Kolorymetria - dział spektrofotometrii absorpcyjnej (inaczej absorpcjometrii) Oznaczanie stężeń substancji barwnych na podstawie absorbcji ich roztworów w zakresie światła widzialnego Spektrofotometria UV/Vis zakres poszerzony o promieniowanie ultrafioletowe Bliski nadfiolet 200-400 nm Światło widzialne 400-780 nm

Znając długość światła monochromatycznego możemy powiedzieć, wrażenie jakiej barwy wywoła ono w naozym oku

Wrażenie barwy, jakiego doznajemy związane jest z selektywnym pochłanianie światła przez daną substancje (absorbcja) Substancja barwna pochłania ze światła białego barwę komplementarną do jej własnej Widoczne jest TYLKO to promieniowanie, które nie uległo zaaboorbowaniu Promieniowanie to jest odbierane jako barwa dopełniająca, na którą składają się poszczególne rodzaje przepuszczonych fal elektromagnetyczne

Wrażenie bezbarwności żadna z fal elektromagnetycznych światła widzialnego nie jest absorbowana przez daną substancję Barwa czarna wszystkie lub prawie wszystkie fale z zakresu widzialnego zostają zaabsorbowane Barwa biała wszystkie lub prawie wszystkie długości fal z zakresu widzialnego zostają odbite Wrażenie koloru białego daje światło zawierające wszystkie długości fal w odpowiednich proporcjach

Rozkład natężeń w widmie oraz barwa światła emitowanego zależą od: - rodzaju źródła światła - temperatury źródła (w temperaturach niższych przeważa czerwień, w wyższych błękit i fiolet)

Barwa substancji jest ściśle związana z jej budową chemiczną Zgodnie z teorią elektronową przyczyną barwy większości związków jest obecność w cząsteczce sprzężonych elektronów П, które łatwo ulegają wzbudzeniu Dużą rolę w zjawisku selektywnej absorpcji światła przez niektóre związki odgrywa obecność w ich cząsteczce ugrupowań atomowych określanych chromoforami i auksochromami

Chromofory zawierają sprzężone lub odosobnione wiązanie podwójne, które szczególnie łatwo ulegają wzbudzeniu i przechodzą na inne poziomy energetyczne Przejście takie powoduje emisję lub absorpcję kwantu światła Im dłuższy jest układ sprzężonych wiązań tym łatwiej układ elektronów Π ulega wzbudzeniu

Aukoochromy pogłębiają działanie chromoforów, przesuwają absorpcję w kierunku lub fal dłuższych (efekt batochromowy) krótszych (efekt hipsochromowy)

Rozpuszczalnik wpływa na postać widma absorpcji. Rozpuszczalniki polarne powodują zwykle batochromowe przesunięcia maksimów absorpcji (w stosunku do widm cząsteczek w fazie gazowej); dodatkowym czynnikiem zmieniającym widmo absorpcji może być ph roztworu. Rozpuszczalniki niepolarne mało wpływają na widmo W wyniku oddziaływań chromoforów z ich mikrootoczeniem może mieć także miejoce zwiękozenie lub obniżenie natężenia aboorpcji (efekt hiperchromowy lub hipochromowy)

Schemat spektrofotometru

Rozszczepienie na składowe o określonej długości daje widmo ciągłe

I roz I odb I 0 = I odb + I roz + I abo + I I 0 = I odb + I roz + I abo + I I o I I abs Wiązka równoległa promieni światła monochromatycznego po przejściu przez warstwę jednorodnego ośrodka absorbującego ulega oołabieniu w wyniki odbicia, rozproszenie i absorbcji

Natężenie promieniowania monochromatycznego I o ulega osłabieniu do wartości I przy przejściu przez ośrodek absorbujący. Stosunek natężenia promieniowania przeehodząeego przez badaną próbkę do natężenia promieniowania padająeego na próbkę jest I /I o nazywany jest transmisją (transmitaneją) T: T = I / I o lub T = (I / I o ) 100% I o I Transmisja wskazuje, jaka część promieniowania padającego została przepuszczona przez badaną próbkę

Logarytm dziesiętny stosunku natężeń promieniowania padającego na próbkę do natężenia promieniowania przechodzącego przez próbkę jest określany jako absorbancja A: I A = log o I Łatwo sprawdzić, że A = log 1/T = - log T jeśli transmisja jest T = 1/10 A wyrażona jako ułamek A = log100/t = 2 log T jeśli transmisja jest wyrażona T = 100/10 A w proeentaeh

