Wydzielanie interleukiny 4 oraz interleukiny 10 przez limfocyty T chorych na przewlekłą białaczkę limfatyczną B komórkową

PRACE ORYGINALNE Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 45 49 ISSN 1230 025X DARIUSZ WOŁOWIEC 1, IRENA FRYDECKA 1, 2, AGATA KOSMACZEWSKA 2, DOROTA BOĆKO 2, LIDIA CISZAK 2, DONATA URBANIAK KUJDA 1, KATARZYNA KAPELKO SŁOWIK 1, KAZIMIERZ KULICZKOWSKI 1, IWONA KOCHANOWSKA 2 Wydzielanie interleukiny 4 oraz interleukiny 10 przez limfocyty T chorych na przewlekłą białaczkę limfatyczną B komórkową Interleukin 4 and interleukin 10 secretion by peripheral blood T cells in patients with chronic B cell leukemia 1 Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu 2 Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu Streszczenie Wprowadzenie. Zaburzenia czynności limfocytów T u chorych na przewlekłą białaczkę limfatyczną B komórko wą (B CLL) odgrywają dużą rolę w patogenezie upośledzonej odporności u tych chorych. Cel pracy. Celem pracy była ocena wydzielania IL 4 i IL 10 przez stymulowane przeciwciałem monoklonalnym anty CD3 i ril 2 komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) chorych na B CLL w porównaniu z grupą osób zdrowych. Materiał i metody. Badania przeprowadzono u 30 chorych na B CLL i 29 osób zdrowych. Stężenie cytokin w nad sączach hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) badano metodą ELISA. Wyniki. Stwierdzono istotnie wyższe stężenie IL 4 (p = 0,01) i IL 10 (p = 0,001) u chorych na B CLL w porów naniu z grupą osób zdrowych. Wnioski. Wyniki naszych badań wskazują na dysregulację w obrębie sieci cytokinowej u chorych na B CLL, co może wpływać na zaburzenia funkcji układu odpornościowego u tych chorych (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 45 49). Słowa kluczowe: interleukina 4, interleukina 10, przewlekła białaczka limfatyczna B komórkowa. Abstract Backgroud. The functional impairment of T cells plays a major role in pathogenesis of impaired immunity in B cell chronic lymphocytic leukemia (B CLL). Objectives.The aim of our study was to analyse IL 4 and IL 10 secretion by anticd3 and ril 2 stimulated peri pheral blood mononuclear cells in patients with B CLL compared with normal subjects. Material and methods.the study was performed in 30 patients with B CLL and 29 healthy controls. The levels of cytokines in the culture supernatants were estimated using ELISA. Results.We showed significantly higher level of IL 4 (p = 0.01) and IL 10 (p = 0.001) in patients with B CLL com pared with controls. Conclusions. The results of our study showed dysregulation in cytokine network in patients with B CLL, what in consequence may lead to dysfunction of the immune system in this disease (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 45 49). Key words: interleukin 4, interleukin 10, B cell chronic lymphocytic leukemia. Praca sponsorowana przez grant KBN: 4 P05B 13 618.

