Udział receptorów nukleotydowych w regulacji funkcji naczyń krwionośnych

Transkrypt

1 Udział receptorów nukleotydowych w regulacji funkcji naczyń krwionośnych Zofia Magier Robert Jarzyna Zakład Regulacji Metabolizmu, Instytut Biochemii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, Warszawa Zakład Regulacji Metabolizmu, Instytut Biochemii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, ul. Miecznikowa 1, Warszawa; tel.: (22) , rjarzyna@ biol.uw.edu.pl Artykuł otrzymano 15 września 2014 r. Artykuł zaakceptowano 1 października 2014 r. Słowa kluczowe: receptory dla nukleotydów, receptory dla adenozyny, śródbłonek, komórki mięśni gładkich naczyń Wykaz skrótów: CAMKK (ang. calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase) kinaza kinaz zależnych od Ca 2+ i kalmoduliny; CGRP (ang. calcitonin gene-related peptide) peptyd związany z genem kodującym kalcytoninę; EC (ang. endothelial cells) komórki śródbłonka; EDRF (ang. endothelium-derived relaxing factor) czynnik rozluźniający pochodzenia śródbłonkowego; EJPs (ang. excitatory junction potentials) synaptyczne potencjały pobudzające; fmlp N-formyl Met-Leu-Pro; GENC (ang. glomerular endothelial cells) kłębuszkowe komórki śródbłonka; NA nor- -adrenalina; NFAT (ang. nuclear factor of activated T cells) czynnik jądrowy aktywowanych limfocytów T; NO tlenek azotu; NOS syntaza tlenku azotu; ORCC (ang. outwardly rectifying chloride channel) kanał usuwający jony chlorkowe z komórki; PDG peptydoglikan; PDGF (ang. platelet-derived growth factor) płytkopochodny czynnik wzrostu; PE (ang. phenylephrine) fenylefryna; SUR (ang. sulfonylurea receptor) receptor dla pochodnych sulfonylomocznika; Up4A (ang. uridine adenosine tetraphosphate) urydyno adenozyno czterofosforan; VNUT (ang. vesicular nucleotide transporter) pęcherzykowy transporter nukleotydowy; VSMC (ang. vascular smooth muscle cells) komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych; α,β-meatp α,β-metyleno ATP Podziękowania: Autorzy dziękują pani Aleksandrze Wróblewskiej za wykonanie rysunku. STRESZCZENIE Niemal 50 lat temu została opisana funkcja ATP jako cząsteczki sygnałowej. W ciągu tego czasu odkryto receptory, które mogą być aktywowane przez ATP, UTP, ADP, UDP oraz adenozynę. Obecnie badany jest nie tylko mechanizm przekazywnia sygnału od receptorów, ale także bardzo złożona regulacja zmian stężeń nukleotydów na zewnątrz komórki. W naczyniach krwionośnych przesyłanie sygnału purynergicznego wykorzystywane jest przede wszystkim do utrzymania napięcia mięśni gładkich i tym samym utrzymania prawidłowego ciśnienia krwi. ATP uwalniane razem z noradrenaliną z zakończeń nerwów współczulnych powoduje skurcz naczyń i tym samym wzrost ciśnienia, podczas gdy ATP znajdujące się w świetle naczynia stymuluje komórki śródbłonka do produkcji czynników rozluźniających mięśnie naczynia. Nukleotydy i nukleozydy przyczyniają się także do wzrostu i przebudowy naczyń. W chorobach sercowo-naczyniowych, które są plagą naszych czasów, obserwujemy zaburzenia w przesyłaniu sygnału purynergicznego, dlatego receptory dla nukleotydów wydają się być dobrym celem terapii farmakologicznej. WPROWADZENIE W klasycznym ujęciu adenozyno-3-fosforan (ATP) jest głównym wymiennikiem energii w komórce. Podczas utleniania makrocząstek powstałych ze strawionego pokarmu w cyklu kwasu cytrynowego redukowane są nukleotydy NAD + oraz FAD będące donorami elektronów dla łańcucha oddechowego. Następnie elektrony transportowane są przez łańcuch oddechowy w szeregu reakcji redoks na tlen cząsteczkowy, a sprzężony z transportem elektronów transport protonów generuje gradient elektrochemiczny w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej. Wyrównywanie się gradientu jest siłą napędzającą syntezę ATP. Nukleotyd ten jest następnie transportowany do cytozolu, gdzie akumuluje się w stężeniach milimolowych [1]. Prawie 50 lat temu została opisana zupełnie nowa funkcja ATP jako zewnątrzkomórkowej cząsteczki sygnałowej. Dalsze badania wykazały, że ATP może być transportowany z wielu typów komórek i oddziaływać para- i/lub autokrynnie. W 1971 roku Burnstock użył po raz pierwszy określenia purynergiczne w odniesieniu do nerwów autonomicznego układu nerwowego, które do przekazania sygnału używały nie cząsteczek noradrenaliny czy acetylocholiny, ale właśnie nukleotydu purynowego ATP. Od tego czasu zaobserwowano również komunikację między komórkami za pomocą nukleotydów pirymidynowych UTP i UDP, więc mechanizm ten i receptory obecnie nazywa się nukleotydowymi, choć w literaturze wciąż można spotkać określenie purynergiczne. Podczas gdy efekty jakie wywiera zewnątrzkomórkowy ATP na komórkę zostały szeroko opisane, nadal nie do końca znany jest mechanizm zaangażowany w jego transport na zewnątrz różnych typów komórek. Jest to spowodowane między innymi tym, że badanie przesyłania sygnału nukleotydowego jest niezwykle trudne, ponieważ mechanizmy regulujące różnią się nie tylko między poszczególnymi gatunkami, ale nawet między różnymi naczyniami pełniącymi specyficzne role fizjologiczne w jednym osobniku [2]. Częstym zjawiskiem w większości naczyń krwionośnych jest podwójna kontrola napięcia ścian, z jednej strony poprzez ATP wydzielane razem z noradrenalią (NA) przez nerwy układu współczulnego, co prowadzi do skurczu naczyń, z drugiej, poprzez ATP wydzielane przez komórki śródbłonka, np. po zadziałaniu wzmożonej siły ścinającej (ang. shear stress) powodujące rozluźnienie ścian naczyń [2]. Przekazywanie sygnału przez nukleotydy nie ogranicza się jedynie do ścian naczyń krwionośnych, jednak w tym miejscu jest szczególnie ważne. Śródbłonek wyścielający naczynia leży na styku dwóch środowisk i znajduje się w ciągłym kontakcie z różnymi, nieustannie zmieniającymi się czynnikami. W związku z tym, umiejętność szybkiej i precyzyjnej komunikacji między sąsiednimi komór

2 kami jest niezwykle istotna. Zewnątrzkomórkowe stężenie nukleotydów jest kontrolowane przez 17 enzymów degradujących, zgrupowanych w 4 rodziny oraz odbierane przez 19 receptorów z trzech grup: P1 (4 receptory), P2X (7 receptorów) oraz P2Y (8 receptorów). Do tej pory nie zidentyfikowano reakcji zachodzących na zewnątrz komórki, które wymagałyby obecności ATP, więc prawdopodobnie jego rola w tym miejscu ogranicza się do przekazywania sygnału [3]. PODWÓJNA KONTROLA NAPIĘCIA ŚCIAN NACZYŃ KRWIONOŚNYCH PRZEZ NERWY PRZYWSPÓŁCZULNE I KOMÓRKI ŚRÓDBŁONKA Efekty sygnałów generowanych przez ATP zostały zaobserwowane w naczyniach krwionośnych zarówno podczas warunków fizjologicznych jak i patologicznych (m.in. podczas przekrwienia, rozszerzenia naczyń krwionośnych wywołanego niedotlenieniem, skurczu naczyń wywołanych sygnałem od receptora α-adrenergicznego, nadciśnienia, proliferacji mięśni gładkich naczyń w miażdżycy i restenozę po angioplastyce tętnic). Poznanie i zrozumienie mechanizmów regulujących uwalnianie nukleotydów, ich zewnątrzkomórkową degradację oraz ścieżki przekazywania sygnałów jest kluczowe dla zgłębienia wiedzy dotyczącej stanów patofizjologicznych naczyń krwionośnych oraz opracowania nowych bądź ulepszenia już istniejących leków [2]. Przez wiele lat wydawało się, że napięcie naczyniowe jest kontrolowane jedynie przez działające antagonistycznie współczulne nerwy noradrenergiczne zwiększające napięcie ścian naczyń oraz przywspółczulne nerwy cholinergiczne działające rozluźniająco. Jednak po zidentyfikowaniu i opisaniu cząsteczek EDRF (ang. endothelium-derived relaxing factor), śródbłonkowych czynników rozluźniających (mięśnie gładkie naczyń krwionośnych), których głównym składnikiem wydaje się być obecnie tlenek azotu (NO), stało się jasne, że napięcie ścian naczyń krwionośnych znajduje się pod podwójną kontrolą kotransmiterów uwalnianych przez nerwy obwodowe oraz różnych czynników uwalnianych przez komórki śródbłonka [4]. Zanim opisano przesyłanie sygnału purynergicznego, opisane zostały receptory dla puryn: rodzina P1 aktywowana przez adenozynę oraz rodzina P2, dzieląca się dalej na podrodziny P2X oraz P2Y [5], aktywowana ATP i ADP (adenozyno-2-fosforan) [6]. Niemal dekadę później receptory P2 zostały zidentyfikowane na mięśniach gładkich naczyń oraz na komórkach śródbłonka [7], a niedługo później zaobserwowano uwalnianie ATP przez komórki śródbłonka w odpowiedzi na zmiany siły ścinającej generowanej przez przepływającą krew lub hipoksję [8]. REGULACJA NAPIĘCIA ŚCIAN NACZYŃ PRZEZ NERWY OKOŁONACZYNIOWE W wielu naczyniach krwionośnych zarówno mechaniczne jak i elektryczne przekazywanie sygnału po podrażnieniu nerwu okołonaczyniowego jest częściowo niewrażliwe na działanie agonistów receptora α-adrenergicznego. Wyniki wielu badań wskazują na kotransmisję NA i ATP w zakończeniach okołonaczyniowych nerwów układu współczulnego. Doniesienia te jednakże różnią się między sobą proporcjami wydzielanych mediatorów. Wydaje się, że NA i ATP są przechowywane oddzielnie w zakończeniach nerwów współczulnych, ponieważ uwalnianie NA jest kontrolowane przez wapniowe kanały jonowe typu N oraz P/Q, podczas gdy uwalnianie ATP wymaga jedynie aktywnych kanałów typu N [9]. Efekt skurczu mięśni gładkich naczyń krwionośnych powodowany przez ATP uwalniane z zakończeń nerwów współczulnych wydaje się być przekazywany głównie przez receptory P2X 1, choć z różnych badań wynika, że w mięśniach gładkich naczyń produkowane są receptory z rodziny zarówno P2X jak i P2Y. Skupienie uwagi na receptorach P2X wynika z faktu, że udało się zidentyfikować ich bezpośrednią rolę w przekazywaniu sygnału od ATP jako neurotransmitera uwalnianego przez okołonaczyniowe nerwy współczulne, a badania nad tym receptorem stały się o wiele prostsze, kiedy odnaleziono dla niego selektywnych agonistów dostępnych komercyjnie. Ponadto klastry receptorów P2X 1 zostały zidentyfikowane w regionach mięśni gładkich naczyń leżących w sąsiedztwie nerwów współczulnych [10], co odpowiada na pytanie dlaczego na mięśniach gładkich receptory P2X, a nie P2Y są zaangażowane w kotransmisję sygnału od zewnątrzkomórkowego ATP [4]. Aktywacja jonotropowych receptorów P2X prowadzi do szybkiego wpuszczenia do komórki jonów wapnia, co prowadzi do depolaryzacji błony i dalszego napływu jonów wapnia do komórki przez kanały wapniowe aktywowane napięciem. Noradrenalina natomiast działa wolniej, ponieważ sygnał od receptora adrenergicznego jest przekazywany poprzez białka G. Sygnały od ATP i NA mogą działać synergistycznie dając efekt nagłego i długotrwałego skurczu [11]. W ciągu ostatnich 3 lat opisano zjawisko aktywacji receptorów α1-adrenergicznych w mięśniach gładkich naczyń krwionośnych, które prowadziło do otwarcia kanałów paneksyny 1 i uwolnienia ATP, co wywoływało zwiększony skurcz ścian naczyń. Na podstawie tych obserwacji można wysnuć wnioski o regulacji oporu obwodowego i ciśnienia krwi przez współczulny układ nerwowy [12]. Używając techniki obrazowania konfokalnego z wykorzystaniem jonów wapnia w tętnicach krezki szczura wykazano, że ATP uwalniane z zakończeń nerwowych powodowało wczesne rozchodzenie się fal wapniowych przez połączenia szczelinowe, po którym rozwijały się fale wapniowe spowodowane uwolnieniem NA [13]. Nifedypina, inhibitor kanałów wapniowych typu L hamuje działanie sygnału nukleotydowego na skurcz naczyń krwionośnych stymulowany nerwami współczulnymi w tętnicach krezki psa i szczura oraz tętnicach jelita krętego, okrężnicy oraz odpiszczelowej królika. Zjawisko to sugeruje, że aktywacja receptorów P2X w mięśniach gładkich naczyń krwionośnych przez ATP wywołuje napływ jonów wapniowych do komórki poprzez kanały wapniowe typu L zależne od potencjału błony. Niemniej jednak w tętniczkach podśluzówkowych jelita cienkiego świnki morskiej skurcz naczyń krwionośnych, w którym pośredniczy P2X jest niewrażliwy na działanie nifedypiny [4]. Postępy Biochemii 60 (4)

