Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Zakładanie hodowli komórek nowotworowych in vitro 1. Wstęp Linią komórkową nazywamy kulturę dzielących się komórek, które otrzymano w wyniku podziałów jednej lub kilku komórek wyselekcjonowanych z organizmu wielokomórkowego. Poszczególne linie komórkowe róŝnych typów nowotworów ludzkich (i nie tylko) moŝna zakupić w tzw. bankach linii komórkowych, do których naleŝy między innymi Europejska Kolekcja Hodowli Komórkowych (ECACC, ang. The European Collection of Cell Cultures). Powstała ona w 1984 roku i stanowi obecnie jedną z największych kolekcji zwierzęcych linii komórkowych na świecie. Pod względem dostępnych linii komórkowych ECACC ustępuje jednak Amerykańskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych (ATCC, ang. American Type Culture Collection). Zasadniczo rozróŝnia się trzy podstawowe typy wzrostu komórek nowotworowych in vitro: a) wzrost w zawiesinie pojedynczych komórek np. komórki HL-60 (i inne białaczki) (Rys. 1), b) wzrost w postaci monowarstwy - większość nowotworów litych np. komórki HCT8 (Rys. 2), c) wzrost w postaci sferycznych tworów tzw. sferoidów. Rys. 1. HL-60 Rys. 2. HCT8 2. Warunki prowadzenia hodowli komórek in vitro Komórce wyizolowanej z jej tkankowego otoczenia i umieszczonej w hodowli naleŝy zapewnić środowisko, które będzie zastępowało warunki panujące in vivo. Hodowla komórek in vitro wymaga przede wszystkim zachowania sterylnych warunków, środowiska wzrostu o optymalnej temperaturze i wilgotności, jak równieŝ dostarczenia komórkom niezbędnych do Ŝycia oraz proliferacji składników odŝywczych.
Zastosowanie komory z laminarnym przepływem powietrza zapewnia zachowanie sterylnych warunków podczas pracy z komórkami. Powietrze, które wchodzi do komory, przechodzi przez specjalne filtry i w ten sposób zostaje oczyszczone z bakterii oraz zarodników grzybów, co zapobiega większości infekcji. Obecnie mamy trzy typy komór laminarnych: a) z horyzontalnym przepływem powietrza; b) z wertykalnym przepływem powietrza i c) tzw. biohazard, do pracy z materiałem zakaźnym [1]. Środowisko wzrostu o optymalnej temperaturze i wilgotności, jak równieŝ odpowiednie stęŝenie CO 2 zapewniają inkubatory przeznaczone do hodowli komórek. Optymalna temperatura wzrostu zaleŝy od rodzaju linii komórkowej. Większość linii komórkowych wyselekcjonowanych z organizmów stałocieplnych, w tym komórki pochodzenia ludzkiego, wymaga do wzrostu temperatury 37 C. Przekroczenie tej wartości zarówno w kierunku niŝszych, jak i wyŝszych temperatur moŝe mieć mniej lub bardziej niekorzystny wpływ na komórki utrzymywane w hodowli. I tak, o ile komórki ssacze są w stanie przeŝyć kilka dni w temperaturze 4 C, to w temperaturze 39,5 C przeŝyją zaledwie kilka godzin. Optymalna wilgotność środowiska wzrostu w przypadku komórek ludzkich nowotworów powinna być utrzymywana na poziomie 95%, natomiast zachowanie właściwego stęŝenia CO 2 (5 10%) w inkubatorze przeznaczonym do hodowli komórek jest niezwykle istotne dla zapewnienia odpowiedniego ph poŝywki hodowlanej. Większość komórek wymaga ph poŝywki w granicach 7.2 7.4, co pociąga za sobą konieczność zastosowania systemu buforującego. Obecnie najczęściej stosowany jest tzw. system naturalny, gdzie ph utrzymywane jest dzięki równowadze pomiędzy