowadzone w temperaturze 35 C dla G6 i w temperaturze 45 C dla GK5 i GK6. Powyżej T cp zostały wyznaczone wartości promienia hydrodynamicznego (R h 90 ) otrzymanych gwiazd przy wartości kąta θ=90. Zakres stosowanych stężeń wynosił od 1 do 5 g/l. Otrzymane struktury gwieździste powyżej temperatury przejścia fazowego ulegały samoorganizacji do większych struktur o rozmiarach zależnych od stężenia roztworu (rys. 12) Rys. 12. Zależność promienia hydrodynamicznego od stężenia gwiazd w wodzie powyżej T cp (próbki G6, GK5, GK6) 15

Jak można było zauważyć gwiazda GK6 agregowała do znacznie większych struktur o rozmiarach sięgających nawet 1m (rys. 12). Wartości pozornego promienia hydrodynamicznego (R h 90 ) zmierzone w wodzie poniżej temperatury przejścia fazowego gwiazd GP1 i GP2 wynosiły odpowiednio R h =20 nm i R h =18 nm. 3.1.5. Obrazowanie gwiazd metodami AFM i krio-tem Rozmiary oraz kształt gwiazd G6, GK5, GK6 naniesionych na powierzchnię wyznaczono za pomocą dwóch technik obrazowania: mikroskopii sił atomowych AFM oraz elektronowej mikroskopii transmisyjnej krio-tem, umożliwiającej obrazowanie próbek w stanie zamrożonym (szklistym), nienaruszającym struktury badanej makrocząsteczki. Średnice gwiazd uzyskane z wykorzystaniem obrazowania metodą AFM i krio-tem są zbliżone, co potwierdza, że w acetonie i w wodzie poniżej T cp gwiazdy istnieją jako izolowane makrocząsteczki. W wodzie powyżej T cp gwiazdy agregują do większych struktur. Rozmiary gwiazd obrazowanych metodami AFM i krio-tem są zgodne z wynikami otrzymanymi metodą DLS. Zdjęcia potwierdzają kulisty kształt otrzymanych polimerów gwieździstych. W tabeli T9 zebrano i porównano rozmiary makrocząsteczek gwieździstych otrzymanych metodami DLS, AFM i krio-tem. Tabela T9. Rozmiary gwiazd wyznaczone technikami: DLS, AFM i krio-tem Aceton Woda poniżej T cp Woda powyżej T cp Próbka D h DLS [nm] D h AFM [nm] D h DLS [nm] D h AFM [nm] D h krio-tem [nm] D h DLS [nm] D h krio-tem [nm] G6 28 20 22 20 22 290 280 GK5 32 40 23 24 25 200 240 GK6 48 50 NIE MIERZONE Na rysunku 13 zostały przedstawione przykładowe zdjęcia AFM gwiazd G6, GK5 i GK6 naniesionych z roztworu acetonu. 16

a) b) c) Rys. 13. Obrazy AFM gwiazd G6 (a), GK5 (b), GK6 (c) naniesionych metodą spin-coating z roztworu acetonu na powierzchnię miki 3.1.6. Enkapsulacja małocząsteczkowego związku modelowego w rdzeniu gwiazdy W ramach pracy doktorskiej wykonano próby enkapsulacji modelowego związku małocząsteczkowego we wnętrzu otrzymanych gwiazd w wodzie poniżej temperatury przejścia fazowego. Jako substancji małocząsteczkowej użyto 4-dicyjanometyleno-2-metylo-6-4- dimetyloamino-styrylo-4h-piranu (4-HP). Jako modelowy nośnik polimerowy wybrano gwiazdę z ramionami P(DEGMA-ran-OEGMA) (próbka GK5). Enkapsulacja 4HP została zbadana przy użyciu spektroskopii fluorescencyjnej. Użyta sonda fluorescencyjna jest związkiem prawie nierozpuszczalnym w wodzie. W rozpuszczalnikach 17