3 ATP jest istotnym składnikiem przekaźnictwa neuronalnego w nerwach współczulnych w tętnicy odpiszczelowej królika [14] oraz tętnicy krezki [15]. Szczególnie w tętniczkach podśluzówkowych jelita cienkiego świnki morskiej i tętnicach jelita czczego królika ATP wydaje się być głównym, jeśli nie jedynym mediatorem skurczu naczyń krwionośnych w odpowiedzi na drażnienie nerwem współczulnym, a współwydzielana NA działa jako modulator presynaptyczny [16]. ATP zostało również opisane jako ważny czynnik w adrenergiczno-purynergicznej kotransmisji sygnału w tętnicach: wątrobowej i jelitowej królika [4]. Depolaryzacja mięśni gładkich wywołana pobudzeniem przez neurotransmitery znana jest jako synaptyczny potencjał pobudzający (EJPs, ang. excitatory junction potentials). Wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe zapisy z tętnicy udowej szczura zostały wykorzystane do zademonstrowania przerywanego uwalniania pojedynczego kwantu ATP odpowiedzialnego za EJP i ukazania podobieństwa do zdarzeń występujących podczas współczulnej kotransmisji w nasieniowodach [17]. W tętnicach ogona szczura EJP są odporne na działanie prazosyny (ang. prazosin, bloker α-adrenergiczny specyficzny dla receptorów α1) [18], ale blokowane przez działanie α,β-metylenu ATP (α,β-meatp, ang. α,β-methylene ATP) [19] oraz agonistę receptorów z rodziny P2, suraminę [20]. Jednak ilość uwalnianego ATP w stosunku do NA przez nerwy współczulne unerwiające to naczynie wydaje się być dużo mniejsza, co sprawia, że zaobserwowanie opornego na prazosynę purynergicznego składnika tego sygnału jest bardzo trudne. Na podstawie tych obserwacji stwierdzono, że NA może być ważniejszym kotransmiterem podczas umiarkowanej aktywności, podczas gdy ATP mogłoby być istotniejsze podczas szybkich skurczy [21]. W tętnicy krezki szczura stymulacja EJP oraz uwalnianie NA może być modulowane w sposób rozdzielny, co potwierdza teorię mówiącą, że ATP i NA są magazynowane w różnych klasach pęcherzyków i mogą być uwalniane w różnych wzajemnych proporcjach, w zależności od typu stymulacji [22]. Podczas ekspozycji na niską temperaturę zmniejsza się przepływ krwi do skóry, co zapobiega zbyt dużej utracie ciepła. U psa jest to osiągane poprzez odruchowe zwiększenie napięcia podskórnych naczyń krwionośnych w odpowiedzi na stymulację nerwami współczulnymi. Zjawisko to jest odporne na działanie antagonistów receptora adrenergicznego, a hamowane jest przez odczulenie receptorów P2X dzięki α,β-meatp. Może to sugerować, że przesyłanie sygnału purynergicznego jest szczególnie ważne w procesie termoregulacji oraz wyjaśniać fakt, czemu kotransmisja purynergiczna jest bardziej widoczna w podskórnych naczyniach krwionośnych w stosunku do tych położonych w wewnętrznych partiach organizmu [4]. NA i ATP wywierają efekt obkurczający na większość naczyń krwionośnych działając poprzez receptory α-adrenergiczne i P2X 1, istnieją jednak badania, których wyniki ukazują rozluźniające działanie tych transmiterów, NA działająca poprzez β-adrenoreceptory oraz ATP działająca poprzez receptory P2Y w tętnicach wieńcowych królika powodują rozluźnienie mięśni gładkich naczyń [23]. Większość naczyń krwionośnych z wyjątkiem tych, które docierają do gruczołów ślinowych i niektórych naczyń krwionośnych w mózgu, nie jest unerwiana przez nerwy przywspółczulne [24]. Wciąż nie opisano funkcji ATP jako kotransmitera w przekazywaniu sygnału w okołonaczyniowych nerwach przywspółczulnych. Wiele naczyń krwionośnych jest unerwianych przez nerwy czuciowo-ruchowe (zarówno przez niezmielinizowane włókna C, jak i zmielinizowane włókna Aδ). Głównym neurotransmiterem w okołonaczyniowych nerwach czuciowo-ruchowych jest peptyd związany z genem kodującym kalcytoninę (CGRP, ang. calcitonin gene-related peptide), który uczestniczy w rozluźnianiu ścian naczyń krwionośnych. ATP wydaje się uczestniczyć w naczyniowym refleksie aksonowym jako kotransmiter nerwów czuciowo-ruchowych [25]. UDZIAŁ KOMÓREK ŚRÓDBŁONKA W REGULACJI NAPIĘCIA ŚCIANY NACZYŃ Komórki śródbłonka z jednej strony eksprymują receptory z rodziny P1 oraz P2 aktywowane przez nukleotydy, z drugiej są ich źródłem (co oznacza, że mogą aktywować się w sposób autokrynny) i dodatkowo na ich powierzchni obecne są ektonukleotydazy, które regulują stężenie nukleotydów w środowisku zewnętrznym komórki. Zasadniczą rolą komórek śródbłonka jest uczestniczenie w rozkurczu ścian naczyń krwionośnych, przez co są naturalnym antagonistą działań ATP i NA uwalnianych przez zakończenia nerwów współczulnych. Poza możliwością autokrynnej aktywacji, receptory P2 znajdujące się na komórkach wyścielających światło naczyń krwionośnych są celem nukleotydów i nukleozydów uwalnianych przez miocyty i komórki krwi po zadziałaniu różnych bodźców, co powoduje rozkurcz naczyń krwionośnych. Dominującą frakcją receptorów są A 2A i A 2B spośród receptorów adenozynowych oraz P2Y 1, P2Y 2 i P2X 4 spośród nukleotydowych [26], przy tym nie można jednak zapomnieć o różnicy w izoformach receptorów pomiędzy różnymi gatunkami, jak i tkankami. Aktywacja komórek śródbłonka przez puryny prowadzi do uwolnienia tlenku azotu i prostacykliny, PGI 2, co prowadzi do zmniejszenia napięcia ścian naczyń oraz zahamowania agregacji płytek krwi. Badania z ostatnich lat ukazują, że poza działaniem rozkurczowym ATP na komórki śródbłonka poprzez wydzielanie NO i prostaglandyn, relaksacja zachodzi również poprzez aktywację kanałów potasowych [27]. Śródbłonek odgrywa bardzo ważną rolę w utrzymaniu homeostazy naczyń krwionośnych, uszkodzenie lub zaburzenie jego funkcji może doprowadzić do aktywacji płytek krwi, akumulacji leukocytów w miejscu urazu, a aktywowane leukocyty i trombocyty mogą wydzielać ATP, ADP oraz UDP. W warunkach fizjologicznych nukleotydy te promują rozkurcz naczyń krwionośnych, jednak w momencie przerwania ciągłości tkanki czynniki te mogą dotrzeć do mięśni gładkich otaczających naczynia krwionośne i działać na nie poprzez receptory z rodziny P2Y powodując skurcz. Z pierwotnych hodowli komórek śródbłonka uzyskanych zarówno od zwierząt jak i człowieka ATP jest uwalniane w wyniku zmiany przepływu pożywki, a co za tym idzie wartości siły ścinającej [8] oraz zmiany osmotycznej środowiska [28]. Najważniejszą znaną funkcją ATP uwalnianego przez 458

4 komórki śródbłonka w odpowiedzi na zwiększoną siłę ścinającą jest przyłączanie się do receptorów z rodziny P2 i przekazanie sygnału lokalnego lub rozprzestrzeniającego się, powodującego skurcz naczyń krwionośnych. Istnieje sposób wyrzutu ATP z komórek śródbłonka zależny od stymulacji przez ATP [29], co zapewnia skoordynowaną odpowiedź komórek wyścielających światło naczyń krwionośnych. ATP uwolnione z komórek śródbłonka szczura po ekspozycji na zwiększoną siłę ścinającą powoduje wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca 2+, a następnie rozejście się fali wapniowej. Rozchodzenie się fali wapniowej było zablokowane przez suraminę oraz apyrazę, które rozkładają zewnątrzkomórkowe ATP, co sugeruje, że ATP uwalniane z komórek śródbłonka jest przekaźnikiem w tym zjawisku [30]. Mechanizmy uwalniania ATP z komórki nie są w pełni poznane. Istnieją dowody mówiące, że ATP jest uwalniane z komórek śródbłonka po zadziałaniu zwiększonej siły ścinającej na drodze egzocytozy [8]. Późniejsze badania udowodniły, że koneksyny oraz paneksyna 1 również mogą być zaangażowane w ten proces [2]. Wyciszenie genu dla kaweoliny-1 (ang. caveolin-1) zahamowało wyrzut ATP przez komórki śródbłonka, a uwalniane ATP rozpoczynało fale wapniowe w kaweolach [31]. Adenozyno-5 -czteroforsforan jest silnym czynnikiem pochodzenia śródbłonkowego wywołującym skurcz małych naczyń krwionośnych, u człowieka działając głównie poprzez aktywację receptorów P2X 1 na mięśniach gładkich [32]. Urydyno adenozyno czterofosforan (Up4A, ang. uridine adenosine tetraphosphate) również został zidentyfikowany jako czynnik obkurczający naczynia krwionośne pochodzenia śródbłonkowego (EDCF, ang. endothelium-derived vasoconstricting factor) w hodowli komórek śródbłonka skórnych małych naczyń krwionośnych człowieka [33] oraz z tętnicy płucnej szczura [34]. REGULACJA ZEWNĄTRZKOMÓRKOWEGO STĘŻENIA NUKLEOTYDÓW I NUKLEOZYDÓW Na siłę sygnału przekazywanego od nukleotydów ma wpływ rodzaj i zagęszczenie receptorów odbierających sygnał oraz stężenie nukleotydów i nukleozydów w środowisku zewnętrznym komórki. Mogą się one pojawić w osoczu w następstwie uszkodzenia lub śmierci komórek albo w wyniku procesów fizjologicznych. Di- i trifosforany nukleozydów mogą być uwalniane z komórek w różnych procesach, np. egzocytozy pęcherzykowej, aktywnego transportu poprzez semikanały koneksynowe lub kanały paneksynowe, transportery ABC, dodatkowo ATP może być syntetyzowany na zewnątrz komórki poprzez F 0 F 1 ATPazę. Na zewnątrzkomórkowe stężenie nukleotydów oraz nukleozydów ma również wpływ aktywność enzymów, ektonukleotydaz, do których należą NTPDazy, kinaza difosfonukleozydowa, kinaza adenylanowa oraz 5 -nukleotydaza (CD73) (Ryc. 1) [4]. MECHANIZMY UWALNIANIA ATP Z KOMÓRKI Egzocytoza pęcherzykowa Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych są poddane ciągłym zmianom przepływu krwi i siły ścinającej. Zjawisko uwalniania czynników modulujących napięcie ścian naczyń krwionośnych (m.in. ATP) zostało szeroko opisane w literaturze, nie został jednak jeszcze poznany mechanizm za to odpowiedzialny. Postulowanym mechanizmem jest egzocytoza pęcherzykowa. Aby udowodnić tę hipotezę wykonano doświadczenie, w którym wyznakowano wewnątrzkomórkowe ATP w komórkach HUVEC quinakryną, która ma wysokie powinowactwo do ATP. Z obserwacji wynikło, że komórki barwią się w sposób zgodny z obecnością wewnątrzkomórkowych pęcherzyków egzocytarnych [8]. Co więcej wstępna inkubacja komórek HUVEC z monenzyną, inhibitorem formowania się pęcherzyków z aparatu Golgiego powodowała znaczące obniżenie fluorescencji quinakryny w stosunku do komórek kontrolnych zgodne z lokalizacją ATP w wewnątrzkomórkowych pęcherzykach. Stymulacja siłą ścinającą od 10 do 25 dynów (1 dyn jest to siła nadająca ciału o masie 1 grama przyspieszenie równe 1cm/s) komórek z wyznakowanym ATP prowadziła do nagłego zmniejszenia fluorescencji quinakryny i zwiększonego stężenia ATP w środowisku zewnętrznym komórki, co sugerowałoby uwolnienie ATP metodą egzocytozy pęcherzykowej. W porównaniu, komórki niestymulowane wykazywały niewielkie stężenia ATP w medium zewnątrzkomórkowym. Dodatkowo, monenzyna znosiła uwalnianie ATP ze stymulowanych siłą ścinającą komórek śródbłonka. Dane te sugerują, że podczas nasilenia przepływu krwi ATP jest uwalniane do środowiska zewnętrznego na drodze egzocytozy pęcherzykowej. Dowody wykazują, że ATP może być uwalniane na drodze egzocytozy w różnych tkankach, jednak wciąż pozostaje pytanie, w jaki sposób nukleotyd dostaje się do pęcherzyka? W ostatnich latach doszło do odkrycia pęcherzykowego transportera nukleotydowego (VNUT, ang. vesicular nucleotide transporter) w wielu komórkach wydzielniczych [35]. Transporter ten lokalizuje się w błonie wewnątrzkomórkowych pęcherzyków i aktywnie pompuje ATP do ich wnętrza używając gradientu protonów utrzymywanego przez wakuolarną ATPazę [35]. Wciąż jednak pozostaje niewiadome, czy transporter ten eksprymowany jest w okołonaczyniowych neuronach współczulnych i komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych. Transportery ABC Transportery ABC należą do klasy integralnych białek błonowych, które zużywają energię pozyskaną z ATP do transportu dużych cząsteczek w poprzek błony. Białka należące do grupy transporterów ABC mają dwie zachowane w ewolucji domeny wewnątrzkomórkowe, które wiążą i hydrolizują ATP. Trzy z tych białek: błonowy regulator przewodnictwa (CFTR, ang. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), glikoproteina P oraz receptor dla pochodnych sulfonylomocznika (SUR, ang. sulfonylurea receptor) zostały zidentyfikowane jako białka nie tylko korzystające z ATP jako energii dla aktywnego transportu, ale również transportery nukleotydów purynowych działających następnie auto- lub parakrynnie. W dobie poszukiwania kanałów lub transporterów odpowiedzialnych za uwalnianie ATP z komórki, transportery ABC wydają się być dobrym Postępy Biochemii 60 (4)