46 D. WOŁOWIEC et al. Zaburzenia czynności limfocytów T u chorych na przewlekłą białaczkę limfatyczną B komórko wą (B CLL chronic lymphocytic leukemia) mo gą prowadzić nie tylko do zespołu niedoborów od pornościowych u tych chorych, ale także wpływa ją na takie procesy biologii komórek białaczko wych, jak ich aktywność proliferacyjna i przeży cie. Szczególną rolę odgrywają tu cytokiny wy twarzane przez limfocyty T, w tym interleukina 4 (IL 4) i interleukina 10 (IL 10). IL 4 oddziałuje na limfocyty CLL hamując ich proliferację zależną m.in. od interleukiny 2, TNF α i IFN α, a także przedłużają ich czas przeżycia poprzez zahamo wanie apoptozy [1 6]. Interleukina 10 jest nato miast plejotropową cytokiną wytwarzaną przez komórki Th2, monocyty, makrofagi oraz limfocy ty B prawidłowe i nowotworowe [7 10]. Wykazu je działanie immunosupresyjne poprzez zahamo wanie wydzielania cytokin przez limfocyty Th1, w tym IFN γ i IL 2 [7]. Liczne doniesienia wyka zały zwiększenie wydzielania interleukiny 4 przez limfocyty T chorych na B CLL szczególnie jej po stać progresywną [11 15], co mogłoby przyczynić się do przedłużonego przeżycia limfocytów bia łaczkowych. Większość opublikowanych badań została jednak wykonana na izolowanych limfocy tach T, ich wyniki mogą więc nie odzwierciedlać sytuacji in vivo, gdy limfocyty T są poddane od działywaniu innych komórek środowiska bezpo średnio lub za pośrednictwem wytwarzanych przez nie cytokin. Takie oddziaływania mogą w istotnym stopniu modyfikować syntezę i/lub uwalnianie cytokin przez komórki zarówno zdro we, jak i nowotworowe. Zostało to wykazane przez Deckera et al. [16], którzy badając wpływ autologicznych komórek pomocniczych na limfo cyty T chorych na B CLL wykazali, że wydziela nie cytokin przez limfocyty T, m.in. IL 4, jest podobne u osób zdrowych oraz chorych na B CLL, autologiczne monocyty obniżają jednak sekrecję tej interleukiny przez komórki T zarówno osób zdrowych, jak i chorych na B CLL. Pozostają one natomiast bez wpływu na uwalnianie IL 10. Za oserwowano ponadto, że w surowicy chorych na B CLL stężenie IL 10 jest wyższe niż u osób zdro wych [18, 19], pomimo obniżonego jej wytwarza nia przez limfocyty CD2 + [16]. Regulacja wydzie lania tych cytokin, uczestniczących w istotnym stopniu w kształtowaniu obrazu klinicznego B CLL, jest więc wypadkową różnorodnych, niekiedy przeciwstawnych i nie do końca poznanych me chanizmów: wewnątrzkomórkowych zaburzeń lim focytów T oraz oddziaływania na nich mikrośro dowiska. Celem przedstawionych badań jest ocena wy dzielania IL 4 i IL 10 przez stymulowane limfocy ty T chorych na B CLL w ich naturalnym środowi sku komórkowym z uwzględnieniem zarówno czynników wewnątrzkomórkowych, jak i wpływu na te limfocyty substancji wytwarzanych przez in ne elementy morfotyczne krwi. Materiał i metody Pacjenci Badaniom poddano 30 nieleczonych chorych na B CLL w wieku 33 80 lat (średnia 64,6±10,5 lat). I stadium kliniczne choroby według klasyfi kacji Raya ustalono u 20, a II stadium u pozostałych 10 chorych. Grupę kontrolną stanowiło 29 zdro wych osób wiekiem i płcią odpowiadających ba danej grupie chorych. Izolacja komórek jednojądrzastych z krwi obwodowej Do badań wykorzystywano krew żylną pobra ną na czczo od pacjentów i osób zdrowych, stano wiących grupę kontrolną, po uprzednim wyraże