gazowym CO 2 dostarczanym do inkubatora z zewnątrz, a jonami CO 3 2- i HCO 3 - pochodzącymi z soli wodorowęglanowej dodawanej do poŝywki. System ten, w przeciwieństwie do systemów chemicznej regulacji ph, nie wymaga wysokich nakładów finansowych i jest nietoksyczny w stosunku do komórek. Ze względu na fakt, iŝ ph poŝywki jest jednym z krytycznych parametrów, komercyjnie dostępne media hodowlane zawierają w swym składzie równieŝ wskaźniki ph. Jednym z najczęściej stosowanych wskaźników jest czerwień fenolowa, która nadaje poŝywce określoną barwę w zaleŝności od jej ph (barwa: purpurowa ph 7.8; czerwona ph 7.4; pomarańczowa ph 7.0; Ŝółta ph 6.5). PoŜywki hodowlane stosowane dla określonych linii komórkowych róŝnią się miedzy sobą proporcjami poszczególnych komponentów i często wymagają dodatkowego uzupełnienia o specyficzne składniki (np. witaminy lub aminokwasy). Mimo to, ogólny skład poŝywek hodowlanych jest następujący: węglowodany, aminokwasy, peptydy, proteiny, kwasy tłuszczowe, lipidy, sole nieorganiczne, witaminy oraz surowica. Węglowodany stanowią główne źródło energii w mediach hodowlanych. Najczęściej stosowane są glukoza i galaktoza, jednak niektóre rodzaje komórek wykazują lepszy wzrost na poŝywkach zawierających maltozę lub fruktozę. W przypadku standardowych poŝywek uŝywanych do hodowli komórek nowotworowych in vitro, stęŝenie cukru mieści się w granicach od 1 do 4.5 g/l. Aminokwasy, peptydy i białka są wykorzystywane przez komórki jako podstawowy materiał budulcowy. Białka spełniają np. funkcje transportowe lub teŝ słuŝą komórkom jako czynniki wzrostu. Kwasy tłuszczowe i lipidy dostarczane są do poŝywki głównie z surowicą. Cholesterol i steroidy są niekiedy niezbędne do utrzymania wzrostu oraz proliferacji określonych typów komórek hodowanych na podłoŝach bez dodatku surowicy. Sole nieorganiczne jony tych soli pomagają utrzymać odpowiednie ciśnienie osmotyczne, a takŝe biorą udział w regulacji potencjału błonowego komórek dzięki
dostarczaniu kationów potasowych, sodowych i wapniowych oraz stanowią kofaktory enzymów. Sole nieorganiczne są równieŝ niezbędne dla prawidłowego oddziaływania komórek z matrix zewnątrzkomórkową. Do poŝywek hodowlanych dodawane są równieŝ sole tzw. pierwiastków śladowych, takich jak cynk, miedź czy selen, który odgrywa istotna rolę w procesie usuwania wolnych rodników tlenowych. Witaminy są prekursorami bądź kofaktorami enzymów komórkowych. Wiele witamin, szczególnie z grupy B, ma istotne znaczenie dla wzrostu i proliferacji komórek utrzymywanych w hodowli in vitro. Najczęściej dodawane do poŝywek witaminy to: ryboflawina, tiamina i biotyna. Surowica większość poŝywek stosowanych do hodowli komórek nowotworowych wzbogacana jest 5 10% (v/v) dodatkiem bydlęcej surowicy płodowej (FBS), która stanowi złoŝoną mieszaninę wielu mikro- i makrobiocząsteczek. Surowica zawiera czynniki i hormony stymulujące wzrost komórek, czynniki adhezyjne, białka nośnikowe wielu hormonów, sole mineralne, lipidy, białka oraz węglowodany. Neutralizuje ona efekty toksyczne np. metali cięŝkich, a takŝe zapobiega zmianom środowiska, takim jak np. zmiana ph. 3. Liczenie komórek Określanie gęstości komórek utrzymywanych w hodowli in vitro jest niezwykle przydatne podczas pasaŝowania i planowania poszczególnych