5 Rycina 1. Schemat uwalniania, metabolizmu i odbierania sygnału przez receptory dla nukleotydów w ścianie naczyń krwionośnych. Zewnątrzkomórkowe stężenia nukleotydów i nukleozydów są wynikiem równowagi pomiędzy ich uwalnianiem przez komórki oraz syntezą na zewnątrz komórki, a trawieniem przez ektonukleotydazy. Nukleotydy mogą być uwalniane poprzez semikanały koneksynowe, kanały paneksynowe, transportery ABC, na drodze egzocytozy pęcherzykowej, a samo ATP może być również syntetyzowane w środowisku zewnątrzkomórkowym dzięki F 0 F 1 ATPazie. Nukleotydazy obecne w ścianie naczyń krwionośnych to ektonukleozydo-3-fosfo dihydrofosforhydrolaza 1 i 2 (1 NTPDaza1 i 2), które hydrolizują ATP, UTP oraz UDP, ekto-5 -nukleotydaza, która dalej hydrolizuje powstałe AMP do adenozyny oraz ekto-nukleotydo-pyrofosfataza (ekto-nukleotydo fosfodiesteraza NPP1), która również hydrolizuje ATP, UTP i ADP. ATP uwalniane jako kotransmiter przez zakończenia nerwów współczulnych i czuciowo-ruchowych powoduje proliferację mięśni gładkich ścian naczyń poprzez oddziaływania na receptory P2Y 2 oraz P2Y 4 i aktywację kaskady kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), natomiast adenozyna powstająca po rozkładzie ATP oddziałuje na receptory z rodziny P1 i hamuje proliferację mięśni gładkich poprzez wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia camp lub może być również transportowana z powrotem do komórki, gdzie zostaje zużyta jako substrat do produkcji ATP lub, w komórkach śródbłonka, może wpływać na aktywację AMPK. ATP i UTP uwalniane z komórek śródbłonka stymulują proliferację zarówno komórek śródbłonka jak i mięśni gładkich poprzez oddziaływanie na receptory P2Y 1,2,4. Adenozyna stymuluje proliferację komórek śródbłonka, co wywołuje uwolnienie płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF) z płytek krwi. CGRP peptyd związany z genem kodującym kalcytoninę, AMPK kinaza białkowa aktywowana przez AMP. kandydatem, jednak nie wiadomo, czy białka te same transportują nukleotydy, czy może regulują aktywność innych kanałów lub transporterów [2]. CFTR jest białkiem zaangażowanym w utrzymywanie homeostazy jonów chloru w komórce. Wydaje się, że aktywacja CFTR przez białkowa kinazę A zależną od camp 460

6 (PKA) reguluje aktywność kanału usuwającego jony chlorkowe z komórki (ORCC, ang. outwardly rectifying chloride channel). Badania nad tym mechanizmem w komórkach śródbłonka ukazały, że aktywacja CFTR zależna od camp powoduje uwolnienie ATP, które następnie wiąże się i aktywuje receptory z rodziny P2 w sposób auto- lub parakrynny i stymuluje wypływ jonów chlorkowych z komórki poprzez aktywację ORCC. Badania na komórkach transfekowanych CFTR potwierdziły te przypuszczenia, wydzielanie ATP było zależne od camp oraz aktywacji PKA, które były nieobecne w komórkach niemających transporterów ABC. Podobne badania zostały wykonane w komórkach eksprymujących glikoproteinę P, co potwierdza słuszność hipotezy, że transportery ABC odgrywają kluczową rolę w uwalnianiu ATP na zewnątrz komórki [2]. Badania nad uwalnianiem ATP z komórek z udziałem białka CFTR są szczególnie ważne w poznaniu fizjologii komórek śródbłonka, jednak transporter ten został zidentyfikowany również na wielu innych typach komórek [37]: mięśni gładkich naczyń [38], krążących erytrocytów [39] i na płytkach krwi [40], co sprawia, że są to potencjalne źródła ATP w środowisku zewnętrznym komórek. Erytrocyty pacjentów cierpiących na mukowiscydozę, mających mutację w genie CFTR wykazują znacznie obniżone uwalnianie ATP w odpowiedzi na deformację błony komórkowej, co jest dobrze poznanym bodźcem pobudzającym uwalnianie ATP z tych komórek. Co więcej, inkubacja krwinek czerwonych od zdrowych pacjentów z pochodną sulfonylomocznika, która hamuje aktywność transporterów ABC oraz kanałów potasowych wrażliwych na ATP (K ATP ) lub z kwasem niflumikowym, inhibitorem cyklooksygenazy-2, który również został opisany jako hamujący aktywność CFTR, powodowała znaczny spadek uwalniania ATP po deformacji błony komórkowej [39]. Wyniki te jednak trzeba interpretować w szerszej perspektywie, ponieważ może na nie wpływać wiele niespecyficznych interakcji farmakologicznych innych niż z badanym białkiem. Tym niemniej na udział CFTR w uwalnianiu ATP z erytrocytów wskazują również wyniki innych badań, gdzie ciągła aktywacja PKA osiągnięta poprzez inkubację komórek z aktywnym S-stereoizomerem camp powoduje wzmożone uwalnianie ATP podczas gdy inkubacja z nieaktywnym R-stereoizomerem nie [41]. SUR formuje kompleksy funkcjonalne z kanałami K ATP [42], a nagromadzenie wewnątrzkomórkowego ATP powoduje depolaryzację błony komórkowej poprzez bezpośrednie hamowanie wypływu potasu poprzez konstytutywnie aktywny kanał potasowy, K ATP. Pochodna sulfonylomocznika, glibenklamid, hamuje napływ potasu indukowany kanałami K ATP. Postuluje się, że SUR działa bezpośrednio na hamowanie wypływu ATP z komórki, przez co zwiększa się jego wewnątrzkomórkowe stężenie. I rzeczywiście, aktywacja kanałów K ATP przez diazoksyd (ang. diazoxide), pochodną sulfonylomocznika aktywującą kanały K ATP w komórkach β trzustki jest niezależna od obecności ATP [43]. W naczyniach krwionośnych płuc szczura uwolnienie ATP wywołane zmianami w przepływie krwi jest zniesione po perfuzji (ang. luminal perfusion) glibenklamidem [44]. Zjawisko to może być spowodowane poprzez hamowanie uwalniania ATP przez SUR lub CFTR w komórkach śródbłonka. Zahamowanie uwalniania ATP z któregokolwiek z tych transporterów (lub obu) może powodować zmniejszoną siłę sygnału auto- lub parakrynnego wywieranego na receptory P2Y w komórkach śródbłonka, co wyjaśniałoby zmniejszone rozszerzenie ścian naczyń krwionośnych. Uwalnianie ATP z komórek przez kanały CFTR nie zostało bezpośrednio zaobserwowane w komórkach śródbłonka naczyniowego, chociaż została opisana ich synteza i aktywność [37]. Podczas gdy powyższe badania sugerują ważną rolę transporterów ABC w uwalnianiu ATP z komórek, to jednak ukazały się również prace przeczące temu zjawisku. Zostało udowodnione, iż CTFR rekonstytuowane w dwuwarstwie lipidowej nie przenosiło ATP, a w stabilnie trasfekowanych komórkach ssaków jak również w komórkach z płuca człowieka z endogennym białkiem, CFTR nie brało udziału w uwalnianiu ATP [45]. Prace te osłabiły teorię mówiącą, że transportery ABC biorą udział w transporcie ATP z komórek. Jednak pojawiło się kolejne badanie, w którym autorzy sugerują zaangażowanie kanałów CFTR w uwalnianiu ATP indukowanym kwasicą mleczanową. Badanie to sugeruje rolę CFTR oraz innych transporterów ABC w uwalnianiu ATP [46]. F 1 F 0 -ATPaza W procesie fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach powstaje elektrochemiczny gradient protonowy w poprzek wewnętrznej błony organellum, jest on wykorzystywany przez F 1 F 0 syntazę ATP (nazywaną również syntazą ATP), która produkuje ATP w matriks mitochondrialnym. Enzym ten składa się z podjednostki F 0 związanej z błoną, która utrzymuje całą cząsteczkę zaczepioną w wewnętrznej błonie mitochondrialnej oraz katalitycznej podjednostki F 1, która w matriks mitochondrialnym katalizuje powstawanie ATP z ADP i nieorganicznego fosforu [47]. Początkowo sądzono, że enzym ten lokalizuje się w formie aktywnej jedynie w mitochondrium, jednak okazało się, że zidentyfikowano go również w błonie komórkowej komórek różnych typów, m.in. śródbłonka naczyń krwionośnych [47]. Angiostatyna, produkt cięcia plazminogenu wykazuje wysokie powinowactwo do wiązania podjednostek α i β podjednostki F 1 ATP syntazy w komórkach HUVEC i została opisana jako skuteczny inhibitor angiogenezy i rozwoju nowotworu [47]. Antyangiogenne właściwości angiostatyny są przypisywane hamowaniu uwalniania ATP, ponieważ zewnątrzkomórkowy ATP jest uważany za czynnik proangiogenny dla komórek śródbłonka [50]. Wiązanie angiostatyny do podjednostki F 1 syntazy ATP w komórkach śródbłonka hamuje jej aktywność, a przez to produkcję zewnątrzkomórkowego ATP [49]. W naczyniach krwionośnych podczas zwiększonego przepływu krwi, który generuje zwiększoną siłę ścinającą zostaje uwolnione ATP, które powoduje rozluźnianie ścian naczyń krwionośnych. W hodowli komórek śródbłonka z ludzkiej tętnicy płucnej narażonych na zwiększony przepływ płynu efekt ten mógł być zahamowany poprzez dodanie do pożywki angiostatyny lub bezpośredniego agonisty podjednostki F 1 [50]. Na podstawie tej pracy można wyciągnąć wnioski o mechanizmach uwalniania ATP z komórek śródbłonka pod wpływem sił hemodynamicznych. Syntaza ATP do produkcji ATP wymaga gradientu protonowego, dlatego jego aktywacja pod wpływem zmiany przepływu krwi przez naczynie krwionośne pozostaje do wyjaśnie- Postępy Biochemii 60 (4)