intensywność emisji polarnych na widmie emisyjnym wykazuje maksimum przy długości fali 620 nm, podczas gdy zmniejszenie polarności środowiska indukuje przesunięcie widma emisji fluorescencji w stronę światła widzialnego. Pomiary prowadzono w środowisku wodnym, w zakresie stężeń od 0,5 do 3 g/l. Roztwory wodne polimeru gwieździstego zawierającego sondę GK5-4HP wykazywały przesunięcie maksimum emisji światła w stronę niższych długości fali. Zjawisko to było spowodowane enkapsulacją sondy 4HP do wnętrza hydrofobowego rdzenia gwiazdy GK5 (rys. 14) 50 40 G_ko_1 0,5 g/l (582 nm) 0,75 g/l (581 nm) 1 g/l (580 nm) 2 g/l (579 nm) 3 g/l (571 nm) 4HP w wodzie (620 nm) 30 20 c 10 0 450 500 550 600 650 700 750 800 długość fali [nm] Rys. 14. Intensywność emisji fluorescencji sondy 4HP w funkcji długości fali dla różnych stężeń gwiazdy z ramionami kopolimeru (DEGMA-ran-OEGMA) w wodzie (próbka GK5) Stwierdzono, że poniżej stężenia polimeru równego 1g/L rozmiary gwiazd pozostały niezmienione, co potwierdza, że ładowanie sondy zachodzi do pojedynczych gwiazd (rys. 15). Rys. 15. Zależność promienia hydrodynamicznego w funkcji stężenia kompleksu 4HP-GK5 W następnym etapie badań wyznaczono maksymalną liczbę cząsteczek 4HP, która może wniknąć do rdzenia pojedynczych gwiazd. Badania prowadzono przy stałym stężeniu gwiazdy c=1 g/l. Skuteczność załadowania 4HP do wnętrza pojedynczej gwiazdy wyniosła 10 cząsteczek sondy na jedną makrocząsteczkę gwieździstą. Dalsze ładowanie sondy powodowało wzrost rozmiarów gwiazd i agregację do większych struktur gwieździstych (rys.16). 18

Rys. 16. Zależność intensywności emisji 4HP od liczby załadowanych cząsteczek sondy Próby enkapsulacji małocząsteczkowej substancji modelowej wykazały, że gwiazdy mogą być użyte jako nanonośniki w odpowiednim zakresie stężeń i przy odpowiednim stosunku cząsteczek nośnika do polimeru. 3.1.7. Cytotoksyczność gwiazd Do badań toksyczności wybrano polimer gwieździsty z ramionami P(DEGMA-ran-OEGMAran-GMA) (gwiazda GP2), którego temperatura przejścia fazowego mierzona w pożywce hodowlanej DMEM ATMP wynosiła 45 C, co zapewniło jego rozpuszczalność w temperaturze hodowli. Przeprowadzone testy cytotoksyczności wykazały, że stosowane polimery gwieździste metakrylanów glikolu oligoetylenowego, podobnie jak ich odpowiedniki liniowe, nie były toksyczne i nie miały wpływu na przeżywalność komórek w całym zakresie stosowanych stężeń. Po 72 godzinach hodowli nadal obserwowano wysoką przeżywalność fibroblastów (ponad 90 %). Na rysunku 17 przedstawiono cytotoksyczność gwiazdy z ramionami kopolimeru P(DEGMAran-OEGMA-ran-GMA) GP2 wobec fibroblastów. Rys. 17. Cytotoksyczność polimeru gwieździstego wobec komórek fibroblastów Analiza wyników cytotoksyczności pozwoliła stwierdzić, że otrzymane gwiazdy poli(metakrylanów glikolu oligoetylenowego) nie były toksyczne w stosunku do fibroblastów, co pozwoliło na ich wykorzystanie w postaci warstw do hodowli komórkowej. 19

