OZNACZENIE JAKOŚCIOWE I ILOŚCIOWE w HPLC prof. Marian Kamiński Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska
CEL Celem rozdzielania mieszaniny substancji na poszczególne składniki, bądź rozdzielenia tylko wybranych substancji od innych, jest najczęściej ich ilościowe oznaczenie, tj. ustalenie zawartości lub masy w analizowanej próbce. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest wykorzystywana do oznaczenia zawartości składników głównych występujących w próbce na poziomie składników pośrednich od 0.001 do 1% składników śladowych stężeń w zakresie od 1 do 100 %, substancji obecnych w analizowanej próbce poniżej 0.001%
OZNACZANIE JAKOŚCIOWE Analiza jakościowa polega na identyfikacji pików odpowiadających poszczególnym składnikom próbki.
OZNACZANIE JAKOŚCIOWE cd. Zasady i prawidłowości: - wpływ na retencję składu fazy ruchomej - wpływ stosowanych warunków temperatura, ph - ilość składników próbki???? - czystość aparatury i eluentów Kurs HPLC 2007
OZNACZANIE JAKOŚCIOWE cd. Bezpośrednia identyfikacja: UV-VIS UV-DAD FLUORESCENCJA SPEKTROMETR MAS LC-MS Kurs HPLC 2007
Oznaczenie ilościowe w HPLC polega na ustaleniu zależności pomiędzy sygnałem detektora, czyli powierzchnią pod pikiem lub ewentualnie wysokością piku, a stężeniem lub masą składnika, którego zawartość zamierzamy oznaczyć.
WARUNEK OZNACZENIA ILOŚCIOWEGO: 1. rozdzielenie związków do podstawy
2. POWIERZCHNIA CZY WYSKOŚĆ?
WARUNEK OZNACZENIA ILOŚCIOWEGO: 3. Zawsze dokonuje się dla tej samej (wybranej) długości fali
Metody oznaczania ilościowego: z punktu metoda wzorca zewnętrznego (metoda krzywej kalibracyjnej), metoda wzorca wewnętrznego, metoda dodatku wzorca (metoda fortyfikacji) metoda prostej normalizacji lub normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi
Powierzchnia/wysokość piku Metoda tzw. z punktu 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 Stężenie analitu [mg/ml]
Powierzchnia/wysokość piku Z dwóch punktów? 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 Stężenie analitu [mg/ml]
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard Istotą metody wzorca zewnętrznego jest wyznaczenie zależności pomiędzy powierzchnią (wysokością) piku dla każdej z oznaczanych substancji i ich stężeniem lub masą.
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard W tym celu przygotowuje się roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory substancji oznaczanej albo mieszaniny analizowanych substancji w kilku różnych stężeniach....
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard W tym celu przygotowuje się roztwory kalibracyjne, tzn. roztwory substancji oznaczanej albo mieszaniny analizowanych substancji w kilku różnych stężeniach i każdy z przygotowanych roztworów dozowany jest do kolumny chromatograficznej.
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard... Na podstawie powierzchni lub wysokości pików, na uzyskanych chromatogramach wyznacza się przebieg krzywej kalibracyjnej bądź oblicza się wartości współczynników w równaniu kalibracyjnym dla każdej z oznaczanych substancji.
Powierzchnia/wysokość piku 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 y = 10,2x - 0,4 R 2 = 0,9989 powierzchnia piku 0 1 2 3 4 5 Stężenie analitu [mg/ml]
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard Następnie dozowane do kolumny i rozdzielane są próbki, w których oznaczona ma być zawartość wybranych substancji.
Metoda wzorca zewnętrznego metoda krzywej kalibracyjnej external standard 450000 Uzyskane powierzchnie pików substancji oznaczanych w nieznanej próbce umożliwią oznaczenie ich zawartości, tj. stężenia (masy). 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 2.5 5 7.5 10
Powierzchnia/wysokość piku 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 y = 10,2x - 0,4 R 2 = 0,9989 powierzchnia piku 0 1 2 Cx 3 4 5 Stężenie analitu [mg/ml]
Warunki poprawnego stosowania metody wzorca zewnętrznego zarówno roztwory wzorcowe, jak i analizowane próbki muszą być rozdzielane ("chromatografowane") w tych samych warunkach temperatury, objętościowego natężenie przepływu eluentu, typu i wymiarów kolumny chromatograficznej, z reguły tej samej kolumny, składu eluentu oraz takiego samego programu elucji.