7 nia. Osiągnięcie gradientu protonowego w poprzek błony komórkowej mogłoby spowodować miejscowe zakwaszenie cytoplazmy, co mogłoby wpłynąć na aktywność białek znajdujących się w tym obszarze, co więcej syntaza ATP produkuje nukleotyd z ADP oraz fosforu nieorganicznego, co oznacza, że substraty te muszą się znajdować w świetle naczynia krwionośnego w odpowiednim stężeniu, aby zapewnić odpowiednią aktywność enzymu. Aktywność ektonukleotydaz może zapewniać dostępność tych substratów. Nietypowa produkcja syntazy ATP w błonie komórkowej śródbłonka naczyń krwionośnych może sugerować, że białko to jest zaangażowane w przekazywanie sygnału od zewnątrzkomórkowych nukleotydów. Niezbędne są kolejne badania do odkrycia mechanizmu i stopnia zaangażowania syntazy ATP w uwalnianiu ATP w środowisku zewnątrzkomórkowym. Koneksyny Koneksyny (Cx, ang. connexins) są białkami występującymi u kręgowców, formującymi heksameryczne oligomery (nazywane koneksonami) w siateczce endoplazmatycznej lub aparacie Golgiego, które następnie transportowane są do błony komórkowej, z którą się integrują [52]. Konekson z jednej komórki znajdujący się w niewielkiej odległości od koneksona z komórki sąsiedniej może utworzyć niekowalencyjne połączenie pomiędzy ich zewnątrzkomórkowymi pętlami tworząc międzykomórkowe połączenie szczelinowe łączące cytosol dwóch komórek. Połączenia szczelinowe zapewniają komunikację między dwiema komórkami, transport cząsteczek sygnalizacyjnych i wtórnych przekaźników nie większych niż 1 kda oraz ułatwiają przekazywanie fal depolaryzacji błony. Do dziś opisano około 20 izoform koneksyn ssaków, a ich komunikacja przez połączenia szczelinowe, została szeroko zbadana i opisana. Pojawiły się jednak również doniesienia o niezadokowanych semikanałach koneksynowych na powierzchni wielu różnych typów komórek, np. astrocytów i komórek glejowych w centralnym układzie nerwowym [53], krążących polimorfojądrowych granulocytów [54] i monocytów [55], komórek śródbłonka naczyń krwionośnych [56] i komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych [57]. Sugeruje się, że te semikały mogą funkcjonować jako kanały do transportu cząsteczek, m.in. ATP, pomiędzy cytosolem komórki a jej środowiskiem zewnętrznym [58]. Podczas fizjologicznego stanu spoczynkowego, semikały koneksyn pozostają zamknięte, jednak pod wpływem bodźca, jak np. spadek stężenia zewnątrzkomórkowych jonów wapnia [59], silnej depolaryzacji błony komórkowej [60], stymulacji mechanicznej [61], czy metabolicznego modelu ischemii [62] są w stanie doprowadzić do otwarcia tych kanałów. Również inne badania [53] sugerują rolę semikałów koneksyn w uwalnianiu ATP z wielu typów komórek. Do dziś opisano 4 izoformy koneksyn licznie występujące na komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz komórkach śródbłonka: Cx37, Cx40, Cx43 i Cx45 [63]. Połączenia szczelinowe formowane przez te izoformy odgrywają ważną rolę w regulacji komunikacji pomiędzy komórkami mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC, ang. vascular smooth muscle cells) a komórkami śródbłonka (EC, ang. endothelial cells), jak również pomiędzy dwiema komórkami na połączeniach mioendotelialnych [64]. W szczególności ważne są połączenia szczelinowe zbudowane z Cx40 w śródbłonku ze względu na rolę w przekazywaniu fali wapniowej w rozluźnianiu ścian naczyń krwionośnych [65]. Na poziomie połączeń mioendotelialnych miejsca, gdzie komórki mięśni gładkich i śródbłonka kontaktują się ze sobą poprzez zewnętrzną, elastyczną blaszkę Cx40 i Cx43 formują połączenia szczelinowe, które umożliwiają transport drugorzędowych cząsteczek sygnałowych i jonów między tymi dwoma komórkami, aby kontrolować odpowiedzi naczynioruchowe [66]. Ponieważ komórki naczyń krwionośnych silnie eksprymują koneksyny, istnieje możliwość, że obecna jest pewna populacja niezadokowanych semikałów koneksyn, która mogłaby zapewnić drogę dla uwalniania ATP do światła naczyń lub niszy komórek tworzących naczynie krwionośne. Przesuwanie fali wapniowej w konfluentnych monowarstwach komórek śródbłonka z rogówki bydła pojawia się w odpowiedzi na mechaniczną stymulację [61]. W badaniach tych, dodanie blokera połączeń szczelinowych i peptydu imitującego koneksynę, Gap26, znacząco obniżało posuwanie się fali wapniowej. Pobieranie barwnika nie zostało zmienione, co sugeruje, że uwalnianie parakrynnie działającej cząsteczki sygnałowej z koneksyn wywołuje odpowiedź wapniową w komórce przylegającej, a nie bezpośredni transport wapnia z jednej komórki do drugiej. Dalsze badanie ujawniło uwalnianie ATP z tych komórek po stymulacji mechanicznej oraz zwiększoną propagację fali wapniowej w obecności inhibitora CD39 ARL Wyniki tych badań sugerują rolę różnych frakcji semikałów koneksyn na błonie komórkowej niezaangażowanej w tworzenie połączeń szczelinowych w komórkach śródbłonka siatkówki, które są w stanie uwalniać ATP, aby promować falę wapniową przez przekazywanie sygnału parakrynnego podczas stresu mechanicznego. W naczyniach aparatu przykłębuszkowego nerek kłębuszkowe komórki śródbłonka (GENCs, ang. glomerular endothelial cells) biorą udział w przekazywaniu fal wapniowych w celu regulowania nerkowego przepływu krwi i filtracji kłębuszkowej poprzez uwalnianie ATP i mechanizmy przekazywania sygnału nukleotydowego [67]. Mechaniczna stymulacja komórek GENC rosnących w hodowli spowodowała zapoczątkowanie fal wapniowych, które zahamowało dodanie rozprzęgacza połączeń szczelinowych oraz wyciszenie Cx40 przez sirna w tych komórkach. Cx40 jest produkowane w komórkach GENC wytwarzając między nimi połączenia szczelinowe. Aby zaobserwować stopień, w jakim uwalniane jest ATP i przekazywany sygnał od nukleotydu powodujący falę wapniową dodano mieszaniny wychwytującej ATP składającej się z heksokinazy, enzymu glikolitycznego, który zużywa duże ilości ATP oraz apyrazy, która degraduje zewnątrzkomórkowe ATP. Podczas stymulacji mechanicznej w obecności tej mieszaniny, przekazywanie fali wapniowej do komórek sąsiadujących było zahamowane bez znaczącej zmiany w przekazywaniu barwnika między komórkami, co sugeruje rolę zewnątrzkomórkowego ATP w przekazywaniu fali wapniowej. Autorzy tej pracy użyli biosensora ATP do zmierzenia poziomu uwalnianego nukleotydu z komórek GENC. Badanie polegało na podaniu indykatora wapnia (Fluo-4) do komórek PC12 eksprymujących wiele różnych receptorów nukleotydowych i dodaniu ich do konfluentnej jednowarstwowej 462

8 hodowli GENC. W odpowiedzi na mechaniczną stymulację komórki GENC uwalniały ATP, które wiązało się z receptorami na komórkach PC12 powodując wzrost stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia, które było wykrywane przez pomiar fluorescencji Fluo-4, co umożliwiło bezpośredni pomiar uwolnionego ATP z komórek śródbłonka. Odpowiedź ta była obniżona przez hamowanie aktywności receptorów nukleotydowych na komórkach PC12 nieselektywnym inhibitorem receptorów P2, suraminą, co zweryfikowało specyficzność biosensora do zewnątrzkomórkowego ATP. Uwolnienie ATP pod wpływem stymulacji mechanicznej było zahamowane poprzez wyciszenie genu Cx40 poprzez sirna i mogło być przywrócone poprzez dodanie egzogennego ATP [68]. Podsumowując, badania te sugerują, że komórki śródbłonka eksprymują na swojej powierzchni niezadokowane semikanały koneksynowe, które są zdolne do uwalniania ATP w odpowiedzi na stymulację mechaniczną. Wydaje się, że niedotlenienie zwiększa uwalnianie ATP z komórek śródbłonka wywołane zmienionym przepływem [69], ale również pojawiła się hipoteza, że niedotlenienie hamuje uwalnianie ATP z komórek poprzez semikanały Cx43 w śródbłonku [56]. Autorzy tej ostatniej pracy wywnioskowali, że niedotlenienie zmniejsza uwalnianie ATP z hodowli komórek śródbłonka poprzez zmniejszone występowanie Cx43 w błonie plazmatycznej, obniżony poziom mrna tego białka oraz podwyższoną fosforylację Cx43 na Ser368 [70], która hamuje aktywność kanału. Obserwacje te sugerują, że semikanały koneksyn mogą być zaangażowane w uwalnianie ATP w niektórych sytuacjach, jednak raczej nie biorą udziału w uwalnianiu tego nukleotydu pod wpływem niedotlenienia z komórek śródbłonka. Kanały te mogą odgrywać istotną rolę podczas różnych stanów patologicznych, np. ostrych infekcji, stanów zapalnych i miażdżycy. Komórki śródbłonka wystawione na działanie składnika ścian komórkowych bakterii gram-dodatnich, peptydoglikanu (PDG) uwalniały ATP poprze kanały Cx43 [71]. Badanie to ujawniło wzrost stężenia mrna Cx43, jak również indukcję cytokiny prozapalnej IL6 i receptora TLR2 w komórkach śródbłonka w odpowiedzi na PDG. Indukcja prozapalnej kaskady zdarzeń spowodowała zwiększenie aktywności semikanału Cx43 w błonie komórkowej, co doprowadziło do uwolnienia ATP do medium hodowlanego. Podczas miażdżycy krążące monocyty przylegają do i migrują w poprzek śródbłonka naczyniowego, gdzie różnicują w makrofagi i komórki piankowe, co ostatecznie prowadzi do rozwoju płytki miażdżycowej i zwężenia światła naczynia [72]. Badanie przeprowadzone przez Wong i współpracowników [55] sugeruje, że ATP uwalniane z krążących monocytów poprzez kanały Cx37 ma ochronny wpływ na naczynia podczas miażdżycy. Kompletne wyciszenie Cx37 u myszy ApoE 2/2 ze skłonnością do rozwoju miażdżycy spowodowało znaczny wzrost w formowaniu patologicznych zmian podczas miażdżycy. Dalsze badania wykazały, że myszy Cx37 2/2 /ApoE 2/2 miały znacząco niższe podstawowe poziomy uwalnianego ATP w porównaniu do myszy z funkcjonalnym Cx37. Spadek uwalnianego ATP przez krążące monocyty pozbawione Cx37 spowodował znaczny wzrost w adhezji monocytów do hodowanych komórek śródbłonka, co wspiera dowody uzyskane in vivo wzrostu formowania płytki miażdżycowej i jej rozmiaru. Adhezja monocytów była również zwiększona po dodaniu blokerów semikanału koneksynowego i koneksynowego peptydu mimetycznego. W innym badaniu aktywacja neutrofili przez fmlp (N-formyl Met-Leu-Pro) indukowała uwalnianie ATP, co skutkowało zmniejszoną przepuszczalnością komórek śródbłonka [54]. Uwalnianie ATP z tych komórek było znacznie obniżone po dodaniu specyficznego dla Cx43 peptydu mimetycznego Gap26 [73], jak również u neutrofili Cx43 2/2, co sugeruje, że uwalnianie nukleotydu jest w pewien sposób zależne od kanałów Cx43. Uwalniany ATP był aktywnie degradowany do adenozyny dzięki aktywności CD39 eksprymowanej na powierzchni neutrofili i CD37 eksprymowanej na komórkach śródbłonka. Wiązanie adenozyny do receptorów z A 2A na komórkach śródbłonka powodowało spadek przepuszczalności śródbłonka [74]. Podczas gdy dane zaprezentowane powyżej sugerują rolę uwalniania ATP przez semikanały Cx w krążących komórkach zapalnych w ochronnym mechanizmie przeciwko rozszczelnianiu ściany naczynia, wiele przykładów z literatury sugeruje, że ATP sprzyja migracji i proliferacji komórek mięśni gładkich [75]. Zostało również udowodnione, że fibroblasty uwalniają ATP z semikanałów koneksynowych, co sprzyja odpowiedzi profibrotycznej w sercu [76], sugerując, że fibroblasty rezydujące w naczyniach krwionośnych uwalniają ATP poprzez koneksyny, aby promować przekazywanie sygnału purynergicznego w ścianie naczyń krwionośnych. Podsumowując, semikanały koneksyn mogą brać udział w uwalnianiu ATP w stanach patologicznych (stany zapalne, miażdżyca obniżone stężenie jonów wapnia) oraz, prawdopodobnie, podczas stanów fizjologicznych. Jednak pozostaje do wyjaśnienia czy semikanały koneksyn odgrywają rolę w uwalnianiu ATP z komórek naczyń, aby regulować napięcie ścian naczyń i ciśnienie krwi. Kanały pankesyny W roku 2000 została zidentyfikowana nowa rodzina białek nazwanych paneksynami (Panx), które są ortologami białek tworzących połączenia szczelinowe u bezkręgowców, ineksyn (innexins), mają podobną topologię do ssaczych białek budujących połączenia szczelinowe koneksyn [77]. Do dziś zostały opisane 3 izoformy paneksyn (Panx1, Panx2 i Panx3), a ich występowanie na różnych typach komórek i w różnych tkankach jest celem wielu badań. Wydaje się, że białka Panx1 i Panx3 składają się w heksamery, podczas gdy Panx2 może formować hapta- lub oktamery [78]. Paneksyny formowane są w siateczce endoplazmatycznej i aparacie Golgiego, następnie transportowane są do błony plazmatycznej, podobnie jak koneksyny. Jednak paneksyny nie tworzą połączeń szczelinowych, dlatego formowane przez nie kanały nazywane są kanałami paneksynowymi, a nie semikanałami [79]. Podstawową różnicą między tymi białkami jest fakt, że zewnątrzkomórkowe pętle paneksyn mają wiele uglikozylowanych reszt aminokwasowych, co może utrudniać zakotwiczanie ich w kanałach paneksynowych sąsiadujących komórek [80]. Wydaje się, że paneksyny tworzą kanały umożliwiające transport cząsteczek między środowiskiem zewnątrz- i wewnątrzkomórkowym. Na podstawie charakterystyki kanałów paneksyny w systemie ekspresji heterologicznej zaobserwowano, że w przeciwieństwie do koneksyn, aktywność paneksyn nie jest zależna od Postępy Biochemii 60 (4)

