Zakład Patologii IPCZD ( Prof. Bogdan Woźniewicz)

Transkrypt

1 4 sprawozdanie merytoryczne Zgłoszony do konkursu temat dotyczył innowacji w medycynie. Chodziło o opracowanie nowej metody regeneracji grasicy u osób w stanach wyczerpania immunologicznego zwłaszcza na duża skale w celu poprawy jakości życia u osób w wieku starzenia. przy pomocy Komorek progenitorowych pozyskiwanych na drodze przetwarzania biotechnologicznego grasicy wieku rozwojowego usuwanej zgodnie z etyką podczas operacji wad wrodzonych serca. Przeprowadzono nowe procedury biotechnologiczne aby uzyskać nie-immunogenny żywych komórek w celu zastosowania w leczeniu pacjentów po 70 roku życia u których następuje wyczerpanie centralnego narządu immunologicznego. W wyniku przetwarzania grasicy ludzkiej in vitro pozyskano po raz pierwszy jednolitą powtarzalną populacje komórek spełniających współczesne kryteria komórek zdolnych po przeszczepieniu do regeneracji układu immunologiczngo u człowieka - podobnie jak to uzyskiwano dotychczas jedynie na zwierzętach... Zakład Patologii IPCZD ( Prof. Bogdan Woźniewicz) Wykonywano oznaczenia Komorek progenitorowych ptec w eksplantach grasicy podczas chirurgii wad wrodzonych serca operowanych w okresie od 3 doby po urodzeniu do 13 lat. Fragmenty grasicy pobranej jałowo dzielono na 3 cześci: jeden na histologie i immunocytochemie, drugi na hodowle dla laboratoriów Osteomed, i 3 fragment bankowano na wypadek koniecznej autotransplantacji. Ważnym celem było sprawdzenie lokalizacji i występowania ptec w prawidłowym narządzie. Do tego celu wykorzystano niedawno odkryty marker ptec. czyli Stromal Derived Factor 1.. Najwięcej Komorek SDF-1 dodatnich znajduje się w rdzeniu i w obrębie torebki grasicy. Ryc.1 Ryc. 1 pokazuje zachowanie się Komorek progenitorowych w prawidłowej grasicy. Na czerwono wybarwione są komorki ptec metodą immunocytochemiczna.

2 Kolejnym badaniem wykonywanym w Zakładzie Patologii była identyfikacja populacji pozyskanych In vitro Komorek. Do tego celu wykorzystywano różne przeciwciała służace do oznacznie fenotypu Komorek pozyskanych podczas hodowli 50 przytarczyc. Komórki zostały dostarczone z Osteomed i zabankowanych banku komorek IPCZD (Mgr Maciej Fedorowicz) Do tego celu zużyto po rozbankowaniu około miliard Komorek. Wyniki badań identyfikacji wygenerowanych Komorek przedstawia Tabela 1. Table 1. Identification of progenitor cells cultured from human thymic explants. Abbreviation explanations: T thymocytes, C cortex, M medulla, V vessels, H Hassall s corpuscles, PV perivascular, Fs septal fibroblasts, *MIB-1 3%. Marker TEPC Tissue Dilution Ab manufacture Expression Fragments HLA ABC Negative + weak 1 : 100 DAKO MO738 HLA, DQ, DP, DR Negative +++ T, C 1 : 100 DAKO MO775 Cd68 Negative + M 1 : 100 DAKO MO814 CD31 Negative + V 1 : 40 DAKO MO823 FGF Positive weak + V, T 3 mg/ml R&D AF232 S-100 Positive weak + Fs, M 1 : 400 DAKO Z0311 SDF-1 Strong 100% ++ M, H 8 ng/ml R&D MAB350 CK AE1/AE3 Positive 100% ++ TEC Ready to use DAKO M3515 CD3 Negative + T 1 : 100 DAKO A0452 CD4 Negative +++ T 1 : 150 NCL-CD4 368 CD8 Negative ++ T 1 : 150 DAKO M4710 CD34 Negative + PV 1 : 50 DAKO M7165 CD20 Negative + M 1 : 400 DAKO M0755 p53 Negative Negative 1 : 25 DAKO M7001 MIB-1 Positive 3% T cortex 50% 1 : 150 DAKO M7240 Table 2. Identification attempt of the thymic ptec progenitor cells isolated while in culture by means of thymosin alpha-1, a thymic hormone (ELISA method). Results: thymosin 1- alpha determination in thymic homogenate and while in culture (ELISA method). Material thymosin-1 alpha level [pg/ml] Chang C Medium (1) 0.0 Fetal serum (2) 2.4 Culture cocktail (1+2) g thymus (homogenate) g thymus (homogenate) g thymus (homogenate) g thymus (homogenate) Supernatant 1-12x Isolated lymphocytes 50.0

3 Wszystkie oznaczenia wykonywano techniką imunocytochemiczną PAP. Z zawiesiny komórek po rozmrożeniu i wypłukani RPMI i DMSA wykonywano po 12 rozmazów z 20 ampułek zabankowanych komórek. Wykonywano barwienie HE oraz następujące reakcje z użyciem przeciwciał mono i polklonalnych: HLA klasy II DP,DQ,DR, HLA klay I ABC, przeciwko cytokeratynie AE1/ AE3, FGF-1, CD31, CD68, CD3, CD20 i SDF-1 alpha., p53, CD34, S-100. Ryc. 2 przedstawia wyniki identyfikacji ptec w zakresie DDF-1 CK, s-100, i FGF-1

