Linie myszy selekcjonowane w kierunku wysokiej i niskiej wrażliwości na stres w badaniach biomedycznych

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Wydział Nauk o Zwierzętach lek. wet. Barbara Wijas Linie myszy selekcjonowane w kierunku wysokiej i niskiej wrażliwości na stres w badaniach biomedycznych The mouse lines selected for high and low sensitivity to stress in biomedical studies Praca dyplomowa na kierunku: Zwierzęta laboratoryjne hodowla, utrzymanie i użytkowanie Praca wykonania pod kierunkiem: dr hab., prof. nadzw IGHZ Mariusz Sacharczuk Zakład Genomiki IGHZ Warszawa, 2016 rok

Streszczenie Linie myszy selekcjonowane w kierunku wysokiej i niskiej wrażliwości na stres w badaniach biomedycznych Celem selekcji outbreedowej populacji myszy Swiss-Webster w kierunku wysokiej (HA high analgesia) i niskiej (LA low analgesia) analgezji postresowej było stworzenie modelu zwierzęcego zróżnicowanej wrażliwości na stres. Główną cechą różnicującą linie myszy HA i LA jest aktywność układu opioidowego, co włącza ten model do badań nad mechanizmem działania i skuteczności terapeutycznej leków przeciwbólowych. Selekcja linii myszy HA i LA spowodowała również zmiany w szeregu innych cech bezpośrednio związanych z poziomem analgezji postresowej, w tym zaburzenie mechanizmów termoregulacyjnych i metabolicznych w warunkach stresu oraz większą wrażliwość na czynniki mutagenne i podatność do nowotworów u myszy linii HA. Obniżonej aktywności układu opioidowego myszy linii LA towarzyszy natomiast zwiększenie spożycia alkoholu oraz nasilenie procesów zapalnych w modelu choroby Leśniowskiego-Crohna. Charakterystyka linii myszy HA i LA świadczy, iż są one bardzo dobrym modelem w badaniach genetycznego podłoża zmian behawioralnych i fizjologicznych oraz chorób związanych z poziomem wrażliwości na stres. Słowa kluczowe Stres, analgezja, nocycepcja, układ opioidowy, selekcjonowane linie myszy Summary The mouse lines selected for high and low sensitivity to stress in biomedical studies The purpose of selecting outbreed population of Swiss-Webster mouse in the high (HA - high analgesia) and low (LA - low analgesia) post stress analgesic was to create an animal model with varying levels of sensitivity to stress. The main feature differentiating mouse lines HA and LA is the activity of the opioid, which includes the model for the study of the mechanism of action and therapeutic efficacy analgesics. Selection of mices with HA and LA has also resulted in a change of other features directly related to the level of analgesia in the thermoregulatory mechanisms disorder and metabolic stress conditions and higher sensitivity to mutagens and susceptibility to tumors in mice line HA. From the other hand in LA line of mice we can observe reduced activity of the opioid system, increased alcohol consumption and and severity of inflammatory processes in the model of Crohn's disease. Characteristics of mouse lines HA and LA indicates that they are a good model to study the genetic basis of behavioral and physiological changes and diseases related to the level of sensitivity to stress. Keywords Stress, analgesia, pain, opioid system, selective mouse breeding

Spis treści 1. Wprowadzenie...6 2. Metodyka do prowadzenia selekcjonowanych linii myszy HA i LA...8 2.1. Testowanie...8 2.2. Hodowla linii myszy... 10 2.3. Kontrola genetyczna linii HA i LA... 11 2.4. Zastosowanie innych testów określających poziom analgezji myszy linii HA i LA... 13 3. Porównanie linii myszy HA i LA... 14 3.1. Charakterystyka układu opioidowego... 14 3.2. Reakcja na związki przeciwbólowe... 16 3.3. Spożycie i reakcja na alkohol... 16 3.4. Termoregulacja i metabolizm... 17 3.5. Podatność na nowotwory... 18 3.6. Podatność na działanie czynników mutagennych... 19 3.7. Umiejętność pływania... 20 3.8. Zachowania depresyjne i lękowe... 21 4. Wykorzystanie selekcjonowanych myszy w badaniach biomedycznych... 21 4.1. Badania wpływu stresu na rozwój inokulowanego czerniaka u linii myszy HA i LA. 21 4.2. Badania nad mechanizmem i terapią uzależnienia od alkoholu... 26 4.3. Aktywność perystaltyczna przewodu pokarmowego... 26 4.4. Inne badania... 27 5. Podsumowanie i wnioski... 28 Spis piśmiennictwa... 29

Wykaz skrótów użytych w pracy: HA (ang. High Analgesia) linia myszy Swiss-Webster selekcjonowana w kierunku wysokiego poziomu analgezji postresowej LA (ang. Low Analgesia) linia myszy Swiss-Webster selekcjonowana w kierunku niskiego poziomu analgezji postresowej SIA (ang. Stress Induced Analgesia) analgezja wywołana stresem BBB (ang. blood-brain barrier) bariera krew- mózg CMS (ang. chronic mild stress) chroniczny łagodny stres HP (ang. hot plate) test gorącej płytki TF (ang. tail flick) test cofania ogona B16F0 linia komórek mysiego czerniaka użyta w doświadczeniach MPE (ang. Maximal Possible Effect/Change) maksymalny możliwy efekt NOR (ang. Nucleolar Organizer Region) obszary jąderkotwórcze