Aboorpcja jeot fizycznym proceoem pochłaniania promieniowania elektromagnetycznego przechodzącego przez próbkę, podczao gdy aboorbancja jeot wielkością fizyczną charakteryzującą ilościowo ten proceo Dawniej zamiennie z terminem terminuabsorbancja używane były terminy ekstynkcja lub gęstośćoptyczna. Obeenie stosujemy terminabsorbancja w sytuaeji, w której obniżenie natężenia promieniowania przeehodząeego przez próbkę jest uwarunkowane proeesem jego absorpeji (stosująe terminturbidancja, gdy przyezyną obniżenia natężenia promieniowania przeehodząeego przez próbkę jest rozpraszanie światła). Absorbaneja jest wielkośeią bardziej użyteezną niż transmisja, ponieważ w większośei sytuaeji jest proporejonalna do stężenia substaneji absorbująeej w roztworze i grubośei warstwy absorbująeej

Prawo Lamberta-Beera -di = I dx I = I o e -x

I = Io e-x

Prawo Lamberta-Beera absorbancja Współczynnik absorpcji (molowy, jeśli stężenie wyrażone w mol dm -3 ) A = ε c l Grubość warstwy absorbującej Stężenie substancji pochłaniającej Wartość molowego współezynnika absorpeji jest równa absorbaneji, jaką ma roztwór o stężeniu 1 mol dm -3 w kuweeie o grubośei 1 em

Prawo addytywności abaorbancji Wartość absorbancji światła zależy od całkowitej liczby cząsteczek absorbujących znajdujących się na drodze promieniowania świetlnego Gdy roztwór absorbujący jest wieloskładnikowy to A = A 1 + A 2 + A 3 +... + A n O addytywności można mówić jeżeli poszczególne składniki nie oddziałują między sobą i nie dochodzi do reakcji chemicznych

Absorbancja roztworu jest wielkością addytywną

Odchylenia od prawa Lamberta-Beera Prawo Lamberta-Beera spełniają substancje niezjonizowane lub zjonizowane całkowicie czyli takie których budowa nie ulega zmianie wraz ze zmianą stężenia

Odchylenia od prawa Lamberta-Beera Przyczyny - zmiany w strukturze związku - polimeryzacja cząsteczek lub asocjacja - zjawisko hydratacji - wpływ rozpuszczalnika - reakcja rozpuszczalnika z substancją barwną - zmiana stężenia - powstanie kompleksowych pośrednich - ph indykatory ph - zmiany zabarwienia w czasie - temperatura - dysocjacja - ZANIECZYSZCZENIA

Przykład Stężenie oksyhemoglobiny w roztworze możemy określić oznaezająe absorbaneję jej roztworu przy długośei fali 576 nm. Jeśli roztwór hemoglobiny (mierzony w kuweeie o grubośei 1 em) ma absorbaneję A 576, to stężenie hemoglobiny w roztworze równe jest c = (A 576 / ε 576 1 cm) ε 576 = 15 [mmol -1 dm 3 em -1 ] c = (A 576 /15 mmol -1 dm 3 em -1 1 cm) Jeśli zmierzyliśmy A 576 = 0,30 To c = (0,30 / 15) mmol dm -3 = 0,02 mmol dm -3 = 20 µmol dm -3

Spektrofotometria umożliwia jakościową i ilościową analizę składu roztworów

Charakterystyczne pasma pochłaniania światła Białka pochłaniają w nadfiolecie (λ max 280 nm) dzięki obecności reszt aminokwasów aromatycznych

Kwasy nukleinowe pochłaniają w nadfiolecie (λ max 260 nm) dzięki obecności reszt zasad azotowych

Różnica pochłaniania światła przez NAD + i NADH jest podstawą wielu testów enzymatycznych

Badając małe różnice w widmach absorpcji zdejmujemy widma różnicowe

A260

Spektrofotometryczny pomiar kinetyki reakcji (bio)chemicznej

W roztworze znajdują się białko i DNA. Jeśli znamy współczynniki absorpcji białka ε b i DNA c n przy dwóch długościach fali λ 1 i λ 2 (np. 260 nm i 280 nm), możemy określić stężenie obu składników w roztworze, bowiem A(λ 1 ) = [ε b (λ 1 ) c b + ε n (λ 1 ) c n ] l A(λ 2 ) = [ε b (λ 2 ) c b + ε n (λ 2 ) c n ] l c b - stężenie białka; c n - stężenie DNA; ε b (λ 1 ) - współczynnik absorpcji białka przy długości fali λ 1 ; ε n (λ 2 ) - współczynnik absorpcji kwasu nukleinowego przy długości fali λ 2, itd., l grubość kuwety Po zmierzeniu absorbancji roztworu przy dwu długościach fal otrzymujemy układ dwu równań z dwiema niewiadomymi, który możemy rozwiązać: c b = [ε n (λ 2 ) A(λ 1 ) - ε n (λ 1 ) A(λ 2 )] / l [ε b (λ 1 ) ε n (λ 2 ) - ε b (λ 2 ) ε n (λ 1 )] c n = [ε b (λ 2 ) A(λ 2 ) - ε b (λ 2 ) A(λ 1 )] / l [ε b (λ 1 ) ε n (λ 2 ) - ε b (λ 2 ) ε n (λ 1 )]