niu pisemnej zgody. Pobranie krwi oraz izolację i hodowlę komórek prowadzono w warunkach ste rylnych. Do izolacji pobierano 20 cm 3 krwi żylnej do sterylnej strzykawki z dodatkiem 20 jednostek he paryny na każdy 1 cm 3 krwi. Następnie krew roz cieńczano za pomocą RPMI 1640 w stosunku 1:1 i nawarstwiano na jednostopniowy gradient stężeń Gradisolu L. Po 20 minutach wirowania przy 400 g w temperaturze 4 0 C, komórki jednojądrza ste stanowiące warstwę pośrednią między Gra disolem L a osoczem zbierano, a następnie trzy krotnie płukano solą fizjologiczną. Gęstość tak przygotowanej populacji komórek PBMC była określana w komorze Bűrkera. Hodowla komórek PBMC Wyizolowane z krwi obwodowej komórki PBMC zawieszano w stężeniu 1 10 6 komórek/ml w płynie hodowlanym RPMI 1640, wzbogaconym 10% cielęcą surowicą płodową (FCS), 1% L gluta miną i gentamycyną w płaskodennych płytkach 24 dołkowych. W celu stymulacji komórek PBMC do hodowli dodano 5 ng/ml przeciwciała anty CD3 (Ortho, Neckargemund, Niemcy) z dodatkiem 500 IU/ml rekombinowanej ludzkiej interleukiny 2 (ril 2) (Chiron, Suresnes, Francja). Jednocześnie prowadzono kontrolną hodowlę komórkową bez dodatku czynników stymulujących. Przygotowane

Wydzielanie IL 4 i IL 10 przez limfocyty T chorych na przewlekłą białaczkę limfatyczną B komórkową 47 w ten sposób hodowle komórkowe inkubowano przez 72 godziny w temperaturze 37 0 C w wilgotnej atmosferze wzbogaconej 5% CO 2. Oznaczanie ekspresji antygenu CD3 na powierzchni limfocytów T 5 10 5 świeżo wyizolowanych komórek jed nojądrzastych oraz komórek poddanych uprzednio hodowli poddano inkubacji z 50 µl 2% surowicy AB i przeciwciałem monoklonalnym skierowa nym przeciwko antygenowi CD3 skoniugowanym z fluoresceiną (FITC) (Pharmingen, San Diego, CA, USA) przez okres 30 minut w temperaturze +4 0 C. Po dwukrotnym przepłukaniu w roztworze Tween w PBS, komórki zawieszano w 300 µl PBS (bez dodatku jonów Ca ++ img ++ ). Odsetek ko mórek CD3 + oznaczano immunofluorescencyjnie w cytometrze przepływowym FACScalibur (Bec ton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Kon trolę negatywną stanowiły komórki jednojądrzaste inkubowane z mysią immunoglobuliną zgodną izotypowo ze stosowanym w próbach przeciwcia łem monoklonalnym, skoniugowaną z fluorescei ną (DAKO, Kopenhaga, Dania). Oznaczanie stężenia cytokin w nadsączach hodowli komórkowych Stężenie IL 4 i IL 10 w nadsączach hodowla nych określano w podwójnych próbkach testem im munoenzymatycznym ELISA (R&D Systems, Wies baden, Niemcy). Stężenie cytokin wydzielanych przez komórki T stanowiło różnicę między stęże niem stwierdzanym w nadsączach pobranych z ho dowli z dodatkiem czynników stymulujących a stę żeniem cytokin wydzielanych przez komórki hodo wane wyłącznie w płynie hodowlanym. Wyniki przeliczano na stałą liczbę limfocytów T w hodowli. Obliczenia statystyczne Obliczenia statystyczne uzyskanych wyników przeprowadzono na komputerze typu IBM PC, z użyciem programu Statistica (StatSoft). W anali zie wykorzystano test Mann Whitneya. Wyniki W grupie osób chorych na B CLL stwierdzono istotnie wyższe stężenie IL 4 w nadsączach hodowli Ryc. 1. Stężenie IL 4 i IL 10 w nadsączach hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej chorych na B CLL oraz osób zdrowych przed i po 72 godzin nej stymulacji anty CD3 i ril 2 Fig. 