1. Wprowadzenie Badania nad bólem i stresem prowadzone na modelu zwierzęcym można odnieść do analogicznych mechanizmów organizmu ludzkiego pojawiających po zadziałaniu tych czynników. Przyczyną bólu jest podrażnienie receptorów zwanych nocyceptorami, które wywołują odruchy obronne zwane nocyceptywnymi. W organizmie wytwarzane są endogenne substancje tłumiące ból zwane endorfinami lub opiatami, które wiążąc się z receptorami opioidowymi µ (mu), δ (delta) i κ (kappa) wywołują zmiany wewnątrzkomórkowe prowadzące do zahamowania przewodzenia bodźców bólowych. Zastosowanie antagonistów tych receptorów pozwala na poznanie udziału i funkcji poszczególnych ich typów w hamowaniu różnych form bólu ostrego czy neuropatycznego. Udział poszczególnych typów receptorów opioidowych w tłumieniu bólu i warunkowaniu cech regulowanych przez układ opioidowy badane są przy zastosowaniu zarówno niespecyficznych (nalokson lub naltrindol) jak i wysoce specyficznych antagonistów blokujących odpowiednio receptory μ (cyprodyma), -δ (naltrindol) oraz κ (nor-binaltorfinina). W warunkach klinicznych analgezję, czyli stan zmniejszonego odczuwania bólu można wywołać środkami farmakologicznymi o charakterze agonistów receptorów opioidowych lub oddziałując na układy pozaopioidowe np. NMDA, GABA. W warunkach naturalnych czynnikami hamującymi ból zarówno u ludzi jak i u zwierząt mogą być: stres, akupunktura, stany emocjonalne czy pobudzenie seksualne (Sadowski 2006; Amit i Galina, 1988). Hans Selye wprowadził pojęcie stresu jako niespecyficzną fizjologiczną reakcję organizmu na zagrożenie, natomiast czynnik wywołujący stres nazwał stresorem (Selye, 1936; Pacak i Palkovits, 2001). Analgezja wywołana stresem (ang. Stress Induced Analgesia - SIA) polega na aktywacji działania stresorów na endogenne układy: opioidowy, noradrenergiczny, cholinergiczny i GABA-ergiczny. Zwierzęcym modelem charakteryzującym się zróżnicowaną wrażliwością na stres i ból są linie myszy selekcjonowane w kierunku niskiej (LA low analgesia) i wysokiej (HA high analgesia) analgezji wywołanej 3 minutowym pływaniem w wodzie

o temperaturze 20 C (Panocka i wsp. 1986 a i b). O udziale komponentu opioidowego analgezji wywołanej pływaniem decyduje temperatura i czas pływania (Cooper i wsp. 1982). Pływanie w ciepłej wodzie i krótszy czas tego stresora (np. 1-minutowe) u myszy i szczurów wywołuje głównie analgezję opioidową, natomiast wydłużenie pływania w zimnej wodzie większy udział analgezji nieopioidowej (Terman i wsp. 1983). W 1983r. Zespół prof. Bogdana Sadowskiego z Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu rozpoczął selekcję myszy outbredowego stada Swiss Webster i wyodrębnił dwie linie zwierząt o różnej odpowiedzi analgetycznej na stres wywołany 3 minutowym pływaniem w wodzie o temperaturze 20 C. Linia HA (high analgesia wysokoanalgetyczna) wykazuje silną analgezję na ostry ból termiczny, natomiast linia LA (low analgesia niskoanalgetyczna) minimalną analgezję. W celu oceny czucia bólu u zwierząt zastosowano testy: gorącej płytki (HP hot plate) i odruchu cofania ogona (TF tail flick). Czas upływający od momentu postawienia myszy na gorącej płytce do wystąpienia charakterystycznych odruchów lizania lub otrząsania kończyn mierzony stoperem nazywany jest okresem utajonym lub latencją reakcji bólowej. W dalszej części pracy zostanie opisana metodyka hodowli selekcjonowanych linii myszy, ich porównanie oraz możliwość wykorzystania w prowadzonych badaniach.

2. Metodyka do prowadzenia selekcjonowanych linii myszy HA i LA 2.1. Testowanie Testowanie samic i samców przeprowadza się w wieku 7-8 tygodni (max 9 tyg.) według ściśle ustalonych procedur. Testowaną mysz umieszcza się na metalowej płytce ogrzewanej wodą o temperaturze 56 C w cylindrze z pleksiglasu o średnicy 15 cm. Następnie mysz poddawana jest 3-minutowemu stresowi pływania w plastikowym zbiorniku wypełnionym wodą na wysokość ok. 12 cm o temperaturze 20 C. Po zakończeniu pływania zwierzęta poddaje się osuszeniu na ligninie i ponownemu pomiarowi nocycepcji w teście gorącej płytce. Czas upływający od momentu umieszczenia myszy na płytce do wystąpienia charakterystycznego odruchu otrząśnięcia lub lizania kończyny miednicznej mierzony jest stoperem. W celu uniknięcia oparzenia w przypadku braku reakcji maksymalny czas przebywania na płytce ogranicza się do 60 sekund.

Fotografia 1. Procedura testowania myszy w kierunku poziomu analgezji postresowej wywołanej pływaniem w wodzie o temperaturze 20 C. 1-pomiar latencji podstawowej (nocycepcji), 2-stres pływania w wodzie, 3-osuszanie myszy, 4-pomiar poziomu latencji po stresie pływania określający poziom analgezji 1 2 3 4