3.2. Warstwy gwieździstych poli(metakrylanów glikolu oligoetylenowego) na podłożach Termowrażliwe warstwy polimerów gwieździstych otrzymano metodą szczepienia do w wyniku reakcji odpowiednio sfunkcjonalizowanych podłoży stałych z grupami funkcyjnymi gwiazdy. Przyłączenie polimeru gwieździstego (GP1) do podłoża polegało na reakcji pierścienia oksiranowego merów metakrylanu glicydylu zawartego w ramieniu gwiazdy z grupami aminowymi wygenerowanymi na podłożu stałym. Schemat otrzymywania takich warstw przestawiono na rys. 18. wgp1 Rys. 18. Schemat otrzymania warstwy polimeru gwieżdzistego: a) hydroksylacja podłoża, b) aminosililowanie podłoża, c) immobilizacja gwiazdy do podłoża. 3.2.1. Funkcjonalizacja podłoży szklanych i krzemowych Technika szczepienia do podłoża wymaga jego odpowiedniej funkcjonalizacji poprzez wygenerowanie na nim reaktywnych grup aminowych, zdolnych do reakcji z grupami epoksydowymi gwieździstej makrocząsteczki. Funkcjonalizację podłoża przedstawiono schematycznie na rys. 18a i b. W pracy doktorskiej wykorzystano dwa typy podłoży: szklane i krzemowe. Po każdym etapie modyfikacji podłoży szklanych i krzemowych oraz po etapie immobilizacji polimeru gwieździstego do podłoża, płytki poddawane były szczegółowej analizie z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej (XPS), spektrometrii mas jonów wtórnych z analizatorem czasu przelotu (ToF-SIMS), elipsometrii oraz pomiaru statycznego kąta zwilżania w celu zbadania zmian filowości powierzchni warstw. 20

3.2.2. Immobilizacja gwiazd na powierzchni Immoblizację polimeru gwieździstego do podłoża stałego przedstawiono na rys. 18c. Po naniesieniu roztworu polimeru gwieździstego i 24 godzinnym wygrzewaniu warstwę przemywano acetonem, w celu usunięcia niezwiązanego polimeru. Pozwoliło to na analizę powierzchni zawierającej jedynie polimer związany kowalencyjnie ze stałym nośnikiem. Udział procentowy atomów poszczególnych pierwiastków (Si, C, O, N i Br) analizowanych powierzchni po kolejnych modyfikacjach przedstawiono w tabeli T10. Tabela T10. Skład pierwiastkowy powierzchni po każdym etapie modyfikacji wyznaczony techniką XPS próbka C 1s O 1s Si 2p N 1s Br 3p C/O Si-OH 9,7 42,8 47,5 0,0 0,0 0,22 Si-NH 2 18,0 38,6 41,4 2,0 0,0 0,46 wgp1 69,6 26,6 3,1 0,3 0,4 2,61 W poszczególnych etapach modyfikacji podłoża udział procentowy składu pierwiastkowego ulegał zmianie. Znacząco zwiększył się udział atomów węgla o około 49 %. Zwiększeniu uległ również stosunek węgla do tlenu (C/O) z 0,46 dla warstwy aminosililowanej do 2,61 dla wgp1 (tabela T10). Dodatkowo po utworzeniu warstwy polimeru gwieździstego intensywności sygnałów azotu oraz krzemu zostały osłabione. Wykryto również niewielką procentową zawartość bromu, która jest dodatkowym dowodem trwałego związania gwiazdy z podłożem stałym. Przeprowadzona analiza widm fotoemisyjnych XPS potwierdziła kowalencyjne związanie polimeru gwieździstego z podłożem stałym. Warstwy zbadano również techniką spektrometrii mas jonów wtórnych z analizatorem czasu przelotu. Badanie to dostarczyło informacji o składzie chemicznym warstwy polimeru gwieździstego kowalencyjnie związanego z podłożem. Obecność wszystkich analizowanych jonów potwierdziła chemiczną immobilizację polimeru gwieździstego z ramionami kopolimerów metakrylanów glikolu oligoetylenowego na powierzchni warstwy wgp1. Na rysunku 19 przedstawiono mapy rozkładu jonów ToF-SIMS pochodzących od POEGMA. Potwierdzają one, że powierzchnia analizowanych warstw polimerowych szczepionych do podłoża była wysoce jednorodna. 21