9 stężenia jonów wapnia, co umożliwia otwarcie tych kanałów podczas ich fizjologicznych stężeń [81]. Ekspresja genów Panx1 w oocytach Xenopus ujawniła maksymalny prąd anionowy po depolaryzacji błony, a badania patch clamp zademonstrowały przepuszczalność tych kanałów dla ATP [82]. Obserwacja ta zapoczątkowała serię badań nad rolą Panx1 w uwalnianiu ATP z wielu typów komórek, m.in. komórek mięśni gładkich i śródbłonka naczyń krwionośnych [83,84]. Podczas gdy kanały Panx1 przyczyniają się do uwalniania ATP w warunkach fizjologicznych, istnieją również doniesienia, że biorą udział w apoptozie i śmierci komórki [85] oraz aktywacji limfocytów T podczas stanów zapalnych [86]. Właśnie dlatego jest to takie ważne, aby zidentyfikować mechanizm, który reguluje przepuszczalność kanałów paneksyn dla nukleotydów i innych cząsteczek wewnątrzkomórkowych, jak również określenie potencjalnych partnerów białkowych, którzy poprzez wiązanie się z paneksynami mogliby regulować ich aktywność (np. uwalnianie ATP). Podczas apoptozy umierające komórki uwalniają nukleotydy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, promując chemotaksję fagocytów. Wydaje się, że Panx1 jest zaangażowany w ten proces. Kanał jest aktywowany poprzez obcięcie wewnątrzkomórkowego końca C przez kaspazę. Powoduje to uwolnienie ATP do macierzy zewnątrzkomórkowej i rekrutację fagocytów. Uwalnianie ATP, rekrutacja monocytów oraz leukocytów jest stymulowana przez anty-fas lub światło UV, które są znanymi bodźcami wywołującymi apoptozę, a były znacząco obniżone podczas wyciszenia genu Panx1 przy użyciu sirna, co sugeruje, że kanały te pośredniczą w uwalnianiu ATP z komórek ulegających apoptozie [85]. Podczas gdy to badanie potwierdza rolę uwalniania ATP przez Panx1 podczas śmierci komórki, ten sam mechanizm może mieć również ochronny wpływ podczas stanów patologicznych, takich jak niedokrwienie. W astrocytach stres wywołany niedokrwieniem hamuje uwalnianie ATP aby ochronić komórkę przed śmiercią. Wydaje się, że mechanizm ten zachodzi poprzez hamowanie uwolnienia ATP przez kanały Panx1 na drodze negatywnej pętli sprzężenia zwrotnego od receptora P2X 7 [87]. Wydłużona aktywacja receptora P2X 7 powoduje otwarcie dużych porów przepuszczalnych dla jonów dwuwartościowych, takich jak Ca 2+, których napływ ostatecznie prowadzi do śmierci komórki [88]. Badanie to pokazało, że stres wywołany niedokrwieniem w hodowli astrocytów korowych powodował początkowe uwalnianie ATP poprzez kanały Panx1, co w efekcie aktywowało receptory P2X 7 i prowadziło do zamknięcia Panx1 oraz zapobiegało utracie składników wewnątrzkomórkowych i śmierci komórki. Razem badania te pokazują zróżnicowane funkcje, które pełni Panx1 w komórce. Początkowe badania nad paneksynami określiły ich kluczową rolę w regulacji uwalniania ATP z krążących erytrocytów podczas stresu wywołanego niedokrwieniem lub deformacją błony komórkowej [89] komórek mięśni gładkich po aktywacji receptorów adrenergicznych [83] oraz komórek śródbłonka po stymulacji trombiną [84]. Uwalnianie ATP z tych komórek zachodzi w fizjologicznych stężeniach wapnia i może odgrywać kluczową rolę w regulacji napięcia ścian naczyń i oporu obwodowego. Początkowo sądzono, że uwalnianie ATP z krążących erytrocytów w odpowiedzi na niską zawartość tlenu zachodzi poprzez transporter ABC, CFTR [90], jednak późniejsze badania poddały w wątpliwość czy transportery z rodziny ABC mogą uwalniać ATP [91]. Locovei i wsp. [63] udowodnili, że uwolnienie ATP, podczas depolaryzacji błony komórkowej erytrocytów, spowodowane wysokim stężeniem zewnątrzkomórkowych jonów potasu oraz obniżoną zawartością tlenu było hamowane przez inhibitor połączeń szczelinowych, kabrenoksolon. Autorzy zauważyli również, że nie można było wykryć ekspresji genów kodujących Cx43 w użytych w badaniu erytrocytach, co dodatkowo sugeruje, że inhibitor ten zahamował aktywność Panx1, a nie semikanałów Cx [81]. Mięśnie gładkie w małych naczyniach krwionośnych, które są zaangażowane w regulację przepływu i ciśnienia krwi ulegają skurczowi w odpowiedzi na stymulację receptorów α-adrenergicznych. Impulsy przekazywane przez nerwy współczulne powodują uwolnienie NA z zakończeń unerwiających łożyska naczyniowe, co wywołuje aktywację receptora α1d-adrenericznego, wzrost stężenia jonów wapnia w komórkach mięśni i ostatecznie skurcz, co daje efekt wzrostu oporu obwodowego i ciśnienia krwi [35]. Niedawno odkryto nową rolę kanałów Panx1 w regulacji odpowiedzi angażującej receptor α1-adrenergiczny [83]. W badaniu tym stymulacja wyizolowanych tętnic selektywnym agonistą receptora α1-adrenergicznego, fenylefryną (PE, ang. phenylephrine) spowodowała silny skurcz naczyń, co jest zgodne z poprzednimi obserwacjami. Badania tętnicy piersiowo-grzbietowej wykazały, że jest ona silnie unerwiona przez nerwy adrenergiczne, rozwija spontaniczne napięcie ścian naczyń i jest podatna na stymulację różnymi wazo-aktywnymi czynnikami [92]. W obecności trzech różnych inhibitorów paneksyn: probenecydu (ang. probenecid), meflochiny (ang. mefloquine) i peptydu blokującego 10 Panx1 (ang. Panx1 blocking peptide), skurcz wywołany PE był znacznie 10 obniżony. Ponadto, dodanie apyrazy do układu, w którym odbywało się płukanie naczynia krwionośnego skutkowało podobnym hamowaniem skurczu. Wreszcie, stymulacja komórek mięśni gładkich z tętnic wieńcowych PE indukowała uwalnianie ATP z tych komórek, efekt ten był hamowany po dodaniu peptydu blokującego 10 Panx1. Wspólnie te wyniki świadczą o nowej roli kanałów Panx1 w komórkach naczyniowych mięśni gładkich w uwalnianiu ATP podczas aktywacji receptorów α1-adenergicznych, procesu niezbędnego do prawidłowej regulacji napięcia ścian naczyń krwionośnych i ciśnienia krwi. W oparciu o te obserwacje można opracować nowe podejście do terapeutycznej regulacji ciśnienia. Zaobserwowano również, że produkcja Panx1 w komórkach śródbłonka naczyń była znacząco podwyższona. Dodatkowo Godecke i współpracownicy [84] udowodnili, że ATP jest uwalniane z komórek HUVEC w odpowiedzi na trombinę, co było hamowane przez carbenoxolone oraz wyciszenie endogennego Panx1. Ponadto, analiza wzorów ekspresji genów różnych izoform paneksyn w mięśniach gładkich i komórkach śródbłonka tętnic sugeruje wzrost poziomu ekspresji w komórkach mięśni gładkich wraz ze spadkiem średnicy naczynia, co wspiera hipotezę uwalniania ATP poprzez Panx1 w regulacji przepływu krwi w małych tętnicach i tętniczkach [93]. Do dziś niewiele jest wiadomo o roli kanałów Panx w regulacji procesów fizjologicznych, w szczególności tych, w 464

10 które zaangażowana jest dynamika naczyń krwionośnych i przepływu krwi. Jednak, analiza właściwości fizjologicznych poprzez badanie różnymi inhibitorami połączeń szczelinowych sugeruje, że niektóre wcześniejsze wyniki identyfikujące semikanały koneksyn jako drogi uwalniania ATP, mogą w rzeczywistości zawdzięczać swoją aktywność paneksynom [94]. Dalsze badania nad wzorami ekspresji genów i regulacją ekspresji genów kodujących kanały paneksyn może pozwolić na odkrycie nowych szlaków sygnałowych, które uczestniczą w regulacji napięcia ścian naczyń krwionośnych, oporu obwodowego i ciśnienia krwi, co z kolei może dostarczyć nowych celów terapeutycznych w leczeniu nadciśnienia i niedociśnienia. Ektonukleotydazy Aktywacja receptorów nukleotydowych utrzymuje się do chwili zmetabolizowania substratów przez zewnątrzkomórkowe enzymy lub odczulenia na sygnał. Degradacja nukleotydów ma dwojakie skutki: z jednej strony zmniejsza stężenie substratu do aktywacji receptorów wrażliwych na tri- lub difosforany, z drugiej zwiększa stężenie odpowiednio di- lub monofosforanów, a w końcu również adenozyny. Ektonukleotydazy są enzymami zakotwiczonymi po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Odgrywają znaczącą rolę w regulowaniu zewnątrzkomórkowych stężeń nukleotydów i nukleozydów [3]. Wczesne badania nad hydrolizą nukleotydów ukazały szybką przemianę ATP do ADP i dalej do AMP, ale dużo wolniejszą do samej adenozyny [95]. W ścianie naczyń krwionośnych występują 4 ektonukleotydazy z 17 obecnych u człowieka: ektonukleozydo-3-fosfo dihydrofosforhydrolaza 1 i 2 (1 NTPDaza1 i 2), ekto-5 -nukleotydaza oraz ekto-nukleotydo-pyrofosfataza (NPP1, ekto-nukleotydo fosfodiesteraza) (Tab. 1) [3]. Najistotniejszą rolę w metabolizmie nukleotydów odgrywają i najintensywniej badane są dwa enzymy: NTPDaza 1 oraz ekto-5 - -nukleotydaza i one zostaną omówione w poniższym podrozdziale (Ryc. 1). Synteza ektonukleozydo-3-fosfo difosfohydrolazy 1 (E-NTPDaza1/CD39) zachodzi w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych [96], a enzym ten jest głównym członkiem rodziny E-NTPaz zaangażowanym w hydrolizę zewnątrzkomórkowych nukleotydów na powierzchni tych komórek. Formy rozpuszczalne kinazy adenylanowej 1 oraz E-NTPDazy 1/CD39 są głównymi regulatorami krążących nukleotydów [97]. U myszy z wyciszonym Entpd1 kodującym E-NTPDazę1/CD39 zaobserwowano zwiększoną relaksację mięśni gładkich aorty, w której pośredniczyły receptory P2Y 1 i P2Y 2, co sugeruje, że E-NTPDaza1/CD39 reguluje relaksację naczyń krwionośnych zależną od wymienionych receptorów [98]. Odwrotny efekt zaobserwowano w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs, ang. human umbilical vein endothelial cells) zwiększona aktywność E-NTPDazy1/CD39 hamowała odpowiedź komórek śródbłonka (sekrecję czynnika von Willebranda) wywoływaną przez aktywację receptorów P2Y do tego stopnia, że komórki ulegały apoptozie ze względu na zwiększona ilość ATP (prawdopodobnie poprzez receptory P2X 7 ) [99]. Podanie dootrzewnowe rozpuszczalnej E-NTPDazy 1 hamowało odkładanie się płytek krwi i rekrutację leukocytów wywołane zranieniem oraz odwracało przerost intimy. Autorzy sugerują, że ludzka E-NTPDaza1 może odgrywać znaczącą rolę w supresji odpowiedzi płytkowej, zapalnej i proliferacyjnej komórek po uszkodzeniu naczynia krwionośnego [100]. AMP może ulegać dalszej przemianie do adenozyny poprzez odcięcie grupy 5 -fosforanowej przez enzym ekto-5 - -nukleotydazę CD73 [56]. E-NTPDaza1/CD39 zlokalizowana na powierzchni mięśni gładkich tętnic zmniejsza stężenia zewnątrzkomórkowych ATP, ADP, UTP oraz UDP, które w innym przypadku mogłyby aktywować receptory z rodziny P2, więc zmniejszają czas skurczu naczyń. Wykazano, że podanie UDP do krwiobiegu krwi myszy pozbawionej CD39 powodowało początkowe rozluźnienie naczyń, a następnie silny skurcz oraz znaczne podwyższenie średniego ciśnienia tętniczego. Ponadto, pozyskane z tych myszy krążki aorty wykazywały znacznie podwyższoną siłę skurczu wywołaną adenozyną i urydyną w porównaniu do myszy kontrolnych z funkcjonalnym enzymem [98]. W innym badaniu Tabela 1. Ektonukleotydazy występujące w ścianie naczyń krwionośnych człowieka i ich wybrane właściwosci biochemiczne. Na podstawie [3]. Nazwa rodziny, numer EC Nazwa enzymu Pełna nazwa Główne substraty Produkt końcowy Powinowactwo do substratu (K m ), μm Ektonukleozydo-3-fosfo difosfohydrolazy (EC ) NTPAza 1 CD3, ATPDaza, ektoapyraza NTP, NDP NMP, Pi ATP ~ NTPAza 2 CD39L1, ekto-atpaza NTP, (NDP) NMP, Pi ATP ~ 70 Ekto-5 -nukleotydazy (EC ) en CD73, ekto-5 -nukleotydaza, ent, 5 -NT o niskim K m NMP nukleozyd, Pi AMP 1-50 Ekto-nukleotydo pyrofosfataza/fosfodiesteraza (EC ) (EC ) NPP1 PC-1, NPPγ, PDNP1 NTP, NDP, dinukleozydy polifosfatanów, NAD+ NMP, Ppi, Pi NMP + Npn-1 AMP + mononukleotyd nikotynamidu ATP ~ ApnA ~1-20 NMP monofosforany nukleozydów, NDP difosforany nukleozydów, NTP trifosforany nukleozydów. Postępy Biochemii 60 (4)