Do dalszych badań i kojarzenia w celu wytworzenia kolejnego pokolenia kwalifikuje się myszy spełniające kryteria przyjęte dla linii: HA samce i samice powinny wykazywać czas latencji (przed pływaniem) nie krótszy niż 5 sekund, natomiast po pływaniu, czyli zadziałaniu bodźca stresowego maksymalnie przyjęty czas wynoszący 60 sekund LA samce i samice powinny wykazywać podstawowy czas latencji (przed pływaniem) nie dłuższy niż 3 sekundy, natomiast po pływaniu, czyli po zadziałaniu bodźca nie dłuższy niż 10 sekund Maksymalny poziom analgezji oceniany jest parametrem %MPE (ang. Maximum Possible Effect) określony wzorem: Latencja poczatkowa - Latencja %MPE = 60 - Latencja poczatkowa koncowa 100 Testuje się wszystkie osobniki z każdej rodziny. Myszy niespełniające przyjętych dla danej linii kryteriów eliminuje się ze stada, a pozostałe rodzeństwo nie może być przeznaczone do tworzenia grup rodzicielskich kolejnego pokolenia. Można wykorzystać do badań pozostałe rodzeństwo, które spełnia kryteria wyznaczone dla danej linii. 2.2. Hodowla linii myszy Kojarzenie Kojarzenie par samców z samicami przeprowadza się w wieku 12-14 (max 16) tygodni tworząc 100-150 par. Łączy się myszy pochodzące z różnych rodzin, wyłącznie w systemie monogamicznym (jedna samica z jednym samcem). Niedopuszczalne jest kojarzenie osobników z pół rodzeństwa mających wspólnego ojca. Po stwierdzeniu skutecznego pokrycia, czyli obecności czopa pochwowego, samce oddziela się od samic. Maksymalny czas przebywania razem par to okres 1 tygodnia. W przypadku nieskuteczności pokrycia dopuszcza się wprowadzenie innego samca. Brak skuteczności pokrycia przez drugiego samca oznacza eliminację samicy z rozrodu.

W celu utrzymania zmienności genetycznej na odpowiednio wysokim poziomie i unikaniu inbredu selekcję prowadzi się stosując schemat kojarzeń niekrewniaczych oraz stały monitoring genetyczny (Sacharczuk i wsp. 2005). Jednocześnie prowadzona jest hodowla linii niepoddawanej selekcji, czyli linii kontrolnej. Odsadzanie Po urodzeniu przeprowadza się wstępną selekcję eliminując osobniki słabe lub ze stwierdzonymi wadami rozwojowymi. W momencie odsadzania 3 tygodniowego potomstwa od matki przeprowadza się rozpoznanie płci. W przypadku obecności w miocie tylko jednego samca lub jednej samicy, powinny być one poddane eliminacji, ponieważ indywidualne przebywanie w klatce może być silnym stresem dla myszy i wpływać na wyniki doświadczeń. Badania na myszach Myszy linii LA i HA przeznaczone do badań powinny być w wieku 8 do 14 tygodni. Wyjątkowo, jako uzupełnienie grup doświadczalnych można użytkować myszy w wieku nieprzekraczającym 18 tygodni. Myszy przeznaczone do badań powinny być utrzymane w rodzinach. Jedynie w przypadku wymagań doświadczalnych dopuszcza się rozdzielenie osobników do indywidualnych klatek. 2.3. Kontrola genetyczna linii HA i LA W celu monitoringu poprawności pracy hodowlanej (unikanie inbredu) i wykluczenia kontaminacji genetycznej okresowo przeprowadzana jest kontrola genetyczna. Wybrane metody analizy genetycznej badanych linii myszy dotyczą analizy DNA fingerprinting, która obecnie wypierana jest przez metodę analizy polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych opartych na technice PCR. Przykładową ocenę zmienności genetycznej wewnątrz i pomiędzy liniami określają wzory prążkowe DNA fingerprinting przedstawione na fot. 2.

Fotografia 2. Analiza DNA fingerprinting myszy linii HA i LA przy wykorzystaniu sondy molekularnej 33.6 (lewy panel) i 33.15 (prawy panel). Strzałkami zaznaczono prążki charakterystyczne dla danej linii (HA-czerwone, LA-niebieskie) (Fotografia zaczerpnięta z prezentacji M. Sacharczuka) Dystans genetyczny między obiema liniami wyraża się średnią wartością indeksu zróżnicowania (APDp) wynoszącego w 53 pokoleniu selekcyjnym 22,03 oraz wartością dystansu genetycznego (DL) równego 0,08 określonego na podstawie indeksów podobieństwa wewnątrz i między liniami. Indeks podobieństwa (BS) równy był 77,97. Kolejną techniką wykorzystywaną do oceny zmienności genetycznej linii myszy HA i LA jest polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych zlokalizowanych w chromosomach: 1, 2, 4 i 12. Również w tym przypadku identyfikowane są allele o długości charakterystycznej dla danej linii. Mikrosatelita D2Mit226 o długości 124 pz jest charakterystyczny dla linii HA, a D12Mit137 o długości 147 pz dla LA (tabela 1).

Linia myszy Symbol mikrosatelity D1M200 D2M226 D4M58 D12M136 205/ 205 310/ 310 205/ 310 102/ 102 124/ 124 102/ 124 192/ 192 178/ 178 192/ 178 147/ 147 220/ 220 147/ 220 HA 6 1 4 0 8 3 0 9 2 0 11 0 LA 0 7 1 9 0 0 0 1 8 6 0 3 Tabela 1. Allele mikrosatelitarne występujące u linii HA i LA (Sacharczuk M. prezentacja) Myszy linii HA i LA poddaje się dodatkowo ocenie cytogenetycznej w celu określenia charakterystycznych cech kariotypu. Ocenę kariotypu myszy linii HA i LA przeprowadza się na podstawie preparatów chromosomowych barwionych techniką różnicową GTG (barwienie prążków G) i CBG (barwienie prążków C) u 10 osobników każdej linii. Kolejną metodą oceny cytogenetycznej jest barwienie Ag-NOR identyfikujące obszary jąderkotwórcze chromosomów. Jak wskazują badania Sacharczuka i wsp. (2003) częstość występowania obszarów jąderkotwórczych jest niższa u myszy linii HA w porównaniu do myszy linii LA. 2.4. Zastosowanie innych testów określających poziom analgezji myszy linii HA i LA Oprócz standardowo przyjętego testu gorącej płytki (HP hot plate) w badaniach linii myszy HA i LA wykorzystuje się również test cofania ogona (TF tail flick), który podobnie jak test HP określa wrażliwość zwierząt na termiczny bodziec bólowy. Procedura testu TF polega na skierowaniu na ogon myszy wiązki światła i pomiarze czasu reakcji od zadziałania bodźca do chwili poruszenia ogonem.