Rys. 19. Mapa jonów dodatnich dla wybranych sygnałów dla wgp1 (300 μm 300 μm); skala intensywności jest taka sama dla wszystkich map Pomiary grubości suchej warstwy wgp1 zostały wykonane techniką AFM oraz elipsometrycznie. Analiza wgłębienia zaobserwowanego w warstwie polimerowej pozwoliła na oszacowanie grubości warstwy polimerowej, która wynosiła około 60 nm. Na podstawie pomiarów elipsometrycznych otrzymano uśrednioną grubość warstwy wgp1, która wynosiła 58 nm i była zbliżona do wartości uzyskanej techniką AFM. Uzyskane wartości grubości świadczą o tym, że uzyskana warstwa nie jest monowarstwą gwiazd, ponieważ średnica hydrodynamiczna gwiazdy GP1 w roztworze wynosi 32 nm. Prawdopodobnie utworzeniu kowalencyjnie związanej z podłożem stałym warstwy towarzyszą dodatkowe reakcje pomiędzy grupami epoksydowymi obecnymi w ramionach gwiazd. W celu sprawdzenia czy otrzymane powierzchnie z immobilizowaną warstwą termoczułego gwieździstego P(DEGMA-ran-OEGMA-ran-GMA) wykazują zmiany filowości wraz ze zmianą temperatury przeprowadzono pomiary kąta zwilżania powierzchni po inkubacji w rozpuszczalnikach za pomocą statycznego kąta zwilżania. Badania wykonano w temperaturze poniżej i powyżej T cp gwiazdy naniesionej na podłoże stałe. Zmierzone wartości kątów zwilżania warstw polimerowych inkubowanych w temperaturze poniżej i powyżej temperatury przejścia fazowego gwiazdy GP1 przedstawiono w tabeli T11. Tabela T11. Wartości kąta zwilżania dla warstwy wgp1 inkubowanej w rozpuszczalnikach o różnych temperaturach Próbka woda Kąt zwilżania [ ] DMEM 18 o C 29 o C 37 o C 45 o C 18 o C 29 o C 37 o C 45 o C wgp1 80±2 82±1 86±1 89±1 70±1 76±1 78±1 77±2 22

Zmiany wartości kątów zwilżania pod wpływem temperatury wskazują na termowrażliwe właściwości warstw polimeru gwieździstego na podłożu stałym. Podwyższenie temperatury spowodowało wzrost wartości kąta zwilżania, a tym samym zmianę właściwości uzyskanych warstw z hydrofilowych na hydrofobowe. Termoprzełączalne właściwości otrzymanych warstw polimerów gwieździstych pozwoliły na ich zastosowanie do adhezji, proliferacji i odczepiania fibroblastów. 3.2.3. Adhezja, proliferacja i odczepianie fibroblastów od termowrażliwych warstw polimerów gwieździstych Adhezja i proliferacja fibroblastów Na otrzymanych termowrażliwych warstwach gwieździstych poli(metakrylanów glikolu oligoetylenowego) wgp1 oraz na polistyrenowych podłożach kontrolnych przeznaczonych do hodowli komórek TCPS przeprowadzono badania adhezji i proliferacji fibroblastów. Badania te zostały przeprowadzone we współpracy ze Śląskim Uniwersytetem Medycznym w Katowicach. Hodowla była prowadzona w 37ºC, w warunkach gdy termoczuła warstwa polimeru gwieździstego wykazywała charakter hydrofobowy, sprzyjający adhezji i proliferacji komórek. Badania adhezji i proliferacji komórek prowadzono określając odsetek komórek, które uległy rozpłaszczeniu i namnożeniu na warstwie wgp1 w stosunku do kontroli TCPS. Powyższe badania prowadzono od 2,5 h do 72 h od wysiania komórek na podłożu. Ocenę proliferacji i podziału komórek przeprowadzono na podstawie pomiaru liczby komórek w oparciu o wyniki testu metabolicznego z użyciem AlamarBlue. Poniżej przedstawiono wykresy adhezji (rys. 20a) i proliferacji (rys. 20b) fibroblastów na podłożu wgp1 w stosunku do kontroli TCPS. Rys. 20. Adhezja a) i proliferacja b) fibroblastów na podłożu wgp1 i TCPS (in vitro) Stwierdzono, że adhezja i namnażanie fibroblastów na warstwie wgp1 była porównywalna do hodowli na podłożu kontrolnym (rys. 21) i wynosiła ponad 95 %. 23