Powierzchnia/wysokość piku UWAGA! Ekstrapolacja przebiegu krzywej kalibracyjnej poza powierzchnia 15 piku 10 5 0 zakres wykonanej kalibracji, może być źródłem niedokładnych wyników oznaczeń ze względu na nieliniowy przebieg odpowiedzi detektora! 45 40 35 30 25 20 Cx 0 1 2 3 4 5
Metoda wzorca wewnętrznego internal standard Jest to metoda polegająca na dodaniu do próbki znanej ilości składnika, tzw. wzorca wewnętrznego (IST), który jest jednak inny od substancji oznaczanych i nie może być obecny w analizowanych próbkach przed jego dodaniem. W celu uzyskania krzywej kalibracyjnej do kilku roztworów wzorcowych o różnych stężeniach substancji oznaczanej dodaje się najczęściej stałą i znaną ilość wzorca wewnętrznego. Na podstawie uzyskanych chromatogramów roztworów wzorcowych wykreśla się zależność stężenia analitu w funkcji stosunku powierzchni piku analitu i wzorca wewnętrznego.
Stosunek powierzchni/wysokości piku analitu i wzorca wewnętrznego 45 y = 10,2x - 0,4 40 R 2 = 0,9989 35 30 25 20 15 10 powierzchnia 5 piku 0 Cx 0 1 2 3 4 5 Stężenie analitu [mg/ml]
Wymagania dotyczące wzorca wewnętrznego musi być rozdzielony od innych składników występujących w próbce czas retencji powinien być zbliżony do czasu retencji analitu(ów) nie występuje w próbkach pierwotnych właściwości fizyko-chemiczne są podobne do analitu. Jest to szczególnie istotne na etapie przygotowania próbek (oczyszczania, wzbogacania czy derywatyzacji) powinien być możliwie wysokiej czystości stabilny chemicznie odpowiedź detektora dla wzorca wewnętrznego powinna być zbliżona do odpowiedzi substancji oznaczanych
Metoda wzorca wewnętrznego ma zastosowanie szczególnie w przypadku metod analitycznych wymagających złożonej, wieloetapowej procedury przygotowania próbki (izolacja, wzbogacanie, derywatyzacja itp.), co może powodować straty analitów pozwala również na uniezależnienie otrzymywanych wyników od wahań ilości dozowanej próbki w praktyce metoda ta jest też bardziej pracochłonna niż metoda krzywej kalibracyjnej
WARUNEK OZNACZENIA ILOŚCIOWEGO: rozdzielenie związków do podstawy 450000 A JEŚLI NIE DO PODSTAWY??? 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 2.5 5 7.5 10
Metoda dodatku wzorca standard addition Metoda ta polega na dodaniu do próbki znanych ilości substancji oznaczanych (analitów), zwykle jest to od 50 do 150% oczekiwanej zawartości oznaczanej substancji. Po zanalizowaniu tych roztworów, na podstawie uzyskanych chromatogramów, wykreśla się krzywe kalibracyjne, tj. zależność powierzchni piku analitu w funkcji ilości analitu dodanej do próbki.
Powierzchnia / wysokośc piku 80 70 60 50 y = 120x + 22,5 R 2 = 0,9931 40 30 powierzchnia piku 20 10 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Ilość analitu dodanego do próbki [mg/ml]
Metoda dodatku wzorca c.d. Następnie przeprowadza się graficzną ekstrapolację krzywej kalibracyjne do punkt przecięcia z osią odciętych i odczytuje się wartość c x
Powierzchnia / wysokośc piku 80 70 60 50 y = 120x + 22,5 R 2 = 0,9931 40 30 Cx powierzchnia piku 20 10 0-0,2-0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Ilość analitu dodanego do próbki [mg/ml]
Metoda dodatku wzorca c.d. Innym sposobem określenia zawartości substancji oznaczanej w próbce bez dodatku wzorca jest graficzne wyznaczenie przebiegu nowej linii kalibracyjnej typu f(x)=a 1 x, o tym samym współczynniku nachylenia prostej, co krzywa kalibracyjna.