4 Ryc.3. Wygląd początkowej fazy wzrostu Komorek progenitorowyc wychodzenie Komorek z eksplantu 3a. i wygląd komorek progenitorowych po trypsynizacji 0.25% trypsyna 3b. Ryc. 4a,b. Obraz komorek progenitorowych w mikroskopii elektronowej. Widoczne charakterystyczne dla Komorek nabłonkowyc grasicy tonofilamenty 4b i jaderko 4a. Osteomed (Dr n med. Andrzej Sawicki. Wyprodukowane komórki pozyskane w procesie przetwarzania in vitro w warunkach jałowych przekazywano do Banku Komorek IPCZD na zamrożenie. Każda hodowla była zakładana na 10 butelkach Falcona i jednej dodatkowej kontrolnej. Hodowle prowadzono w okresie 3-4 tygodni. Co 4 dni wykonywano zmianę podłoża. Jako podłoże do hodowli używano Medium Changa C+B z dodatkiem 10 % inaktywowanej surowicy płodowej oraz dodatkiem gentamycyny. Prowadząc hodowle u 50 dawców u każdego dawcy na 11 butelkach zużyto 50litrów podłoża. I około 550 butelek Z każdej butelki pozyskiwano 1-2 miliony komórek. Ogółem otrzymano 10 miliardów Komorek. Na wykonanie zadanie zużyto około 200 dni Zakład Mikrobiologii I immunologii klinicznej ( Doc. Jacek Michalkiewicz). W celu dokonania identyfikacji komórek progenitorowych przy pomocy cytometrii przepływowej z

5 banku wykorzystano 10 ampułek po około 2 miliony Komorek. Była to ilość wystarczająca po rozmrożeniu, wypłukaniu i odwirowaniu komórek do wykonania identyfikacji przy pomocy przeciwciała z SDF- 1 alpha ( strmal derived factor alpha ). Wykonano oznaczenie ilościowe markera powierzchniowego komorek. Marker jest charakterystyczny do identyfikacji ptec.. Pozyskana populacja miała charakter jednorodny i pond 14% komorek ujawniło obecność markera powierchnioweg SDF-1 alpha. Patrz Fig 3. Fig. 3.. wynik identyfikacji cytofotometrycznej ptec. Około 15% Komorek zawiera SDF-1 antygen powierzchniowy. Zakład Radioimmunologii IPCZD ( Doc. Dr n med. Roman Janus) W pierwszych 2-ch latach projektu zbierano sukcesywnie surowice do zamrożenia. Oznaczenie hormonu dokonywano jedno czasowo po otrzymaniu większej liczby surowic. Surowice pochodzily z Kliniki Kardiochirurgii pobrane przed i po tymektowmii oraz z poradni Kardiochirurgicznej IPCZD w odległych okresach kontrolnych po operacji. Dodatkowo wykonano oznaczenie hormonu w surowicy dorosłych pozyskanej przypadkowo przy innej okazji badania za zgodą pacjentów. Oznaczenie wykonywano w jednym czasie we wszystkich zgromadzonych surowcach w roku Ponadto wykonywano oznaczenie Thymozyny w płynach używanych do hodowli - dla sprawdzenia czy komórki progenitorowe już zdolne są do produkcji hormonu. Wyniki zestawiono w tabeli 3. Tabela 3 wyniki oznaczeń Thymozyny alpha 1 w użwanych do hodowli produktach i homogenatach z grasicy Poziom tymozyny pg/ml 1.Medium hodowlane 0 2.Surowica płodowa Koktajl 1+2 1,6 4.Płyny supernatanty średnio (10badań) 0,3 5.Surowica płodowa średnio (10badań) Homogenaty z grasicy (10 badań) Poziom przed tymektomią ( 20 badań) Poziom tymozyny po tymektomii (20) Poziom tymozyny dzieci,odległe (do roku)

6 10.Poziomy tymozyny u dorosłych (Wiek 30 50lat). Jako wynikało z przeprowadzonych pomiarów poziom hormonu u dzieci przed operacja i po operacji był podobny i wynosił 1,94pg/ml a po operacji 0,91g/ml. Ponieważ głównym producentem tyrozyny jest grasica przeto zjawiskowo to interpretowano w ten sposób że u dzieci podczas operacji wad wrodzonych serca nie dochodzi do całkowitej resekcji narządu. Pozostawione resztki wystarczają do utrzymywania homeostazy hormonalnej. W okresie do roku po operacji poziom tyrozyny w surowicy wahał się w granicach od 3,49pg/ml do 9.0pg/ml i był podobny jak u dorosłych w wieku lat (Brak badań na temat zachowania się tymozyny u osób powyżej 70 roku życia u których jakoby dochodzi do wyczerpania rezerwy grasiczej. Własne badania pilotażowe wskazują że poziom ten może być mniejszy od 1.0pg/ml. Klinika Kardiochirurgii Dziecięcej IPCZD (Prof. Dr hab. n med Bogdan Maruszewski ) Za zgoda Komisji Etycznej pobrano do badań na przełomie roku 2007/ explantów tzw. totalnej tymektomii u dzieci podczas operacji wad wrodzonych serca oraz pobrano próbki krwi przed i po operacji w okresie 2-5 dni.materiał tkankowy wstanie jałowym przekazywano oziębione lodem do laboratorium biotechnologicznego Osteomed w celu przeprowadzenie hodowli In vitro. Krew po odwirowaniu surowicy natychmiast została dostarczana do Zakładu Radioimmunologii IPCZD w celu zamrożenia (-70oC) i przechowywana do czasu wykonania oznaczeń thymozyny alpha 1.