Rys. 21. Morfologia komórek fibroblastów hodowanych na podłożu wgp1 i TCPS od 2,5 h do 72 h. Powiększenie 100x Rysunek 21 przedstawia zdjęcia adhezji i proliferacji fibroblastów na termowrażliwych warstwach polimerów gwieździstych od 2,5h do 72h od wysiania. Po tym czasie, fibroblasty osiągnęły pełną konfluencję na powierzchni warstwy wgp1. Zaobserwowano wysoką żywotność komórek dla wszystkich uzyskanych powierzchni, a wydłużony kształt komórek świadczył o ich prawidłowym różnicowaniu. Odczepianie fibroblastów Po utworzeniu konfluentnego arkusza przez komórki temperatura hodowli została obniżona do 18 o C tj. poniżej T cp naniesionego polimeru gwieździstego. Po ochłodzeniu zaobserwowano samoistne i spontaniczne odczepianie się arkusza fibroblastów. Po 20 min. odczepiono konfluentny arkusz komórek. Na rysunku 22 przedstawiono arkusz komórek podczas odwarstwiania od podłoża wgp1 po czasie 0 min i 20 min. Rys. 22. Proces odczepiania fibroblastów w postaci konfluentnego arkusza a) po 0 min, b) po 20 min w 18 o C Dzięki zastosowaniu warstwy POEGMA o topologii gwieździstej znacznemu obniżeniu uległ czas odczepienia konflunetnego arkusza fibroblastów z 40 do 20 minut, w porównaniu z wynikami hodowli komórek fibroblastów na warstwach liniowych poli(metakrylanach glikolu trietylenowego) [12]. Przeprowadzone badania odczepiania fibroblastów od otrzymanych termoczułych warstw polimeru gwieździstego immoblizowanego na podłożu wskazują, że warstwy te mogą być wykorzystane do hodowli komórkowych. Uzyskane wyniki wskazują, że architektura immobilizowanego polimeru jest istotnym czynnikiem wpływającym na własności warstwy dedykowanej do wydajnej hodowli komórek. 24

4. Podsumowanie i wnioski W pracy otrzymano makrocząsteczki gwieździste z hiperrozgałęzionym rdzeniem poli(aryleno oksindolu) i ramionami poli(metakrylanów glikolu oligoetylenowego). Gwiazdy otrzymano z wykorzystaniem polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomu (ATRP) metodą rdzeń najpierw. Zbadano wpływ temperatury na zachowanie termoczułych struktur gwieździstych w roztworach wodnych oraz na własności warstw polimerów o topologii gwieździstej immobilizowanych chemicznie na podłożach stałych. Otrzymano gwiazdy z ramionami homopolimeru metakrylanu glikolu dietylenowego, bezładnego kopolimeru metakrylanu glikolu dietylenowego i metakrylanu glikolu oligoetylenowego, oraz bezładnego kopolimeru metakrylanu glikolu dietylenowego, metakrylanu glikolu oligoetylenowego i metakrylanu glicydylu. Struktury te były rozpuszczalne w wodzie w temperaturze pokojowej, a ich roztwory wykazywały wrażliwość na zmiany temperatury. Zmieniając skład ramienia poprzez odpowiedni dobór (ko)monomerów w procesie polimeryzacji, można było sterować temperaturą przejścia fazowego, dostosowując ją do temperatury wymaganej w hodowli komórkowej. Otrzymane gwieździste polimetakrylany zostały scharakteryzowane metodą chromatografii żelowej z wielokątowym rozpraszaniem światła, która pozwoliła na wyznaczenie liczbowo i wagowo średnich mas molowych oraz ich rozkładów. Wyznaczenie rozmiaru oraz kształtu dobrze zdefiniowanych makrocząsteczek w acetonie oraz w wodzie poniżej i powyżej temperatury przejścia fazowego miało istotne znaczenie dla dalszego zastosowania tych polimerów. W acetonie nie występowało zjawisko agregacji, gwiazdy występowały w postaci izolowanych, pojedynczych makrocząsteczek. W wodzie, w temperaturze poniżej T cp podobnie jak w acetonie, gwiazdy występowały jako pojedyncze makrocząsteczki. Natomiast powyżej temperatury przejścia fazowego obserwowano proces agregacji gwiazd do większych struktur. Enkapsulacja małocząsteczkowej substancji modelowej pokazała, że gwiazdy z rozbudowanym, hydrofobowym rdzeniem mogą być użyte jako nanonośniki substancji małocząsteczkowych w odpowiednim zakresie stężeń i stosunku cząsteczek nośnika do polimeru. Przy stężeniach kompleksu nieprzekraczających 1 g/l skuteczność solubilizacji sondy fluorescencyjnej 4-(dicyjanometyleno)-2-metylo-6-(4-dimetyloaminostyrylo)-4Hpiranu w pojedynczej makrocząsteczce wynosiła 10 cząsteczek sondy na 1 cząsteczkę polimeru. Powyżej tego stężenia, enkapsulacji sondy towarzyszyła agregacja gwiazd. Wyniki badań przeprowadzonych dla otrzymanych gwiazd wskazywały na brak toksyczności względem komórek fibroblastów, co pozwoliło na immoblilizowane ich do odpowiednio sfunkcjonalizowanego podłoża stałego metodą szczepienia do. Modyfikacja podłoży pozwoliła na wprowadzenie reaktywnych grup funkcyjnych zdolnych do reakcji z grupami znajdującymi się na końcach ramion gwiazd. Wyznaczenie składu pierwiastkowego warstw, morfologii oraz zmiany ich filowości pozwoliły na potwierdzenie obecności struktur gwieździstych związanych z podłożem stałym. 25