Poziom analgezji postresowej przy wykorzystaniu tego testu określany jest analogicznie jak z wykorzystaniem testu HP, czyli pomiarze poziomu nocycepcji przed i po stresie pływania w wodzie o temperaturze 20 C przez 3 minuty. Wyniki uzyskiwane w teście TF są w wysokim stopniu zgodne z wynikami otrzymanymi w teście HP. Różnice pomiędzy tymi testami wykorzystuje się do badania związków o różnej przepuszczalności bariery krew-mózg oraz podczas testowania związków w różnych drogach podania. Przyjmuje się, że w teście HP odruchy warunkowane są ośrodkami rdzeniowo-nadrdzeniowymi, natomiast w przypadku testu TF odruch nocyceptywny ma charakter monosynaptycznego odruchu rdzeniowego (Sacharczuk i wsp. 2010). 3. Porównanie linii myszy HA i LA 3.1. Charakterystyka układu opioidowego Aktywność układu opioidowego jest główną cechą różnicującą myszy linii HA i LA, co potwierdza zróżnicowany poziom analgezji wywołanej morfiną czy skuteczność odwracania analgezji postresowej z zastosowaniem antagonistów receptorów opioidowych. Oprócz zróżnicowania w gęstości receptorów opioidowych w wybranych strukturach mózgu, stwierdzono również występowanie trzech polimorfizmów w receptorze opioidowym delta (jeden powołuje zamianę alaniny w walinę w 107 pozycji, dwa pozostałe typu cichego nie zmieniają aminokwasów) oraz jednego polimorfizmu w receptorze opioidowym -µ (polimorfizm typu cichego). Na podstawie analizy poziomu analgezji osobników z występującym polimorfizmem C320T (skutkującym substytucją A107V stwierdzono, iż poziom analgezji postresowej u myszy linii HA i LA regulowany jest głównie przez receptory δ (Sacharczuk i wsp. 2010) Kolejną cechą różnicującą myszy linii HA i LA jest przepuszczalność bariery krew-mózg. Wielopokoleniowa selekcja myszy doprowadziła u myszy HA do zmian w budowie śródbłonka tworzącego barierę krew-mózg, a tym samym do zwiększenia jej przepuszczalności, co skutkuje zwiększonym wypływem endogennych opioidów z ośrodkowego układu nerwowego i w konsekwencji wzrostem poziomu analgezji obwodowej. (Gajkowska i wsp. 2011, Kosson i wsp. 2014).

Konsekwencją rozszczelnienia BBB jest zwiększony wypływ czynników troficznych pochodzenia mózgowego na obwód, co prawdopodobnie jest jedną z przyczyn szybszego rozwoju nowotworów u myszy linii HA. Jednocześnie spadek poziomu tych czynników troficznych w ośrodkowym układzie nerwowym, może powodować zwiększenie skłonności do depresji (Sacharczuk i wsp. 2013). Rycina 1. Schemat przedstawiający wpływ zróżnicowanej przepuszczalności bariery krew-mózg na poziom analgezji postresowej.

3.2. Reakcja na związki przeciwbólowe Myszy HA są znacznie bardziej wrażliwe na przeciwbólowe działanie morfiny w termicznych testach bólu niż myszy LA (Panocka i wsp. 1986 b, Panocka i wsp. 1991; Sadowski i Panocka. 1993; Marek i wsp. 1992; Kest i wsp. 1993; Lutfy i wsp. 1994; Mogil i wsp. 1995 b; Mogil i wsp 1996 b). Zróżnicowanemu poziomowi analgezji postresowej u myszy linii HA i LA towarzyszy jednoczesne zróżnicowanie w potencjale analgetycznym egzogennych agonistów receptorów opioidowych. Efektywna dawka analgetyczna morfiny (ED50) jest przykładowo 7 razy niższa od dawki potrzebnej do wywołania takiego samego efektu analgetycznego jak u myszy linii LA (Lutfy i wsp. 1994). Zmienność w potencjale analgetycznym morfiny i innych agonistów receptorów opioidowych pomiędzy liniami myszy HA i LA sprawiają, że linie te reprezentują idealny model badawczy do opracowywania i testowania nowych środków przeciwbólowych. 3.3. Spożycie i reakcja na alkohol Udział układu opioidowego w patogenezie uzależnień od alkoholu jest powszechnie znana. Myszy linii HA i LA o zróżnicowanej aktywności układu opioidowego stanowią doskonały model badawczy do badania mechanizmów prowadzących do powstawania i utrzymywania się uzależnienia. Niska aktywność układu opioidowego u myszy linii LA skutkująca zaburzeniami układu nagrody jest jednym z głównych czynników zwiększających spożycie i preferencję alkoholu przez myszy linii LA (Sacharczuk i wsp. 2008, 2010, 2013). Jednocześnie u myszy tej linii alkohol wykazuje niższy potencjał analgetyczny i euforyzujący (Sacharczuk i wsp. 2009), co sprawia, że dla osiągnięcia podobnego efektu jak u myszy linii HA ilość spożywanego alkoholu jest znacznie większa. Szczególne różnice w spożyciu alkoholu u myszy linii HA i LA obserwowane są w warunkach chronicznego stresu środowiskowego, który zwiększa jego spożycie szczególnie u myszy linii LA. Zróżnicowanie spożycia alkoholu w różnych warunkach środowiskowych stawia linie myszy HA i LA jako idealny model do badania interakcji pomiędzy genetycznie zdeterminowaną aktywnością układu opioidowego a stresem środowiskowym.