1. Concentration of IL 4 and IL 10 in PBMC culture of healthy subjects and patients with CLL before and after 72 hours stimulation with anti CD3 and ril 2 PBMC stymulowanych anty CD3 + ril 2 w porów naniu do grupy osób zdrowych (450 pg/ml vs. 150 pg/ml; p = 0,01). Podobnie istotnie wyższe wartości IL 10 wykazano w nadsączach hodowlanych w grupie chorych na B CLL w stosunku do grupy kontrolnej (1000 pg/ml vs. 85 pg/ml; p = 0,001). Wyniki przedstawiono na rycinie 1. Omówienie Na obraz kliniczny B CLL mają wpływ nie tyl ko nieprawidłowości limfocytów białaczkowych, głównie patologicznie przedłużony czas ich przeży cia, ale też zaburzone wydzielanie i uwalnianie cy tokin przez limfocyty T. Na podkreślenie zasługuje opisywana w wielu doniesieniach zwiększona syn teza i wydzielanie przez aktywowane autologiczne limfocyty CD4 + i CD8 + interleukiny 4, cytokiny ha mującej zarówno proliferację, jak i apoptozę ko mórek B CLL [1 6, 11 15]. Znaczenie tej nadmier nej syntezy IL 4 w warunkach ex vivo nie jest jed nak jasne, gdyż większość opublikowanych prac została wykonana na izolowanych limfocytach T, niepoddanych więc kontroli mikrośrodowiska. Ba dania Deckera et al. [16] nie tylko nie wykazały różnic w wydzielaniu cytokin, m.in. IL 4, między stymulowanymi limfocytami T osób zdrowych i chorych na B CLL, ale także udokumentowały ha mujący wpływ monocytów krwi obwodowej na wytwarzanie tej cytokiny przez komórki T. Inną cytokiną wpływającą na obraz chorobo wy B CLL jest interleukina 10 o działaniu hamu jącym czynność układu odpornościowego, regula

48 D. WOŁOWIEC et al. cja jej wytwarzania i uwalniania in vitro jest jed nak również niejasna. Stężenie surowicze tej cyto kiny było u chorych na B CLL podobne do stęże nia u osób zdrowych w badaniach Knaufa et al. [19], wyższy natomiast w doniesieniu Fayada et al. [18]; autorzy ci stwierdzili ponadto niekorzyst ne znaczenie rokownicze zwiększonego stężenia surowiczego IL 10. Badania Deckera et al. [16] wykazały, że stymulowane limfocyty CD2 + pa cjentów chorych na B CLL wytwarzają mniejszą ilość IL 10 niż limfocyty osób zdrowych [18]. Podobne wyniki uzyskali również Mainou Fowler et al. [17]. Opisane rozbieżności wyników badań nad wy dzielaniem i uwalnianiem cytokin przez limfocyty T chorych na B CLL mogą wynikać, jak wspomnia no wyżej, nie tylko z wpływu czynników we wnątrzkomórkowych, ale i ze słabo poznanych in terakcji z innymi elementami morfotycznymi krwi, zwłaszcza z monocytami. Dlatego też celem niniejszych badań była ocena wydzielania IL 4 i IL 10 przez stymulowane limfocyty T chorych na B CLL w ich naturalnym środowisku komórko wym, czyli poddanych wpływowi zewnątrzko mórkowych czynników regulacyjnych. W tym ce lu populacja komórek jednojądrzastych krwi ob wodowej była stymulowana czynnikami oddziału jącymi wybiórczo na limfocyty T: przeciwciałem anty CD3 naśladującym pobudzenie antygeno we oraz interleukiną 2, wzmacniającą sygnał proliferacyjny wygenerowany przez działanie przeciwciała anty CD3. Po zakończeniu hodowli stwierdzono w nadsączach komórkowych pocho dzących od chorych na B CLL istotnie wyższe, w stosunku do komórek osób zdrowych, stężenie zarówno IL 4, jak i IL 10. Świadczy to o zwięk szonym wydzielaniu ex vivo tych interleukin przez stymulowane PBMC chorych na B CLL. W przy padku IL 4 jest to