11 Kauffenstein i wsp. [98] zaobserwował wyraźny spadek w ciśnieniu krwi po podaniu dożylnym UTP w stężeniach podprogowych wywołujących skurcz naczyń krwionośnych oraz, konsekwentnie, z obniżonym rozkładem nukleotydów i wzmożonej sile sygnału przechodzącego przez receptory P2Y w śródbłonku. Badania te sugerują kluczową rolę ektonukleotydaz w regulacji stężenia ATP w świetle naczyń krwionośnych, jak również w środowisku zewnątrzkomórkowym komórek budujących ściany naczyń, co wzmacnia podwójny efekt nukleotydów w regulacji oporu obwodowego i ciśnienia krwi. W komórkach HUVEC silnym aktywatorem CD37 jest interferon-α [102]. Atrovastatyna, lek obniżający poziom cholesterolu działający poprzez hamowanie aktywności reduktazy 3-hydroksy-3-metylogrutarylo koenzymu A aktywuje degradację zewnątrzkomórkowych nukleotydów, co może dawać ochronne działanie we wczesnych stadiach dysfunkcji śródbłonka, które poprzedzają rozwój miażdżycy [103]. Istnieją przesłanki, mówiące, że po ekspozycji na działanie ludzkiej krwi nastąpiła utrata ekto-5 -nukleotydazy na powierzchni komórek śródbłonka u świni, co może być jednym z głównych powodów odrzutów po przeszczepach ksenograficznych [104]. W ludzkim osoczu zostały zidentyfikowane dwa działające przeciwstawne szlaki: generujący ATP (w który zaangażowana jest kinaza ektoadenylowa) oraz zużywający ATP, to one kontrolują równowagę, czas trwania i siłę sygnału purynergicznego we krwi [105]. Wiele badań in vivo pokazało wpływ puryn poprzez śródbłonek na regulację homeostazy w układzie naczyniowym. Ze względu na brak selektywnych agonistów mogących posłużyć w badaniach in vivo nad podtypami receptorów, ciężko jest określić, które z nich i w jakim stopniu są zaangażowane w przekazywanie sygnału. Również różnice między poszczególnymi naczyniami oraz różnice gatunkowe utrudniają znalezienie jednoznacznej odpowiedzi na postawione pytanie. RECEPTORY NUKLEOTYDOWE Receptory nukleotydowe zostały zaklasyfikowane do dwóch głównych rodzin: P1 i P2 (P oznacza purynergiczne, ang. purinergic, co związane jest z faktem, że dopiero z czasem odkryto, że receptory te aktywowane są nie tylko przez puryny ATP i jego pochodne, ale również pirymidyny UTP i jego pochodne). Receptory P1 dalej ulegają klasyfikacji na A 1, A 2A, A 2B oraz A 3, które są związane z białkami G s lub G i i selektywnie wiążą się z adenozyną po zewnętrznej stronie komórki, aby regulować wewnątrzkomórkowe stężenie camp. Receptory P2 są podzielone na receptory P2X związane z kanałami jonowymi dla Na +, K + oraz Ca 2+, do których należy 7 izoform (P2X 1-7 ) oraz metabotropowe receptory P2Y związane z białkami G q lub G i, do których należy 8 izoform (P2Y 1,2,4,6,11-14 ) (Tab. 2) [4]. Istotnymi cechami odróżniającymi receptory z rodziny P2 są m.in. odmienni agoniści, różne powinowactwo do substratów oraz wpływ na metabolizm komórki. Receptory P2X są aktywowane jedynie poprzez ATP i mają wpływ na aktywność kanałów jonowych, receptory P2Y są aktywowane zarówno poprzez nukleotydy purynowe, ATP, ADP, jak i pirymidynowe UTP, UDP oraz UDP-glukozę. Związanie substratów z receptorami nukleotydowymi związanymi z białkiem G q, P2Y 1,2,4,6,11 prowadzi do aktywacji fosfolipazy C, wzrostu stężenia trifosforanu inozytolu (IP3) i uwolnienia zmagazynowanych wewnątrzkomórkowych jonów wapnia [106]. Wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia prowadzi do aktywacji śródbłonkowej syntazy tlenku azotu i produkcji NO, który przekazuje sygnał do VSMC, aby zaindukować rozluźnienie naczyń krwionośnych [107]. Podczas aktywacji P2Y 11 dodatkowo zwiększa się aktywność cyklazy adenylanowej, co prowadzi do wzrostu stężenia camp w komórce. P2Y 12,13,14 są związane z białkiem G i i ich aktywacja prowadzi do zahamowania aktywności cyklazy adenylanowej i w konsekwencji spadku stężenia camp [106]. Receptory P2Y Większość komórek śródbłonka naczyń krwionośnych eksprymuje receptory P2Y 1, które są aktywowane przez ATP i ADP oraz receptory P2Y 2 aktywowane w równym stopniu przez UTP co ATP. P2Y 4 aktywowane przez UTP oraz P2Y 6, które są celem dla UDP ulegają produkcji w komórkach śródbłonka niektórych naczyń krwionośnych [108]. Początkowo zaobserwowano różny efekt działania ADP oraz UTP/ATP na komórki śródbłonka aorty wołu, dlatego receptory odpowiedzialne za przekazywane poszczególnych sygnałów zostały nazwane P2Y oraz P2U, dziś te nazwy odpowiadają receptorom P2Y 1 oraz P2Y 2 lub P2Y 4. Koprodukcja wyżej wymienionych receptorów w komórkach śródbłonka wielu typów naczyń krwionośnych u różnych gatunków zwierząt została już wielokrotnie opisana, jednak jedynie receptory P2Y 1 zostały zidentyfikowane na komórkach śródbłonka małych naczyń krwionośnych mózgu szczura [109]. Związanie się odpowiednich substratów z właściwymi dla nich receptorami nukleotydowymi na komórkach śródbłonka prowadzi do wzrostu stężenia Ca 2+, co uruchamia jednoczesne uwolnienie NO, EDHF oraz PGI 2 [110]. Produkcja NO oraz EDHF wywoływana przez aktywację śródbłonkowych receptorów P2Y 1 oraz P2Y 2 i/ lub P2Y 4 powoduje rozkurcz naczyń krwionośnych [111]. Poziom zaangażowania PGI 2 w zależnym od nukleotydów rozkurczu jest różny w zależności od rodzaju naczynia krwionośnego oraz podtypu receptora. Wydzielane śródbłonkowo NO oraz PGI 2 hamują agregację płytek, jednakże ATP i ADP mogą stymulować uwalnianie czynnika von Willebrand a (ang. von Willebrand factor) w hodowli ludzkich komórek śródbłonka, co sprzyja utrzymaniu homeostazy. Co więcej, aktywacja receptorów P2Y 2 w komórkach śródbłonka ludzkiej tętnicy sercowej inicjuje kaskadę koagulacji. Widać więc, że poza bezpośrednim efektem ATP i ADP w stymulacji agregacji płytek krwi poprzez działanie receptorów P2Y 1, P2Y 12 i P2X 1, nukleotydy te mogą wywierać zarówno pro- i antykoagulacyjny efekt na komórki śródbłonka [112]. W komórkach śródbłonka mechanizm uwalniania NO zależny od ATP może angażować kanały chlorkowe aktywowane jonami wapnia [110]. Zaangażowana w ten proces również może być kinaza białkowa aktywowana przez AMP (AMPK). AMPK odgrywa kluczową rolę w regulowaniu homeostazy energetycznej komórki i może być aktywowana przez stres komórkowy, wywołany np. niedotlenieniem/niedokrwieniem lub hiperglikemią. Stany stresowe powodują nagłe uwolnienie ATP z uszkodzonych tkanek (komórek śródbłonka lub płytek krwi). W doświadczeniu sprawdzającym przekazywanie 466

12 Tabela 2. Receptory purynergiczne i ich agoniści oraz antagoniści. Na podstawie [4] Rodzina Nazwa białka Agoniści Selektywni Agoniści Selektywni Antagoniści Typ A 1 adenozyna G i/o P1 (A) A 2 A adenozyna G s A 2 B adenozyna Gs A 3 adenozyna G i/o P2Y 1 ADP > ATP 2-MeSADP, ADPbS, MRS2365 MRS2179, MRS2500 G q/11 P2Y 2 UTP=ATP UTPgS, PSB1114 G q/11 P2Y 4 UTP>ATP UTPgS, MRS4062 MRS2578 G q/11 P2Y P2Y 6 UDP>>UTP>ATP UDP, PSB 0474 ([ 3- phenacyludp), MRS2957 G q/11 P2Y 11 ATP>UTP NF546, NAD+ NAADP+ NF157, NF340 G s, G q/11 P2Y 12 ADP>>ATP ADP, 2-MeSADP AR-C G i/o P2Y 13 ADP>>ATP MRS2211 G i/o P2Y 14 UDP-glukoza UDP-galaktoza MRS2690 PPTN G i/o P2X 1 ATP a,b-meatp, L-b,g-meATP NF023, NF449 Ro kanał jonowy P2X 2 ATP kanał jonowy P2X 3 ATP A Ro51, RO3 kanał jonowy P2X P2X 4 ATP kanał jonowy P2X 5 ATP kanał jonowy P2X 6 ATP kanał jonowy P2X 7 ATP A839977, A740003, A438079, AZ kanał jonowy sygnału ADP w komórkach śródbłonka aorty wołu poprzez receptory P2Y 1 wykazano, iż synteza AMPK oraz kinazy kinaz zależnych od Ca 2+ i kalmoduliny (CAMKK) jest niezbędna do przekazania sygnału do syntazy tlenku azotu (NOS) i uwalniania NO [113]. ATP, ADP, UTP (ale nie UDP) aktywowały fosforylację AMPK w komórkach HUVEC poprzez receptory P2Y 1, P2Y 2 i/lub P2Y 4 [114]. W komórkach śródbłonka aorty aktywacja receptorów P2Y poprzez ATP powoduje utrzymującą się aktywację fosfolipazy D zależną od białkowej kinazy C (PKC) [115]. Fosforylacja NOS indukowana przez zewnątrzkomórkowe nukleotydy angażująca receptory P2Y 1, P2Y 2 i, być może, P2Y 4 zależna jest od jonów wapnia oraz PKC-δ. Wydaje się, iż ta ścieżka sygnałowa może stać się nowym celem terapeutycznym w chorobach związanych z zaburzeniami funkcji śródbłonka [73]. FAD jest uwalniany z komórek podczas stanów zapalnych oraz jest odpowiedzialny za ochronę przeciw urazom spowodowanym poprzez niedotlenienie w mięśniu sercowym szczura. Wywołuje również rozkurcz naczyń krwionośnych zależny od śródbłonka w łożysku krezki szczura poprzez aktywację receptorów z rodziny P2Y. Nie jest poznany mechanizm tego zjawiska, ale postuluje się, że proces ten angażuje czynnik rozkurczowy lub hiperpolaryzujący pochodzenia śródbłonkowego inny niż NO i PGI 2 [116]. Na śródbłonku mysiej aorty obecne są funkcjonalne receptory P2Y, jednak rozkurcz wywołany nukleotydami uwolnionymi przez śródbłonek spada wraz z akumulacją płytki miażdżycowej, co wiąże się ze zmniejszoną dostępnością NO [117]. Siła rozkurczu naczyń krwionośnych zależnego od śródbłonka, a wywołanego przez acety- Postępy Biochemii 60 (4)