3.4. Termoregulacja i metabolizm Linie myszy LA i HA różnią się wydolnością termoregulacyjną i tempem metabolizmu. Myszy linii LA mają wyższe wartości maksymalnego tempa metabolizmu (Łapo i wsp. 2003 a, b). Myszy linii HA po zadziałaniu stresu wywołanego pływaniem w temperaturze 20 C zużywają o 20% mniej tlenu i wykazują wyższą hipotermię w porównaniu do myszy linii LA, co świadczy o gorszej adaptacji tej linii do warunków termicznych w stresie w czasie pływania (Sadowski i wsp.1996; Konarzewski i wsp.1997). U myszy linii HA pływanie w wodzie o wyższej temperaturze (38 C) nie powoduje zmian w temperaturze ciała, przy jednoczesnym zachowaniu dłuższego czasu latencji bólowej (Mogil i wsp.1996) (Ryc. 2). Świadczy to, że hipotermia powstała na skutek pływania w wodzie o temperaturze niższej niż temperatura ciała nie jest głównym komponentem składowych analgezji (Sadowski i wsp. 1996). Nalokson znosi analgezję spowodowaną pływaniem jedynie u myszy linii HA (Panocka i wsp. 1986; Panocka i Sadowski 1999) nie wpływając istotnie na wielkość hipotermii, co świadczy iż hipotermia nie jest warunkowana aktywacją układu opioiodowego (Mogil i wsp. 1996). Myszy linii LA są w bardzo niskim stopniu podatne na antagonizm naloksonu.

Rycina 2. Wpływ stresu pływania na parametry związane z analgezją, termoregulacją i wydolnością metaboliczną myszy linii HA i LA. O 2 - Δ O 2 VO 2 (ml/h) Hipotermia ( C) Analgezja (%MPE) HA LA (Rycina zaczerpnięta z prezentacji M. Sacharczuka) 3.5. Podatność na nowotwory Kolejną cechą różnicującą w 6-7 pokoleniu u myszy HA zaobserwowano spontaniczne pojawienie się nowotworów (o charakterze mięsaków-sarkoma). Linia ta miała także większą podatność na indukcję nowotworów po zadziałaniu substancji karcinogennych (nieopublikowane badania prof. Panockiej).

3.6. Podatność na działanie czynników mutagennych Poziom analgezji postresowej u myszy linii HA i LA ściśle koreluje z częstością aberracji chromosomowych w odpowiedzi na mutageny fizyczne i chemiczne (Sacharczuk i wsp. 2003b). Obserwacje te pochodzą z badań w których linie myszy HA po ekspozycji na promieniowanie gamma lub po podaniu mutagenu w postaci mitomycyny C wykazywały wyższy poziom uszkodzeń chromosomów określanych w teście aberracji chromosomowych w postaci: złamań, fragmentów centrycznych, luki chromatynowej i minucji, wymian, obecności chromosomów kulistych, translokacji Robertsona, fragmentacji chromosomów oraz większą częstość mikrojąder w erytrocytach polichromatycznych. Test częstości występowania mikrojąder wskazywały na nieprawidłowo działający system naprawy DNA u myszy linii HA (Sacharczuk i wsp. 2003b). O jego słabym działaniu decyduje genetycznie uwarunkowana zależność między SIA i aktywnością obszarów jąderkotwórczych (Sacharczuk i wsp. 2003a). Fotografia płytki metafazowej myszy z obecnością złamania chromosomowego (Sacharczuk prezentacja)

Fotografia mikrojądra w erytrocycie polichromatycznym szpiku kostnego (Sacharczuk prezentacja) 3.7. Umiejętność pływania Różnice między liniami występują także w teście wymuszonego pływania. Myszy linii LA z łatwością unoszą się na powierzchni wody i ich górna część grzbietu pozostaje ponad powierzchnią przez cały czas trwania testu. Natomiast myszy linii HA pływają w pozycji z wynurzoną głową a zanurzonym tułowiem. Gorsze umiejętności pływania u tych zwierząt mogą przyczyniać się do większej analgezji postresowej. Linia HA

Linia LA (Zdjęcia zaczerpnięte z pracy doktorskiej G. Juszczak, 2007) 3.8. Zachowania depresyjne i lękowe U linii HA występuje wzrost zachowań lękowych i depresyjnych w teście otwartego pola (OF) oraz zawieszenia za ogon (TST), a także wzmożona odpowiedź na klasyczny antydepresant-dezypraminę w warunkach chronicznego stresu (Błaszczyk i wsp. 2000; Sacharczuk i wsp. 2009). 4. Wykorzystanie selekcjonowanych myszy w badaniach biomedycznych 4.1. Badania wpływu stresu na rozwój inokulowanego czerniaka u linii myszy HA i LA. Myszy linii HA i LA pozwalają zbadać zależności między genetyczną uwarunkowaną wrażliwością na bodźce stresowe, poziomem stresu środowiskowego i rozwojem nowotworu. Różnice w aktywności układu opioidowego pomiędzy liniami umożliwiają określenie jego roli w progresji guza nowotworowego oraz w badaniach

wrażliwości na ból nowotworowy oraz terapii bólu towarzyszącego nowotworom (Sacharczuk i wsp.2012; Ragan i wsp. 2013). Badania przeprowadzone w ramach pracy doktorskiej Pani Agnieszki Ragan wskazują na szybszy wzrost guza nowotworowego u myszy linii HA w modelu inokulowanego czerniaka (Ragan i wsp. 2013). Różnice w progresji tego nowotworu nasilały się w warunkach chronicznego stresu środowiskowego polegającego na działaniu różnego rodzaju stresorów zmienianych w cyklu 12 godzinnym. Zastosowano stresory fizyczne: przechylenie klatki o 45, zabieranie ściółki, wlewanie na dno około 1 cm warstwy wody, włączenie stroboskopu, hałas, deprywacja pokarmowa i zmiana cyklu świetlnego. Stresorem o charakterze socjalnym było rozdzielenie myszy do innych klatek łącząc je z osobnikami z innej rodziny tej samej linii. Stresory stosowano losowo, aby zwierzęta nie mogły się przyzwyczaić do nowych niekomfortowych warunków i w każdej dobie jeden rodzaj stresora w cyklu 12-godzinnym. Zachowania depresyjne oceniano przy pomocy dwóch testów: preferencji słodkiego mleka (Willner 1997) oraz zawieszenia za ogon odzwierciedlającego wyuczoną bezradność (Steru i wsp.1985). Ciekawym i bardzo ważnym spostrzeżeniem był rozwój zachowań depresyjnych u myszy linii HA jedynie w warunkach CMS przy braku takiego efektu powodowanego przez sam rozwój guza nowotworowego. Myszy linii LA wykazywały wysoką oporność na inokulację komórkami czerniaka. Jedynie u 5-10% dochodziło do wzrostu guza a w przypadku jego wystąpienia obserwowano całkowity proces regresji.