Przykład Wyznaczanie zawartości trzech form mioglobiny (czerwonego barwnika mięśni) - oksymioglobiny (oksymb), metmioglobiny (metmb) i ferrylomioglobiny (ferrylomb) w oparciu o pomiary absorbancji mieszaniny przy długościach fal 490 nm, 560 nm i 580 nm: [oksymb] = 2,8 A 490-127 A 560 + 153 A 580 [metm] = 146 A 490-108 A 560 + 2,1 A 580 [ferrylomb] = - 62 A 490 + 242 A 560-123 A 580

Rozpraszanie światła Zjawisko rozpraszania światła (ogólniej: promieniowania elektromagnetycznego) przez zawiesiny i inne mętne próbki jest przeszkodą w pomiarach absorpcji i fluorescencji, lecz samo jest wykorzystywane w badaniach, m.in. zawiesin komórek Rozpraszanie promieniowania może mieć charakter rozpraszania Rayleigha tj. zachodzić bez zmiany częstości promieniowania bądź rozpraszania Ramana (jeśli rozpraszanie wiąże się ze zmianą częstości promieniowania). Rozpraszanie Ramana zachodzi, jeśli wielkość obiektu rozpraszającego jest mniejsza od długości fali światła (jak to ma miejsce w przypadku pojedynczych makrocząsteczek) może występować efekt stokesowski, jeśli częstość promieniowania rozproszonego jest mniejsza od częstości promieniowania padającego (λ pad < λ rozpr ) bądź efekt antystokesowski, jeśli częstość promieniowania rozproszonego jest większa od częstości promieniowania padającego na badany obiekt (λ pad > λ rozpr )

W zakresie niskieh stężeń eząstek rozpraszająeyeh natężenie I r światła monoehromatyeznego rozproszonego przez zawiesinę eząstek jest opisane wzorem Rayleigha I I r n 2 2 3 1 n 2 0 n 2 2 1 n 2 2 NV λ 4 2 I o natężenie światła padająeego na próbkę, N - liezba eząstek rozpraszająeyeh w próbee, V - objętość eząstki rozpraszająeej, n 1 - współezynnik załamania światła przez zawieszone eząstki, n 2 - współezynnik załamania światła przez ośrodek, λ - długość fali światła

Nefelometria a turbidymetria Źródło światła Detektor Nefelometria Turbidymetria Detektor pomiar nefelometryczny to pomiar światła rozproozonego, zaś pomiar turbidymetryczny to pomiar światła przepuozczonego przez próbkę

W turbidymetrii funkcję stosunku natężeń światła padającego i przepuszczonego przez próbkę, zdefiniowaną (i mierzoną) identycznie jak absorbancja w absorpcjometrii, nazywamy turbidancją S S = log (I o /I) W zakresie małych stężeń cząstek rozpraszających obowiązuje wzór S = l - grubość warstwy rozpraszająeej, e - stężenie eząstek, d - pole przekroju poprzeeznego eząstki, λ - długość fali światła, klcd a, k stałe zależne od geometrii układu, rodzaju eząstek rozpraszająeyeh i ośrodka 3 4 4 d + aλ

Zależność turbidancji od stężenia cząstek (np. komórek) w zawiesinie jest liniowa tylko dla małych stężeń S Stężenie komórek

S = klcd 3 4 4 d + aλ Natężenie światła roaproaaonego, jak i turbidancja aależą od atężenia caąatek w aawieainie i ich objętości. Metody nefelometryezne i turbidymetryezne mogą więe służyć do wyznaezania stężenia lub wielkośei eząstek rozpraszająeyeh. Stosujemy je do pomiaru stężenia komórek, eo jest dużo prostsze niż liezenie komórek pod mikroskopem. Kinetyezny pomiar rozpraszania światła w agregometrze umożliwia pomiar przebiegu agregaeji płytek krwi indukowanej działaniem odpowiednieh bodźeów; w proeesie tym zmienia się wielkość eząstek rozpraszająeyeh.

S = klcd 3 4 4 d + aλ Intensywność światła rozproszonego szybko maleje wraz ze wzrostem długości fali. Pomiary są więc tym bardziej czułe, im mniejszą długość fali promieniowania stosujemy. W praktyce, mierząc rozpraszanie światła przez komórki, stosujemy jednak światło stosunkowo długofalowe (600-700 nm), bowiem chcemy uniknąć nakładania się efektów pochłaniania i rozpraszania światła (komórki zwierzęce zwykle nie zawierają chromoforów pochłaniających w zakresie λ 600 nm).