13 locholinę spada wraz z wiekiem, w przeciwieństwie do siły rozkurczu wywołanego przez ATP, która nie ulega zmianie u zdrowych osobników [118]. Wykazano antagonistyczne działanie acylowych pochodnych koenzymu A na rozkurcz naczyń krwionośnych poprzez śródbłonkowe receptory P2Y 1, w którym pośredniczy ADP. Koenzym A może być uwalniany z komórek podczas niektórych stanów patologicznych, takich jak niedokrwienie czy cukrzyca, co może świadczyć, że jest to endogenny regulator przekazywania sygnału nukleotydowego [119]. Troficzna rola receptorów P2Y została zaproponowana, kiedy w 2003 roku zaobserwowano, że rozmiar komórek śródbłonka jest regulowany właśnie przez ich aktywność [120]. Późniejsze badanie porównawcze analizujące odpowiedzi pojedynczych komórek śródbłonka wyizolowanych z bydlęcej siatkówki i komórek HUVEC wykazało rolę różnic we wzorach odwrażliwienia receptorów P2Y 2 oraz czynników wzrostu [121]. W jednym z badań nad wzmocnieniem bariery śródbłonka ukazano, że zjawisko to może być związane z aktywacją cytoszkieletu wywołaną przez ATP, które jest zależne zarówno od aktywacji białka Rac (białko o aktywności GTPazy z rodziny białek Rho), jak i kortaktyny [122]. Ponadto zewnątrzkomórkowe ATP powoduje aktywację fosfatazy lekkich łańcuchów miozyny w komórkach śródbłonka, który to enzym jest bezpośrednio zaangażowany w regulację funkcji bariery śródbłonka [123]. Wykazano, że B-NAD promuje funkcje bariery śródbłonka w hodowlach wyprowadzonych z ludzkiej tętnicy płucnej, a proces ten angażował zarówno receptory P2Y 1 oraz P2Y 11 jak i rearanżację cytoszkieletu aktynowego zależnego od PKA oraz EPAC1/Rac1 [74]. Receptory P2X Mimo że to receptory P2Y są głównym obiektem badań przekazywania sygnału nukleotydowego w naczyniach krwionośnych, zostały opisane również izoformy receptorów P2X obecne w śródbłonku wielu typów naczyń krwionośnych. Za pomocą metod immunohistochemicznych na komórkach śródbłonka tętnicy piersiowej, tętnicy promieniowej i żyły odpiszczelowej zidentyfikowano receptory P2X 1, P2X 4, P2X 7 oraz P2Y 2, z kolei receptory P2X 4 ulegały stosunkowo silnej syntezie w naczyniach żylnych w porównaniu do tętnic [124]. W eksperymencie badającym obecność receptorów z rodziny P2 w tętnicach piersiowych i komórkach HUVEC, zaobserwowano, że w mięśniach gładkich dominował receptor P2X 1, natomiast P2X 4, P2Y 1 oraz P2Y 11 były najpowszechniejsze w śródbłonku, dodatkowo P2Y 2 oraz P2Y 6 były również obecne na niskich poziomach w obu lokalizacjach [108]. W badaniu komórek śródbłonka w hodowlach wyprowadzonych z tętnic wieńcowych, płucnych oraz aorty i komórek HU- VEC również zaobserwowano syntezę receptora P2X 4, ale również P2X 5 [28]. Synteza tych receptorów różni się nie tylko między różnymi komórkami budującymi naczynie krwionośne, ale również lokalizacją w samej komórce, na komórkach HUVEC występowanie receptorów P2X 4 oraz P2X 6 było ograniczone do miejsc styku komórka-komórka, co pozwoliło wnioskować, że obecność tych receptorów jest skorelowana z VE-kadheryną, znacznikiem adhezji komórkowej w połączeniach komórek HUVEC [125]. Nadal niewiele jest wiadomo o funkcji śródbłonkowych receptorów P2X. Najlepiej poznanym receptorem jest P2X 4, a jego najbardziej znaną funkcją jest pośredniczenie w rozkurczu mięśni w odpowiedzi na ATP uwalniane z komórek śródbłonka. Wykazano, że myszy z uszkodzonym genem kodującym P2X 4 wykazywały nieprawidłową odpowiedź śródbłonka na zmiany w przepływie krwi, zmniejszoną rozszerzalność naczyń. Zwierzęta te również miały podwyższone ciśnienie krwi i uwalniały mniejsze ilości NO. Wydaje się, że nadciśnienie u tych myszy może być spowodowane nieobecnością rozkurczu naczyń spowodowanego interakcją ATP z P2X 4 oraz obniżoną produkcją NO w odpowiedzi na ten bodziec, a jednocześnie brakiem negatywnego wpływu NO na proliferację mięśni gładkich naczyń [126]. Aktywacja receptorów P2X 1 eksprymowanych w śródbłonku tętnic krezki szczura prowadzi do rozluźnienia naczyń krwionośnych, głównie poprzez EDHF [127]. Późniejsze badania nad myszami z wyciszonym genem kodującym P2X 1 potwierdziły wyniki osiągnięte na szczurach, co zasugerowało badaczom, że rozkurcz naczyń zależny od tego receptora jest szczególnie ważny w stanach zapalnych lub uszkodzeniach naczyń [128]. Komórki HUVEC poddane laminarnej sile ścinającej zmniejszały poziom mrna kodującego receptor P2X 4, aby po 24 godzinach osiągnąć 60% wyjściowej ilości [129]. Produkcja P2X 4 oraz P2X 7 jest podwyższona w odpowiedzi na warunki stanu zapalnego, a aktywacja P2X 7 wywołała uwolnienie zarówno pro- jak i przeciwzapalnych ligandów dla receptora interlukiny-1. Zaburzenie równowagi pomiędzy tymi czynnikami może doprowadzić do zmiany stanów zapalnych ściany naczynia [130]. Receptory P1 (dla adenozyny) Adenozyna wywołuje wzrost przepływu krwi do tkanki niedokrwionej lub niedotlenionej, np. hamuje uwalnianie z zakończeń nerwów sympatycznych neurotransmiterów poprzez oddziaływanie na receptory presynaptyczne lub rozszerza światło naczyń krwionośnych poprzez oddziaływanie na śródbłonek lub mięśnie gładkie. Wszystkie 4 izoformy receptorów dla adenozyny, A 1, A 2A, A 2B, A 3, zostały zidentyfikowane zarówno na śródbłonku jak i na komórkach mięśni gładkich, najczęściej występują izoformy A 2A i A 2B (Tab. 2) [4]. Analiza mechanizmów odpowiedzialnych za uwalnianie NO wywołanego adenozyną z śródbłonka aorty szczura sugeruje, że zjawisko to wymagające pośrednictwa receptora A 1, jest zależne od napływu zewnątrzkomórkowych jonów wapnia, aktywacji fosfolipazy A 2 i ATP- -wrażliwych kanałów potasowych, natomiast to, w którym uczestniczy receptor A 2A wymaga napływu zewnątrzkomórkowych jonów wapnia oraz aktywacji kanałów potasowych zależnych od potencjału błony [131]. Poza działaniem rozkurczowym adenozyny w sytuacji niedotlenienia, istnieją przesłanki mówiące o jej zdolności do promowania angiogenezy podczas niedokrwienia lub niedotlenienia, co pomaga zapewnić wystarczające natlenienie tkanek w stresowych warunkach [132]. Receptory A 2B obecne na śródbłonku naczyń kapilarnych człowieka modulują 468

14 produkcję czynników angiogennych [133], ich aktywacja zwiększa produkcję VEGF i proliferację komórek, istnieją również przesłanki, że są zaangażowane indukcję syntezy VEGF przez niedotlenienie [134]. Ze względu na tę niezwykle ważną rolę receptorów A 2B, wydaje się zrozumiałe, że w okresie niedotlenienia zmienia się produkcja receptorów w komórkach śródbłonka z A 2A na A 2B [133].Występują różnice w odpowiedzi na aktywację receptorów dla adenozyny i β-adrenoreceptorów podczas niedotlenienia w dużych i małych naczyniach krwionośnych [135]. Wydaje się, że adenozyna może wywierać działanie antykoagulacyjne na komórki śródbłonka poprzez aktywację receptorów A 2A i A 3, które powodują zmniejszenie syntezy śródbłonkowego czynnika tkankowego, szczególnie podczas niedotlenienia i miażdżycy procesów, które kojarzone są ze zwiększonym poziomem puryn w krwioobiegu. Cytokiny mogą modulować produkcję receptorów A 2A i A 2B w śródbłonku ludzkich naczyń włosowatych [136]. Zaobserwowano regulację produkcji reaktywnych form tlenu indukowanych Ang-II poprzez receptory A 2A w komórkach śródbłonka. Hamowanie aktywności A 2A może chronić komórki śródbłonka przed stresem oksydacyjnym wywołanym Ang-II i dysfunkcją śródbłonka [137]. Leukocyty adherentne zapobiegają powstawaniu adenozyny, czego konsekwencją jest osłabiona funkcja bariery śródbłonka zależna od mechanizmu zależnego od CD37 [138]. Niedawne doniesienia sugerują, że adenozyna może być głównym regulatorem śródbłonkowych komórek progenitorowych [139]. Adenozyna powoduje wzrost syntezy receptora dla chemokin CXCR4 i stymuluje rekrutację w pozawałowym mięśniu sercowym oraz przyspiesza jego naprawę. Inna grupa badaczy z kolei zidentyfikowała receptory A 2A i A 3, jako mediatory dla migracji progenitorowych komórek śródbłonka [140]. Receptory te różnią się ilością i powinowactwem do substratów oraz są specyficzne tkankowo. Brak kolejnych receptorów z rodziny P2Y (P2Y 3, P2Y 5, P2Y 7, P2Y 8, P2Y 9, P2Y 10 ) jest spowodowany błędem opisu podczas ich identyfikacji. Początkowo zaliczono je do tej rodziny, z czasem jednak okazało się, że do niej nie należą. PRZEKAZYWANIE SYGNAŁU PURYNERGICZNEGO W CHOROBACH SERCOWO-NACZYNIOWYCH Choroby sercowo-naczyniowe stanowią przyczynę blisko 50% zgonów we współczesnych społeczeństwach zachodnich. Ponieważ receptory dla nukleotydów i adenozyny odgrywają ogromną rolę w utrzymaniu prawidłowej struktury i funkcji naczyń krwionośnych coraz większą uwagę przyciąga wykorzystanie ich jako celu farmakologicznego w terapii chorób naczyniowych [4]. Ciśnienie krwi pozostaje w dynamicznej równowadze utrzymywanej przez ATP i UTP uwalniane od strony światła naczynia przez krążące komórki krwi oraz komórki śródbłonka, co stymuluje rozkurcz oraz nukleotydy uwalniane przez nerwy z zewnątrz naczynia, co z kolei pobudza mięśnie gładkie do skurczu. ATP może również regulować ciśnienie krwi poprzez oddziaływanie na pracę nerki oraz pnia mózgu [141]. Diadenozyno fosforany, takie jak Ap 4 A, Ap 5 A oraz Ap 6 A są to cząsteczki, które składają się z dwóch cząsteczek adenozyny złączonych od 4 do 6 grupami fosforanowymi. Wykazują one działanie skurczowe na naczynia krwionośne [142], najprawdopodobniej poprzez mechanizm angażujący receptory P2X 1 oraz P2Y 2. U chorych cierpiących na nadciśnienie obserwuje się znacząco wyższe poziomy Ap 5 A oraz Ap 6 A w płytkach krwi, co może przyczyniać się do zwiększonego oporu obwodowego u tych osób [143]. Up 4 A to czynnik skurczowy pochodzenia śródbłonkowego, który wykazuje silniejsze działanie na skurcz naczyń nerki niż endotelina [144]. Jest uwalniany po zadziałaniu acetylocholiny, trombiny lub stresu mechanicznego na komórki śródbłonka, a następnie może ulec zmetabolizowaniu do ATP lub UTP i dalej stymulować odpowiednio receptor P2X 1 lub P2Y 2 i w konsekwencji zwiększać ciśnienie krwi [33]. Miażdżyca jest główną przyczyną zawałów serca i obecnie postrzegana jest jako choroba o podłożu zapalnym. Formowanie się płytki miażdżycowej zaczyna się od akumulacji cząsteczek LDL, po którym następuje migracja makrofagów, które pobierają LDL do swojego wnętrza stając się komórkami piankowymi. Płytka taka może zostać ustabilizowana poprzez obudowanie się mięśniami gładkimi, jednak utleniony LDL generuje dalszy rozwój stanu zapalnego, co dalej aktywuje makrofagi i komórki dendrytyczne, a w konsekwencji również limfocyty T, które następnie uwalniają cytokiny oraz metaloproteinazy, które rozpuszczają płytkę. Wiele badań sugeruje zaangażowanie szlaków przekazywania sygnału nukleotydowego na wielu poziomach rozwoju miażdżycy. Zawarte w olejach z ryb kwasy tłuszczowe omega-3 powodują uwalnianie ATP [145], podczas gdy wysokie stężenie cholesterolu we krwi zmniejsza uwalnianie tego nukleotydu w tętnicach [146]. Wiele komórek biorących udział w odpowiedzi na stan zapalny ma na swojej powierzchni receptory nukleotydowe. W przypadku miażdżycy najważniejszymi komórkami zaangażowanymi w proces tworzenia płytki są monocyty, które dalej różnicują w makrofagi lub komórki dendrytyczne oraz limfocyty T-helperowe i supresorowe, ponieważ są odpowiedzialne za odpowiedź układu odpornościowego na tworzącą się zmianę w naczyniu [147]. Wiele receptorów z rodziny P2 jest eksprymowanych na makrofagach i limfocytach T [148], jednak najważniejszą rolę grają najprawdopodobniej 3: P2X 7, P2Y 2 oraz P2Y 11. Aktywacja receptora P2X 7 odgrywa ważną rolę podczas uwalniania IL-1 [149], TNF [150] i L-selektyny, cząsteczki adhezyjnej, niezbędnej do związania się limfocytów do komórek śródbłonka. Prawidłowe uwalnianie i działanie tych związków jest zaburzone podczas miażdżycy. Z kolei aktywowany receptor P2Y 2 stymuluje wybuch tlenowy w ludzkich makrofagach [151]. ATP hamuje aktywację limfocytów CD4+ poprzez zwiększanie stężenia wewnątrzkomórkowego camp, prawdopodobnie w proces ten zaangażowany jest receptor P2Y 11 [152]. Wykazano, że w miażdżycy zwiększa się również aktywność E-NTPDazy1/CD39, co powoduje zwiększoną hydrolizę ATP do ADP [153]. Autorzy pracy sugerują, że zjawisko to może mieć zarówno dobre jak i złe skutki. Z jednej stro- Postępy Biochemii 60 (4)