Zmiany skórne u myszy linii HA powstałe w wyniku oddziaływania warunków chronicznego, umiarkowanego stresu oraz brak takiego efektu CMS u myszy linii LA

(Zdjęcia zaczerpnięte z pracy doktorskiej Ragan, 2015)

Histologicznie u osobników linii LA guzy sklasyfikowano jako nieinwazyjne, bez zmian o charakterze nekrotycznym oraz o ograniczonym procesie angiogenezy. Charakterystyczny dla tej linii proces regresji guza nowotworowego przebiegał przez 14 dni od osiągnięcia jego maksymalnych rozmiarów (20 mm). Regresja była całkowita i zakończyła się jedynie pozakomórkowymi złogami melaniny w postaci czarnych przebarwień w miejscu pierwotnego występowania guza. Proces regresji guza u myszy linii LA może być spowodowany ograniczeniem odżywiania komórek nowotworowych przez upośledzenie tworzenia naczyń krwionośnych. Wysoka regresja nowotworu u linii LA przez hamowanie naczyń krwionośnych guza może być wykorzystana do opracowania metod leczenia tego typu nowotworów. Wystąpiły także znaczne różnice w udziale poszczególnych typów komórek układu immunologicznego pomiędzy selekcjonowanymi liniami we krwi obwodowej. Obserwowanemu w obu liniach rozwojowi czerniaka towarzyszył wzrost bólu nowotworowego, który ujawnił się w postaci termicznej hiperplazji. U myszy HA objawy bólowe wystąpiły szybciej niż u LA, ale też zaobserwowano u nich wtórne zniesienie bólu. Ten przeciwbólowy efekt był związany z aktywacją układu opioidowego przez wydzielane przez komórki czerniaka peptydy opioidowe. Model linii myszy HA i LA umożliwia prowadzenie badań nad interakcją pomiędzy genetycznie uwarunkowaną wrażliwością na bodźce stresowe, poziomem stresu środowiskowego i rozwojem nowotworu. Występująca różnica w aktywności układu opioidowego u tych myszy pozwala określić udział tego układu w procesie progresji guza nowotworowego. Można wykorzystać ten model w badaniach wrażliwości na ból nowotworowy oraz terapii bólu towarzyszącego nowotworom (Sacharczuk i wsp. 2012; Ragan i wsp. 2013), nad opracowaniem nowych leków przeciwbólowych, w szczególności silnych związków opioidowych (Sacharczuk i wsp.2010b) oraz patogenezie chorób nowotworowych i percepcji bólu nowotworowego (Sacharczuk i wsp. 2012; Ragan i wsp.2013)

4.2. Badania nad mechanizmem i terapią uzależnienia od alkoholu Genetycznie uwarunkowana obniżona aktywność układu opioidowego predysponuje do większej konsumpcji alkoholu w warunkach chronicznego stresu, a w konsekwencji powstania uzależnienia (Sacharczuk i wsp.2008) U linii HA alkohol spożywany w znacznie mniejszych ilościach niwelował zachowania depresyjne oraz odczucie bólu spowodowane chronicznym łagodnym stresem. U LA alkohol nie powodował efektu farmakologicznego. Różnice w budowie bariery krew-mózg i jej rozszczelnienie u HA ułatwiający napływ obwodowych opioidów może być czynnikiem zmniejszonego spożycia alkoholu. U myszy LA mających szczelną barierę utrudniony dopływ opioidów powoduje większą konsumpcję alkoholu, szczególnie w warunkach chronicznego stresu (Klinowiecka i wsp. 2007, 2008, 2009, 2010). Myszy obu linii mogą być dobrym modelem w badaniach interakcji miedzy genetycznymi różnicami w układzie opioidowym-stresem- konsumpcją etanolu, a co za tym idzie leczeniem uzależnień. 4.3. Aktywność perystaltyczna przewodu pokarmowego Aktualnie badana jest aktywność układu opioidowego w patogenezie i terapii chorób zapalnych przewodu pokarmowego. U myszy linii HA zaobserwowano wolniejszą perystaltykę jelit uwarunkowaną ośrodkowym komponentem w układzie opioidowym na co wskazuje większy potencjał antyperystaltyczny. Ponadto, u myszy linii HA w jelicie cienkim stwierdzono większą gęstość receptorów opioiodwych mu pełniących główną rolę w regulacji procesu perystaltyki jelit. Także po podaniu prozapalnego TNBS u tej linii zaobserwowano wzrost gęstości receptorów opioidowych delta. Prowadzone są badania nad zróżnicowaniem przepuszczalności bariery krewjelito i jej wpływ na procesy zapalne przewodu pokarmowego.

4.4. Inne badania Selekcjonowane linie różnią się pod względem zachowań depresyjnych i reakcją na działania antydepresantu dezypraminy i dlatego są też dobrym zwierzęcym modelem depresji (Panocka i wsp.2001; Sacharczuk i wsp.2006a). Ze względu na zmiany aktywności układu tłumienia bólu, a w szczególności układu opioidowego mogą być wykorzystane w badaniach farmakologicznych w opracowywaniu nowych leków przeciwbólowych szczególnie silnych środków przeciwbólowych zmniejszających poziom bólu w chorobach nowotworowych (Leśniak i wsp.2010). Myszy linii HA i LA mogą być modelem bólu neuropatycznego w testowaniu nowych leków przeciwbólowych. Patologiczne zmiany w budowie BBB u myszy HA przypominają zmiany towarzyszące wielu chorobom neurodegeneracyjnym na przykład: stwardnieniu rozsianemu czy chorobie Alzheimera.