doświadczeń. Gęstość zawiesiny komórek moŝna ustalić poprzez policzenie pod mikroskopem komórek znajdujących się na siatce w komorze hemocytometru. Hemocytometr ma postać grubego, oszlifowanego szkiełka podstawowego, na którym znajduje się otoczony wyŝłobieniem prostokątny obszar pomiarowy, gdzie naniesiona jest siatka prostopadłych linii (Rys. 3). W hemocytometrach uŝywanych podczas ćwiczenia znajduje się siatka Thoma (Rys. 4), której całkowita powierzchnia wynosi 1 mm 2. Składa się ona z 16 duŝych kwadratów, które rozdzielają linie potrójne. KaŜdy taki kwadrat podzielony jest z kolei na 16 małych kwadratów o boku 1/20 mm. Przecinające się linie potrójne tworzą równieŝ kwadraty o boku 1/20 mm. Po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na hemocytometrze uzyskuje się zamkniętą komorę, której wysokość mierzona od powierzchni siatki do szkiełka nakrywkowego wynosi dokładnie 0.1 mm. Niewielka odległość pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym powoduje, Ŝe zawiesina komórek wypełnia przestrzeń komory, a jej nadmiar spływa do wyŝłobienia. Licząc komórki podczas obserwacji mikroskopowej moŝna określić ich koncentrację, czyli liczbę komórek na jednostkę objętości. Znacznie szybszy i wygodniejszy sposób określania gęstości zawiesiny komórek polega na ich liczeniu za pomocą licznika komórek Coulter Counter. Komórki rosnące w postaci monowarstwy naleŝy przed policzeniem odkleić od powierzchni naczynia hodowlanego np. za pomocą 0.25% roztworu trypsyny.
siatka Thoma szkiełko nakrywkowe dozowanie próbki szkiełko podstawowe Rys. 3. Hemocytometr Rys. 4. Siatka Thoma - schemat 4. Wykonanie ćwiczenia Zadaniem studentów będzie zaszczepienie komórek ludzkiej białaczki MOLT4 na szalki Petriego. Otrzymane od prowadzącego komórki linii MOLT4 naleŝy policzyć zarówno w komorze hemocytometru, jak równieŝ w liczniku komórek Coulter Counter, a następnie rozcieńczyć w poŝywce RPMI 1640 z 10% dodatkiem FBS (bydlęcej surowicy płodowej) do gęstości 250 tys./ml i przenieść do naczynia hodowlanego. Metodyka liczenia komórek w hemocytometrze - obiektyw mikroskopu x 10, - komorę hemocytometru ustawić w taki sposób, aby widoczne było największe pole ograniczone liniami potrójnymi, - liczyć komórki leŝące wewnątrz kwadratów o boku 1/20 mm, a takŝe na dolnych i prawych liniach ograniczających, natomiast nie liczyć komórek znajdujących się na górnych i lewych liniach ograniczających (pozwoli to uniknąć liczenia tych samych komórek po dwa razy). Obliczenie gęstości zawiesiny komórek - obliczyć średnią z trzech zliczeń - gęstość zawiesiny komórek, wyraŝoną w szt./ml, obliczyć z następującego wzoru: c = n / v gdzie: c gęstość zawiesiny komórek, n średnia ze zliczeń, v - objętość komory. 5. Opracowanie wyników Sprawozdanie z wykonania ćwiczenia powinno zawierać: - zwięzły opis jego przebiegu wraz z wyjaśnieniem zasad postępowania, - porównanie morfologii komórek nowotworowych rosnących w postaci monowarstwy i w zawiesinie (prezentowanych przez prowadzącego w czasie trwania zajęć), - porównanie dwóch stosowanych na zajęciach metod liczenia komórek.
6. Literatura 1. Hodowla komórek i tkanek, Stanisława Stokłosa 2. Culture of animal cells. A manual of basic technique ; R. Ian Freshney 3. Cancer cell culture. Methods and protocols ; Simon P. Langdon