Powierzchnia / wysokośc piku 80 70 60 50 y = 120x + 22,5 R 2 = 0,9931 40 30 powierzchnia piku 20 10 0-0,2-0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Cx Ilość analitu dodanego do próbki [mg/ml]
Metoda prostej normalizacji Metoda prostej normalizacji nie jest metodą kalibracji. Nie stosuje się w niej odniesienia do znanej ilości wzorca. Metoda ta umożliwia oszacowanie względnych ilości substancji np. zawartości zanieczyszczeń w badanej próbce.
Na podstawie chromatogramu oblicza się sumaryczną powierzchnię pików, którą traktuje się jak 100%... A2 A3 A1+A2+A3+A4 = 100% A1 A4
a następnie oblicza się udział powierzchni określonego piku względem sumy powierzchni wszystkich lub tylko wybranych pików na chromatogramie. 51% 47% 1% 1%
Metoda prostej normalizacji opiera się na założeniu, że współczynniki odpowiedzi dla każdego składnika próbki są takie same, tzn. takie same stężenia różnych substancji odpowiadają takim samym powierzchniom ich pików chromatograficznych. ALE...
Taką charakterystyką cechuje się detektor FID stosowany w chromatografii gazowej do oznaczania węglowodorów. W chromatografii cieczowej metoda uproszczonej normalizacji nie ma zastosowania. Detektory stosowane w HPLC charakteryzują się zróżnicowaną czułością względem substancji.
Korzystne może być stosowanie metody prostej normalizacji, gdy wykorzystywany jest detektor refraktometryczny lub detektor światła rozproszonego. Detektory te wykazują zbliżoną odpowiedź dla różnych substancji o zbliżonej strukturze i masie cząsteczkowej.
Metoda normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi Metoda ta polega na określeniu względnej powierzchni piku substancji badanej względem wybranych bądź wszystkich pików na chromatogramie z uwzględnieniem współczynników korekcyjnych, uwzględniających zróżnicowaną odpowiedź detektora dla różnych składników próbki.
Wyznaczanie współczynników korekcyjnych Na chromatogramie mieszaniny o znanych zawartościach substancji badanych oblicza się pola powierzchni pików, a następnie oblicza się względny udział procentowy poszczególnych substancji metodą prostej normalizacji. W dalszej kolejności oblicza się wartość współczynnika korekcyjnego dla danej substancji korzystając z równania c i (znane) zawartość składnika i w roztworze wzorcowym, R fi c i c i ( znane) ( obliczone ) c i (obliczone) udział składnika i w rozworze wzorcowym obliczony metodą prostej normalizacji
Detekcja w HPLC i TLC Detektor chromatograficzny przepływowy instrument analityczny o znikomej objętości naczyńka pomiarowego; Nie istnieje dotychczas w pełni uniwersalny detektor w LC, stąd stosuje się wiele różnych; Znaczenie bardzo dobrej dynamiki oraz liniowości odpowiedzi detektora we współczesnej HPLC; Techniki wizualizacji w przypadku TLC oraz technika derywatyzacji post-kolumnowej w przypadku HPLC
Detektory: UV (200-400nm)/ UV-VIS (200-800 nm) i szczególne znaczenie detektora typu DAD (diode array detector) RID (refractive index detector) LLSD (laser light scattering detector) FLD (fluorescence detector) El-D (electrochemical detector, typ amperometryczny) CD (coductometric detector - supresja jonów eluentu) LC-MS, LC-MS-MS (mas - spectrometry) inne (FTIR, NMR, LC-FID, radiometryczny, polarymetryczny, pomiaru momentu dipolowego,...)
Nowoczesna detekcja i detektory - UV-DAD, LC-MS, GC-MS - Pojęcie absorpcji światła, prawo absorpcji światła: [- lg(i/io)]= lg(io/i)=abs=k * c * l Widmo, jakie informacje niesie widmo? Chromatogram detektora UV-DAD - kilkadziesiąt chromatogramów jednocześnie Najwygodniejsze - odwzorowanie poziomicowe Wnikliwa analiza przebiegu widma umożliwia identyfikację substancji o charakterystycznym przebiegu widma - jednocześnie - na podstawie retencji i cech widma Problem widmo własne składników eluentu