5. Podsumowanie i wnioski Zagadnienia związane z bólem, przyczynami i mechanizmami jego powstawania oraz jego terapia stanowią ważny problem często spotykany w medycynie. Analgezję, czyli stan zmniejszonego odczuwania bólu można wywołać zarówno środkami farmakologicznymi jak i stresem. W Instytucie Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu od ponad 30 lat prowadzona jest selekcja myszy w kierunku wysokiej (HA) i niskiej (LA) analgezji postresowej. Stresorem jest 3 minutowe pływanie w wodzie o temperaturze 20 C. Latencja reakcji bólowej u myszy HA po pływaniu wynosi ok. 60 sekund, a u LA kilka sekund. Przez 90 pokoleń powtarzana jest metodyka selekcji polegająca na testowaniu oraz hodowli, która pozwoliła uzyskać dwie selekcjonowane linie. Myszy HA i LA różnią się miedzy sobą m.in. poziomem analgezji postresowej, poziomem termoregulacji i metabolizmem, wrażliwością na czynniki genotoksyczne czy reakcją na spożycie alkoholu. Właściwości te mogą być wykorzystane w badaniach biomedycznych polegających na określeniu udziału układu opioidowego w progresji guza nowotworowego, wrażliwości na ból nowotworowy, terapii bólu i opracowaniu nowych leków przeciwbólowych. Obie linie mogą być modelem w badaniach nad mechanizmem i terapią uzależnienia od alkoholu oraz nad udziałem układu opioidowego w patogenezie i leczeniu chorób zapalnych przewodu pokarmowego.

Spis piśmiennictwa 1. Błaszczyk JW, Tajchert K, Lapo I, Sadowski B. 2000. Acoustic startle and openfield behavior in mice bred for magnitude of swim analgesia. Physiol Behav. 70: 471-476 2. Cooper K., Carmody J. 1982. The characteristics of the opioid- reiated analgesia induced by the stress of swimming in the mouse. Neurosci Lett. 31: 165-170 3. Hilgier M. 1999. Historia i leczenie bólu przewlekłego. Nowa Medycyna. 110:2-6 4. Juszczak G. 2007. Rola układu opioidowego w zachowaniach emocjonalnych myszy selekcjonowanych na niską i wysoką analgezję postresową - praca doktorska 5. Kest B, Mogil JS, Sternberg WF, Liebeskind JC, Sadowski B. 1993. Evidence for the up-regulation of kappa opiate mechanisms in mice selectively bred for high analgesia. Proc West Pharmacol Soc. 36:249-53 6. Klinowiecka A., Kosson P., Sacharczuk M, Gajkowska B., Lipkowski A.W. 2007. Blood-brain barrier permeability and analgesic activity of opioid peptide- biphalin given peripherally in mice bred for swim-stress induced analgesia (SSIA). 19th Polish Peptide Symposium 23-27. Pułtusk 7. Klinowiecka A., Kosson P., Sacharczuk M., Gajkowska B., Sadowski B., Lipkowski A.W. 2008. Myszy selekcjonowane pod kątem wysokiej i niskiej analgezji postresowej, jako zwierzęcy model degeneracji bariery krew-mózg. XVI Międzynarodowy Zjazd Polskiego Towarzystwa Anestezjologii i Intensywnej Terapii; Kraków 8. Klinowiecka A., Kosson P., Sacharczuk M., Gajkowska B., Lipkowski A.W. 2008. Blood-brain barrier permeability differentiates two strains mice bred for swim stress-induced analgesia (SSIA). European Opioid Conference European Neuropeptide Club Joint Meeting, Ferrara, Italy 9. Klinowiecka A., Kosson P., Leśniak A., Sacharczuk M., Sadowski B., Lipkowski A.W. 2010. Comparable antinociceptive effect of biphalin in mice selected for high and low swim stress-induced analgesia after blood-brain barrier

disruption caused by hyperosmolar mannitol administration. VII Multidyscyplinarna Konferencja Nauki o Leku, Zakopane, Acta Poloniae Pharmaceutica 10. Kosson A. 2009. Aktywność przeciwbólowa peptydów opioidowych u myszy selekcjonowanych pod kątem analgezji postresowej - praca doktorska IMDiK PAN w Warszawie 11. Leśniak A., Sacharczuk M., Kosson P., Rafałowska J., Gadamski R., Lipkowski A.W. 2010. Assessment of analgesic potency of biphalin in a mouse model of cancer pain. VII Multidyscyplinarna Konferencja Nauki o Leku, Zakopane, Acta Poloniae Pharmaceutica 12. Lutfy K, Sadowski B, Kwon IS, Weber E. 1994. Morphine analgesia and tolerance in mice selectively bred for divergent swim stress-induced analgesia. Eur J Pharmacol. 265:171-4 13. Łapo I.B., Konarzewski M., Sadowski B. 2003a. Analgesia induced by swim stress: interaction between analgesic and thermoregulatory mechanisms. Pflügers Archiv: European journal of physiology 446, 463-469 14. Łapo I.B., Konarzewski M., Sadowski B. 2003b. Differentail metabolic capacity of mice selectively bred for magnitude of swim stress-induced analgesia. Journal of Applied Physiology 94, 677-684 15. Marek P., Vaccarino AL., Sadowski B., Liebeskind JC. 1992 b. A comparison of nociceptive responses using two methods of hot plate measurments: Absolute temperature threshold versus reflex latency. Soc. Neurosci. Abstr. 18: 1026 16. Marek P., Mogil JS., Belknap JK., Sadowski B., Liebeskind JC. 1993. Levorphanol and swim stress-induced analgesia in selectively bred mice: evidence for genetic commonalities. Brain Res. 608:353-7. 17. Mogil JS., Marek P., Flodman P., Spence MA., Sternberg WF., Kest B, Sadowski B, Liebeskind JC. 1995 b. One or two genetic loci mediate high opiate analgesia in selectively bred mice. Pain. 60: 125-35