Otrzymane warstwy polimetakrylanów gwieździstych były termoczułe, co potwierdziły różnice w kątach zwilżania. Grubość otrzymanych warstw wynosiła około 60 nm. Termowrażliwe warstwy polimeru gwieździstego wykorzystano jako podłoża do hodowli i odczepiania komórek fibroblastów pod wpływem temperatury. Adhezja i proliferacja fibroblastów na warstwie polimeru gwieździstego była porównywalna do próby kontrolnej, prowadzonej na standardowym podłożu do hodowli komórek (TCPS) i wynosiła ponad 95 %. Po utworzeniu przez komórki konfluentnego arkusza i obniżeniu temperatury hodowli zaobserwowano samoistne, nieinwazyjne odczepianie się arkusza komórek fibroblastów. Wykazano, że gwieździsta topologia polimeru ma istotne znaczenie dla hodowli komórek wpływając na skrócenie czasu odczepiania konfluentnego arkusza fibroblastów w porównaniu z warstwą polimeru liniowego. 26

5. Literatura [1] J. F. Lutz, A. Hoth, Macromolecules 39, 893-896 (2006) [2] K. Matyjaszewski, Macromolecules 45, 4015-4039 (2012) [3] J. M. Ren, T. G. McKenzie, Q. Fu, E. H. H. Wong, J.Xu, Z.An, S. Shanmugam, T. P. Davis, C. Boyer, G. G. Qiao, Chem. Rev. 116, 6743-6836 (2016) [4] A. Kowlaczuk, A. Vandendriessche, B. Trzebicka, B. Mendrek, U. Szeluga, G. Cholewiński, M. Smet, A. Dworak, W. Dehaen, J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 47, 1120-1135 (2009) [5] Chen G, Huynh D, Felgner PL, Guan Z, J. Am. Chem. Soc. 128, 4298-4302 (2006) [6] K. Matyjaszewski, P. J. Miller, J. Pyun, G. Kickelbick, S. Diamanti, Macromolecules 32, 6526-6535 (1999) [7] W. Burchard w Soft-Matter Characterization, 465-603, Springer 2008 [8] W. Burchard, Adv. Polym. Sci. 143, 113-194 (1999) [9] T. Furukawa, K. Ishizu, Y. Yamane, I. Ando, Polymer 46, 1893-1893 (2005) [10] K. Ishizu, K. Ochi, T. Furukawa, J. Appl. Polym. Sci. 100, 3340-3345 (2006) [11] G. D Adamo, A. Pelissetto, C. Pierleoni, J. Chem. Phys. 136, 224905-224909 (2012) [12] O.V Salata, J. Nanobiotechnology 2, 3 (2004) 27