najprawdopodobniej wynikiem zwiększonej jej produkcji, pomimo opisywanego hamującego wpływu wywieranego na jej sekrecję przez monocyty [16]. Zwiększone uwalnianie IL 4 może z kolei oddziaływać na limfocyty białaczko we, przyczyniając się do zahamowania ich apoptozy i tym samym do wydłużenia ich przeżycia [1, 2, 4]. W wykonanych dotychczas badaniach stwier dzono, że wydzielanie IL 10 przez limfocyty CD2 + izolowane od chorych na białaczkę jest niż sze w porównaniu do grupy osób zdrowych [17], a komórki pomocnicze nie wpływają in vitro na jej wytwarzanie przez komórki T [16]. Interpretując poczynione przez nas obserwacje, w których wy kazaliśmy zwiększone uwalniane IL 10 przez sty mulowane PBMC, należy uwzględnić możliwość, że źródłem tej interleukiny w nadsączach komór kowych są również inne elementy morfotyczne krwi obwodowej, jak np. monocyty lub limfocyty B. Ponieważ w użytym przez nas modelu ekspery mentalnym użyliśmy przeciwciała anty CD3 i IL 2, oddziałujących swoiście na limfocyty T, wydaje się, że głównym źródłem wysokiego stężenia IL 10 w badanych nadsączach hodowlanych są limfocy ty T. Zastosowane przez nas warunki hodowli po zwoliły na odzwierciedlenie sytuacji in vivo, w których limfocyty T podlegają wpływowi czyn ników mikrośrodowiska, nieuwzględnionych w układach stosowanych do wcześniej publikowa nych badań ex vivo. Przedstawione badania wskazują więc, że sty mulowane limfocyty T chorych na B CLL wydzie lają w warunkach ex vivo do środowiska interleuki nę 4 i 10 w ilości większej niż u osób zdrowych. Uwzględniając dotychczas opublikowane doniesie nia na temat wpływu tych cytokin na biologię lim focytów B CLL oraz na wydolność układu odpor nościowego w tej chorobie, uzyskane przez nas wy niki sugerują istotną rolę limfocytów T w kształto waniu obrazu klinicznego przewlekłej białaczki limfatycznej. Piśmiennictwo [1] Mainou Fowler T., Copplestone J. A., Prentice A. G.: Effect of interleukins on the proliferation and survival of B cell chronic lymphocytic leukaemia cells. J. Clin. Pathol. 1996, 49, 437 438. [2] Panayiotidis P., Ganeshaguru K., Jabbar S. A., Hoffbrand A. V.: Interleukin 4 inhibits apoptotic cell death and loss of the bcl 2 proteinin in B chronic lymphocytic leukaemia cells in vitro. Br. J. Haematol. 1993, 85, 439 445. [3] van Kooten C., Rensink I., Aarden L., van Oers R.: Effect of IL 4 and IL 6 on the proliferation and differen tiation of B chronic lymphocytic leukemia cells. Leukemia 1993, 7, 618 624. [4] Dancescu M., Rubio Trujillo M., Biron G., Bron D., Delespesse G., Sarfati M.: Interleukin 4 protects chronic lymphocytic leukemic B cells from death by apoptosis and upregulates Bcl 2 expression. J. Exp. Med. 1992, 176, 1319 1326. [5] van Kooten C., Rensink I., Aarden I., van Oers R.: Interleukin 4 inhibits both paracrine and autocrine tumor necrosis factor alpha induced proliferation of B chronic lymphocytic leukemia cells. Blood 1992, 80, 1299 1306. [6] Luo H. Y., Rubio M., Biron G., Delespesse G., Sarfati M.: Antiproliferative effect of interleukin 4 in B chro nic lymphocytic leukemia. J. Immunother. 1991, 10, 418 425. [7] Fiorentino D. F., Bond M. W., Mosmann T. R.: Two types of mouse helper T cell. IV. Th2 clones secrete a fac tor that inhibits cytokine production by the Th1 clones. J. Exp. Med. 1989, 170, 2081 2095.