18. Mogil JS., Sternberg WF, Marek P., Sadowski B., Belknap JK., Liebeskind JC. 1996a. The genetics of pain and pain inhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 93: 3048-55 19. Mogil J.S., Sternberg W.F., Balian H., Liebeskind J.C., Sadowski B. 1996b. Opioid and non-opioid swim stress-induced analgesia: a parametric analysis in mice. Physiology & Behavior 59, 123-132 20. Pacak K., Palkovits, M. 2001. Stressor specificity of central neuroendocrine responses: implications for stress-related disorders. Endocr Rev. 22: 502-548 21. Panocka I., Marek M., Sadowski B. 1986a. Differentiation of neurochemicai basis of stress-induced anaigesia in mice by setective breeding. Brain Res. 397: 156-160 22. Panocka I., Marek P., Sadowski B. 1986b. Inheritance of stress- induced analgesia in mice. Seiective breeding study. Brain Res. 397: 152-155 23. Panocka I., Massi M., Lapo I., Świderski T., Kowalczyk, M., Sadowski, B. 2001. Antidepressant-type effect of the NK3 tachykinin receptor agonist aminosenktide in mouse lines differing in endogenous opioid system activity. Peptides 22, 1037-1042 24. Ragan AR, Leśniak A, Bochyńska-Czyż M, Kosson A., Szymańska H., Pysniak K., Gajewska M., Lipkowski AW, Sacharczuk M. 2013a. Chronic mild stress facilitates melanoma tumor growth in mouse lines selected for high and low stressinduced analgesia. Stress. 16: 571-580 25. Ragan A.R. 2015. Zróżnicowanie progresji inokulowanego czerniaka u linii myszy o wysokiej i niskiej wrażliwości na stres - rozprawa doktorska 26. Sacharczuk M. 2001. Cytogenetyczne i molekularne badania linii myszy selekcjonowanych na wysoką i niską wrażliwość na stres - rozprawa doktorska 27. Sacharczuk M., Jaszczak K., Sadowski B. 2003a. Chromosomal NOR activity in mice selected for high and low swim stress-induced analgesia. Behavior Genetics 33, 435-441 28. Sacharczuk M., Jaszczak K., Sadowski B. 2003b. Cytogenetic comparison of the sensitivity to mutagens in mice selected for high (HA) and low (LA) swim stress induced analgesia. Mutation Research 535, 95-102

29. Sacharczuk M., Sadowski B., Parada R., Świergiel AH., Jaszczak K. 2005. DNA fingerprinting patterns in two lies of mice divergently selected for high and low swim stress-induced analgesia. Animal Science Papers and Reports 23, 129-138 30. Sacharczuk M., Kozłowski A., Tymosiak-Zielińska A., Świergiel A.H. 2006. Studies on the genetic etiology of depressive behavior in laboratory mouse with using genetic markers and genes expression. Barcelona, Annual General Meeting, NEWMOOD 31. Sacharczuk M., Juszczak G., Śliwa A.T., Tymosiak-Zielińska A., Lisowski P., Jaszczak K., Pluta R., Lipkowski A., Sadowski B., Świergiel A.H. 2008. Differences in ethanol drinking between mice selected for high and low swim stressinduced analgesia. Alcohol 42, 487-492. 32. Sacharczuk M., Juszczak G., Świergiel AH., Jaszczak K., Lipkowski AW, Sadowski B. 2009. Alcohol reverses depressive and pronociceptive effects of chronic stress in mice with enhanced activity of the opioid system. Acta Neurobiol Exp (Wars). 69: 459-468. 33. Sacharczuk M. 2010. Rola układu opioidowego w patomechniźmie uzależnień na podstawie badań linii myszy selekcjonowanych na wysoką i niską wrażliwość na stres - rozprawa habilitacyjna, 2010 34. Sacharczuk M., Leśniak A., Korostyński M., Przewlocki R., Lipkowski A., Jaszczak K., Sadowski B. 2010. A polymorphism in exon 2 of the delta-opioid receptor affects nociception in response to specific agonists and antagonists in mice selectively bred for high and low analgesia. Pain 149, 506-513. 35. Sacharczuk M., Ragan AR., Szymańska H., Leśniak A., Sadowski B., Lipkowski AW.. 2012. Distinct susceptibility to inoculated melanoma and sensitivity to cancer pain in mouse lines of high and low sensitivity to stress. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 31: 167-177 36. Sadowski B., Panocka I. 1993. Cross-tolerance between morphine and swim analgesia in mice selectively bred for high and low stress-induced analgesia. Pharmacol Biochem Behav. 45: 527-31

37. Sadowski B. 2006. Biologiczne mechanizmy zachowania się ludzi i zwierząt. PWN 38. Selye H. 1936. A syndrom produced by diverse nocious agents. Nature. 138: 32 39. Steru L., Chermat R., Thierry B., Simon P. 1985. The tail suspension test: a new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology (Berl). 85: 367-370 40. Terman G.W., Lewis J.W., Liebeskind J.C. 1983. Opioid and nonopioid mechanisms of stress analgesia: lack of cross-tolerance between stressors. Brain Res. 260: 147-150, 41. Willner P, Muscat R., Papp M. 1992. Chronic mild stress-induced anhedonia: a realistic animal model of depression. Neurosci Biobehav Rev. 16: 525-534 42. Willner P. 1997. Validity, reliability and utility of the chronic mild stress model of depression: a 10-year review and evaluation. Psychopharmacology 134: 319-329 43. Willner P. 2005. Chronic mild stress (CMS) revisited: consistency and behaviouralneurobiological concordance in the effects of CMS. Neuropsychobiology. 52: 90-110