6. Dorobek naukowy doktoranta Publikacje Wyniki badań opisane w pracy zostały przedstawione w poniższych publikacjach: A. Kowalczuk, B. Mendrek, I. Żymełka-Miara, M. Libera, A. Marcinkowski, B. Trzebicka, M. Smet, A. Dworak Solution behavior of star polymers with oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate arms, Polymer 2012, 53, 5619-5631 (IF= 3,379) B. Mendrek, I. Żymełka-Miara, Ł. Sieroń, A. Fus, K. Balin, J. Kubacki, M. Smet, B. Trzebicka, A. L. Sieroń, A. Kowalczuk Stable star polymer nanolayers and their thermoresponsiveness as a tool for controlled culture and detachment of fibroblast sheets, Journal of Materials Chemistry B 2018, 6, 641-655 (IF=4,543) Publikacje dodatkowe: B. Mendrek, Ł. Sieroń, I. Żymełka-Miara, P. Binkiewicz, M. Libera, M. Smet, B. Trzebicka, A. L. Sieroń, A. Kowalczuk, A. Dworak, Non-viral plasmid DNA carriers based on N,N'- dimethylaminoethyl methacrylate and di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate star copolymers, Biomacromolecules 2015, 16, 3275 3285 (IF=5,583) A. Utrata-Wesołek, I. Żymełka-Miara, A. Kowalczuk, B. Trzebicka, A. Dworak, Photocrosslinking of polyglycidol and its derivative - route to thermoresponsive hydrogels, Photochemistry and photobiology 2017, 94, 52-60 (IF=2,121) Uczestnictwo w międzynarodowych projektach badawczych Projekt MNiSW nr N N209 100237 Sterowane informacją środowiska nanosystemy o budowie rdzeń-powłoka do enkapsulacji i uwalniania związków aktywnych biologicznie, projekt zakończony 2012 Projekt NCN nr UMO-2011/01/B/ST5/05982 Nowe gwieździste nośniki polimerowe do transportu kwasów nukleinowych, 2011-2015 Projekt NCN nr UMO-2015/17/B/ST5/01095 Termoczułe gwieździste powierzchnie polimerowe do hodowli i transfekcji komórek Projekt nr UDA-POIG.01.03.01-00-088/08 współfinansowany przez UE w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego Termosterowalne polimery biozgodne jako zamienniki skóry do leczenia oparzeń i ran DERMOSTIM, projekt zakończony 2012 Projekt nr 5 Nowe polimerowe ph czułe nanokontenery z hiperrozgałęzionym wnętrzem, w ramach porozumienia o współpracy naukowej między PAN i Funduszem Badań Naukowych Flandrii (Belgia), projekt zakończony 2012 Projekt nr 18 Biodegradowalne, czułe na bodźce hydrożele polifosfoestrowe do biomedycznych zastosowań, 2010-2014, 28

Dorobek popularyzatorski doktorantki A) Udział w komitetach organizacyjnych międzynarodowych konferencji naukowych: członek Komitetu Organizacyjnego konferencji Polimery nad Odrą POLYOR 2011, Opole 2011, członek Komitetu Organizacyjnego konferencji Silesian Meetings on Polymer Materials POLYMAT60, Zabrze 2014, członek Komitetu Organizacyjnego konferencji Silesian Meetings on Polymer Materials POLYMAT2016, Zabrze 2016. B) Członkostwo w międzynarodowych i krajowych organizacjach oraz towarzystwach naukowych: Członkostwo w Polskim Towarzystwie Chemicznym C) Osiągnięcia dydaktyczne i w zakresie popularyzacji nauki lub sztuki: Współautorstwo cyklu wykładów dla studentów Polimery w medycynie Opole D) Staże w zagranicznych i krajowych ośrodkach naukowych lub akademickich: Belgia, Katolicki Uniwersytet w Leuven, staż naukowy, 1 miesiąc, 2011 Referaty I. Żymełka, A. Utrata-Wesołek, B. Trzebicka, A. Dworak Thermosensitive hydrogels from photocrosslinking polyglycidol derivatives 3 rd Bratislava Young Polymer Scientists Workshop 2010 (BYPOS), 7-10.06.2010, Trencianske Teplice (Słowacja) A. Dworak, B. Trzebicka, W. Wałach, A. Kowalczuk, M. Libera, B. Mendrek, I. Żymełka Star polymers of different functionalities via living and controlled polymerizations 11 International Symposium on Ionic Polymerization, 10-15.07.2011, Akron (USA) A. Kowalczuk, B. Mendrek, I. Żymełka, B. Trzebicka, M. Smet, A. Dworak, Solution behavior of amphiphilic, thermoresponsive ethylene glycol methacrylate star polymers, Polymers 2012, XVII National Symposium, 31.05-2.06.2012, Ribaritsa (Bułgaria) B. Mendrek, A. Kowalczuk, I. Żymełka-Miara, M. Libera, B. Trzebicka, M. Smet, A. Dworak, Termoczułe polimery gwieździste metakrylanów glikoli etylenu, 55 Zjazd PTChem, 16-20.09.2012, Białystok (Polska) B. Mendrek, A. Kowalczuk, I. Żymełka-Miara, B. Trzebicka, M. Smet, A. Dworak, Characterization of ethylene glycol methacrylate star polymers in solution, 6 th International Symposium on the Separation and Characterization of Natural and Synthetic Macromolecules, 6-8.02.2013, Drezno (Niemcy) I. Żymełka-Miara, A. Kowalczuk, B. Mendrek, M. Smet, B. Trzebicka, A. Dworak, Polimery gwieździste metakrylanów glikoli etylenowych w roztworze i na powierzchni, 57 Zjazd PTChem i SiTPChem, 14-18.09.2014, Częstochowa (Polska) 29