Wydzielanie IL 4 i IL 10 przez limfocyty T chorych na przewlekłą białaczkę limfatyczną B komórkową 49 [8] Benjamin D., Knobloch T. J., Dayton M. A.: Human B cell interleukin 10: B cell derived from patients with acquired immunodeficiency syndrome and Burkitt s lymphoma constitutively secrete large quantities of interleu kin 10. Blood 1992, 80, 1289 1298. [9] O Garra A., Stapleton G., Dhar V., Schumecher J., Rugo H., Barbis D., Stall A., Cupp J., Moore K.: Pro duction of cytokines by mouse B cells: lymphomas and normal B cells produce interleukin 10. Int. Immunol. 1990, 2, 821 832. [10] O Garra A., Chang R., Hastings R., Go N., Haughton, Howard M.: Lyl B (B 1) cells are the main source of B cell derived IL 10. Eur. J. Immunol. 1992, 22, 711 717. [11] Kay N. E., Han L., Bone N., Williams G.: Interleukin 4 content in chronic lymphocytic leukaemia (CLL) B cells and blood CD8 + T cells from B CLL patients: impact on clonal B cell apoptosis. Br. J. Haematol. 2001, 112, 760 767. [12] Reyes E., Prieto A., Carrion F., Garcia Suarez J., Esquivel F., Guillen C., Alvarez Mon M.: Altered pattern of cytokine production by peripheral blood CD2 + cells from B chronic lymphocytic leukemia patients. Am. J. He matol. 1998, 57, 93 100. [13] Reyes E., Prieto A., Carrion F., Garcia Suarez J., Esquivel F., Alvarez Mon M.: Morphological variants of leukemic cells in B chronic lymphocytic leukemia are associated with different T cell and NK cell abnormalities. Am. J. Hematol. 1997, 55, 175 182. [14] Mu X., Kay N. E., Gosland M. P., Jennings C. D.: Analysis of blood T cell cytokine expression in B chronic lymphocytic leukaemia: evidence for increased levels of cytoplasmic IL 4 in resting and activated CD8 T cells. Br. J. Haematol. 1997, 96, 733 735. [15] Mainou Fowler T., Proctor S. J., Miller S., Dickinson A. M.: Expression and production of interleukin 4 in B cell chronic lymphocytic leukaemia. Leuk. Lymphoma 2001, 42, 689 698. [16] Decker T., Flohr T., Trautmann P., Aman M. J., Holter W., Majdic O., Huber C., Peschel C.: Role of acces sory cells in cytokine production by T cells in chronic B cell lymphocytic leukemia. Blood 1995, 86, 1115 1123. [17] Mainou Fowler T., Miller S., Proctor S. J., Dickinson A. M.: The levels of TNF α, IL 4 and IL 10 production by T cells in B cell chronic lymphocytic leukaemia (B CLL). Leuk. Res. 2001, 25, 157 163. [18] Fayad L., Keating M. J., Reuben J. M., O Brien S., Lee B N., Lerner S., Kurzrock R.: Interleukin 6 and in terleukin 10 levels in chronic lymphocytic leukemia: correlation with phenotypic characteristics and outcome. Blood 2001, 97, 256 263. [19] Knauf W. U., Ehlers B., Bisson S., Thiel E.: Serum levels of interleukin 10 in B cell chronic lymphocytic leu kemia. Blood 1995, 86, 4382 4386. Adres do korespondencji: Dariusz Wołowiec Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM Wybrzeże L. Pasteura 4 50 369 Wrocław Praca wpłynęła do Redakcji: 7.11.2002 r. Po recenzji: 3.12.2002 r. Zaakceptowano do druku: 3.12.2002 r. Received: 7.11.2002 Revised: 3.12.2002 Accepted: 3.12.2002