A. Kowalczuk, B. Mendrek, I. Żymełka-Miara, P. Binkiewicz, B. Trzebicka, A. Dworak, Star polymers and their complexes with biomolecules, 16th IUPAC International Symposium on MacroMolecular Complexes, 10-14.08.2015, Wrocław (Polska) B. Mendrek, I. Żymełka-Miara, P. Binkiewicz, B. Trzebicka, A. Dworak, A. Kowalczuk, Polimery gwiaździste o strukturze rdzeń-powłoka jako nośniki DNA do zastosowań w terapii genowej, 58 Zjazd Naukowy Polskiego Towarzystwa Chemicznego, 21-25.09.2015, Gdańsk (Polska) B. Mendrek, Ł. Sieroń, I. Żymełka-Miara, B. Trzebicka, A.L. Sieroń, A. Dworak, A. Kowalczuk, Star nanocarriers of nucleic acids, 18 th National Symposium Polymers 29.09-01.10.2016, Sofia (Bułgaria) Postery A. Utrata-Wesołek, I. Żymełka, B. Trzebicka, A.Dworak; Polyether hydrogels form photo- and chemically crosslikable derivatives of polyglycidol" 73 RD Prague Meetings on macromolecules, 5-9.07.2009 Praga (Czechy) I. Żymełka, A. Utrata-Wesołek, B. Trzebicka, A. Dworak; Termowrażliwe warstwy polieterowe otrzymane techniką fotosieciowania 52 Zjazd Polskiego Towarzystwa Chemicznego i Stowarzyszenia Inżynierów i Techników Przemysłu Chemicznego, 12-16.09.2009, Łódź (Polska) B. Trzebicka, A. Utrata-Wesołek, R. Trzcińska, K. Galbas, I. Żymełka, A. Dworak, Degradacja poliglicydolu i poli(tlenku etylenu) pod wpływem promieniowania UV 53 Zjazd PTChem-SITPChem, 14-18.10.2010, Gliwice (Polska) B. Mendrek, A. Kowalczuk, I. Żymełka, B. Trzebicka, M. Smet, A. Dworak Amphiphilic starpolymers based upon poly(etylene glycol methacrylates), EUPOC2011- Biobased Polymers and Related Biomaterials, 29.05-3.06.2011, Gargnano (Włochy) B. Mendrek, A. Kowalczuk, I. Żymełka, B. Trzebicka, M. Smet, A. Dworak Stars of poly(ethylene glycol methacrylates) synthesis and characterization, Polymers on the Odra River, 6-7.07.2011, Opole (Polska) I. Żymełka, A. Kowalczuk, B. Mendrek, B. Trzebicka, M. Smet. A. Dworak Behavior of thermoresponsive poly(ethylene glycol methacrylates) stars in water Polymers on the Odra River, 6-7.07.2011, Opole (Polska) B. Mendrek, A. Kowalczuk, I. Żymełka, B. Trzebicka, M. Smet, A. Dworak, Synthesis and characterization of ethylene glycol methacrylate star polymers, Polymers 2012, XVII NATIONAL SYMPOSIUM, 31.05-2.06.2012 r., Ribaritsa, (Bułgaria) I. Żymełka-Miara, A. Kowalczuk, B. Mendrek, B. Trzebicka, M. Smet, A. Dworak, Termowrażliwe polimery gwieździste metakrylanów glikoli etylenowych - synteza i charakterystyka w roztworach, 55 Zjazd PTChem, 16-20.09.2012 r., Białystok (Polska) A. Dworak, B. Trzebicka, A. Kowalczuk, B. Mendrek, I. Żymełka-Miara, M. Smet, Core-shell star polymethacrylates of well-defined architecture synthesis 30