15 ny może zmniejszać formowanie skrzepu, a z drugiej może przyczyniać się do niestabilności płytki miażdżycowej i zawałów serca [153]. Zewnątrzkomórkowe nukleotydy są mediatorami stanu zapalnego naczyń krwionośnych i zakrzepicy [154]. ATP uwalniane do światła naczynia może być zmetabolizowane do ADP, które będzie oddziaływało na receptory P2Y 1 i P2Y 12 obecne na płytkach krwi, co doprowadzi do ich agregacji. Clopidogrel jest agonistą receptora P2Y 12, hamuje agregację płytek krwi i dlatego jest używany jako lek zapobiegający udarom mózgu i zakrzepicom [155]. Adenozyna wykazuje działanie przeciw zakrzepowe hamując indukcję czynnika tkankowego poprzez aktywację receptorów A 2A i A 3 [156]. Zaburzenia funkcji nerwów współczulnych naczyń krwionośnych w młodzieńczej cukrzycy zostały opisane już wiele lat temu. W dwa tygodnie po podaniu straptozytocyny (substancji niszczącej trzustkę) szczurom obserwowano nieprawidłową neurotransmisję oraz funkcję śródbłonka zależną od ATP w naczyniach krezki [157]. Jak już wcześniej wspominano, erytrocyty mogą przyczyniać się do rozkurczu naczyń poprzez uwalnianie ATP. W czerwonych krwinkach osób cierpiących na cukrzycę uwalnianie ATP jest obniżone [90]. Wysokie pozakomórkowe stężenie glukozy uwalnia ATP i/lub UTP z komórek śródbłonka oraz trzustki [1586]. Wzrost stężenia glukozy z 5 do 15 mmol/l (co odpowiada wzrostowi stężenia cukru w normoglikemii do hiperglikemii) powoduje promiażdżycową aktywację limfocytów T [158]. ATP i UTP uwalniane w odpowiedzi na wysokie stężenie glukozy aktywują receptory P2Y 2, a po degradacji do UDP, również P2Y 6. Wynika z tego, że uwalniane nukleotydy mogą odgrywać rolę czujnika w naczyniach krwionośnych pośrednicząc w odpowiedzi na hiperglikemię. U pacjentów z cukrzycą często obserwuje się zwiększony stosunek grubości ściany naczynia do jego światła, głównie z powodu przerostu VSMC i wyższy odsetek restenozy po angioplastyce. Uwalnianie zewnątrzkomórkowych nukleotydów w odpowiedzi na wysokie stężenie glukozy we krwi, które następnie wiążą się do receptorów P2Y i stymulują VSMC do wzrostu i proliferacji poprzez aktywację czynnika jądrowego aktywowanych limfocytów T (NFAT, ang. nuclear factor of activated T cells) może okazać się brakującym etapem w zrozumieniu zależności między cukrzycą a towarzyszącymi im patologiami naczyń krwionośnych [158]. PODSUMOWANIE Przedstawiona w powyższej pracy różnorodność receptorów oraz mnogość mechanizmów utrzymujących stężenie zewnątrzkomórkowych nukleotydów w dynamicznej równowadze, wskazuje jak fundamentalny jest sposób komunikacji dzięki nim. W chwili obecnej przekazywanie sygnału nukleotydowego jest bardzo intensywnie badane, a mimo to, jeszcze nie wszystkie procesy z nim związane są wyjaśnione. Badania nad funkcjami receptorów nukleotydowych są utrudnione przez fakt powinowactwa różnych receptorów do tego samego agonisty (porównaj tabela 2), wzajemne przemiany nukleotydów i nukleozydów na zewnątrz komórki oraz szybkie odróżnicowanie się składu receptorów wraz z kolejnym pasażem w hodowlach komórek pierwotnych [106]. Tym niemniej, obecnie oczywistym jest, że przekazywanie sygnału purynergicznego odgrywa znacząca rolę w kontroli napięcia ścian i remodelingu naczyń, a siła i efekt tego sygnału są zależne od produkujących go komórek i integralności śródbłonka. Uogólniając, sygnały przekazywane od zewnątrz, przez nerwy współczulne, powodują skurcz mięśni gładkich, podczas gdy sygnał idący z wewnątrz naczynia, od komórek krążących we krwi i komórek śródbłonka, powoduje jego rozkurcz [4]. Poza regulacją funkcji bariery śródbłonka i napięcia ścian naczyń aktywacja receptorów purynergicznych może znacząco wpływać na metabolizm komórek, np. aktywację szlaków kinaz aktywowanych mitogenami (MAPK, ERK, p38, JNK), a również kinazy białkowej aktywowanej przez AMP (AMPK) i śródbłonkowej kinazy tlenku azotu (enos) [73,114]. Ze względu na to, że przekazywanie sygnału nukleotydowego wydaje się być zmienione w przebiegu wielu chorób naczyniowych, receptory nukleotydowe mogą okazać się dobrymi celami farmakologicznymi w ich terapii [159]. PIŚMIENNICTWO 1. Gribble FM, Loussouarn G, Tucker SJ, Zhao C, Nichols CG, Ashcroft FM (2000) A novelmethod for measurement of submembrane ATP concentration. J Biol Chem 275: Lohman AW, Billaud M, Isakson BE (2012) Mechanisms of ATP release and signalling in the blood vessel wall. Cardiovasc Res 95: Zimmermann H, Zebisch M, Sträter N (2012) Cellular function and molecular structure of ecto-nucleotidases. Purinergic Signal 8: Burnstock G, Ralevic V (2013) Purinergic signaling and blood vessels in health and disease. Pharmacol Rev 66: Burnstock G, Kennedy C (1985) Is there a basis for distinguishing two types of P2- purinoceptor? Gen Pharmacol 16: Burnstock G (1978) A basis for distinguishing two types of purinergic receptor, in Cell Membrane Receptors for Drugs and Hormones: A Multidisciplinary Approach (Straub RW and Bolis L, eds, ed) pp , Raven Press, New York 7. Pearson JD, Gordon JL (1989) P2 purinoceptors in the blood vessel wall. BiochemPharmacol 38: Bodin P, Burnstock G (2001) Evidence that release of adenosine triphosphate from endothelial cells during increased shear stress is vesicular. J Cardiovasc Pharmacol 38: Demel SL, Dong H, Swain GM, Wang X, Kreulen DL, Galligan JJ (2010) Antioxidant treatment restores prejunctional regulation of purinergic transmission in mesenteric arteries of deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Neuroscience 168: Vial C, Evans RJ (2005) Disruption of lipid rafts inhibits P2X 1 receptor-mediated currents and arterial vasoconstriction. J Biol Chem 280: Johnson CD, Coney AM, Marshall JM (2001) Roles of norepinephrine and ATP in sympathetically evoked vasoconstriction in rat tail and hindlimb in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol 281: H2432-H Billaud M, Lohman AW, Straub AC, Parpaite T, Johnstone SR, Isakson BE (2012) Characterization of the thoracodorsal artery: morphology and reactivity. Microcirculation 19: Wier WG, Zang WJ, Lamont C, Raina H (2009) Sympathetic neurogenic Ca 2+ signaling in rat arteries: ATP, noradrenaline and neuropeptide Y. Exp Physiol 94: Burnstock G, Warland JJI (1987) A pharmacological study of the rabbit saphenous artery in vitro: a vessel with a large purinergic contractile response to sympathetic nerve stimulation. Br J Pharmacol 90:

16 15. Ralevic V, Burnstock G (1990) Postjunctional synergism of noradrenaline and adenosine 59-triphosphate in the mesenteric arterial bed of the rat. Eur J Pharmacol 175: Evans RJ, Surprenant A (1992) Vasoconstriction of guinea-pig submucosal arterioles following sympathetic nerve stimulation is mediated by the release of ATP. Br J Pharmacol 106: Åstrand P, Stjärne L (1989) ATP as a sympathetic co-transmitter in rat vasomotor nerves - further evidence that individual release sites respond to nerve impulses by intermittent release of single quanta. Acta Physiol Scand 136: Cheung DW (1982) Two components in the cellular response of rat tail arteries to nerve stimulation. J Physiol 328: Sneddon P, Burnstock G (1984) Inhibition of excitatory junction potentials in guinea-pig vas deferens by a, b-methylene-atp: further evidence for ATP and noradrenaline as cotransmitters. Eur J Pharmacol 100: Jobling P, McLachlan EM (1992) The effect of the purinoceptor antagonist suramin on neurotransmission in the main caudal artery of the rat. Proc Aust Physiol Pharmacol Soc 23: Burnstock G (1988) Sympathetic purinergic transmission in small blood vessels. Trends Pharmacol Sci 9: Brock JA, Dunn WR, Boyd NS, Wong DK (2000) Spontaneous release of large packets of noradrenaline from sympathetic nerve terminals in rat mesenteric arteries in vitro. Br J Pharmacol 131: Keef KD, Pasco JS, Eckman DM (1992) Purinergic relaxation and hyperpolarization in guinea pig and rabbit coronary artery: role of the endothelium. J Pharmacol Exp Ther 260: Lundberg JM (1996) Pharmacology of cotransmission in the autonomic nervous system: integrative aspects on amines, neuropeptides, adenosine triphosphate, amino acids and nitric oxide. Pharmacol Rev 48: Burnstock G (2009) Purines and sensory nerves, (Handbook Exp Pharmacol), Vol. 194, pp , Springer-Verlag, Berlin 26. Burnstock G (2009) Purinergic regulation of vascular tone and remodelling. Auton Autacoid Pharmacol 29: Crecelius AR, Kirby BS, Luckasen GJ, Larson DG, Dinenno FA (2012) ATPmediated vasodilatation occurs via activation of inwardly rectifying potassium channels in humans. J Physiol 590: Schwiebert LM, Rice WC, Kudlow BA, Taylor AL, Schwiebert EM (2002) Extracellular ATP signaling and P2X nucleotide receptors in monolayers of primary human vascular endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 282: C289-C Bodin P, Burnstock G (1996) ATP-stimulated release of ATP by human endothelial cells. J Cardiovasc Pharmacol 27: Hong D, Jaron D, Buerk DG, Barbee KA (2006) Heterogeneous response of microvascular endothelial cells to shear stress. Am J Physiol Heart Circ Physiol 290: H2498-H Yamamoto K, Furuya K, Nakamura M, Kobatake E, Sokabe M, Ando J (2011) Visualization of flow-induced ATP release and triggering of Ca 2+ waves at caveolae in vascular endothelial cells. J Cell Sci 124: Tölle M, Jankowski V, Schuchardt M, Wiedon A, Huang T, Hub F, Kowalska J, Jemielity J, Guranowski A, Loddenkemper C (2008) Adenosine 59-tetraphosphate is a highly potent purinergic endothelium-derived vasoconstrictor. Circ Res 103: Jankowski V, Tölle M, Vanholder R, Schönfelder G, van der Giet M, Henning L, Schlüter H, Paul M, Zidek W, Jankowski J (2005) Uridine adenosine tetraphosphate: a novel endothelium- derived vasoconstrictive factor. Nat Med 11: Gui Y, Walsh MP, Jankowski V, Jankowski J, Zheng XL (2008) Up4A stimulates endothelium-independent contraction of isolated rat pulmonary artery. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294: L733-L Sawada K, Echigo N, Juge N, Miyaji T, Otsuka M, Omote H (2008) Identification of a vesicular nucleotide transporter. Proc Natl Acad Sci USA 105: Nelson N, Perzov N, Cohen A, Hagai K, Padler V, Nelson H (2000) The cellular biology of proton-motive force generation by V-ATPases. J Exp Biol 203: Tousson A, Van Tine BA, Naren AP, Shaw GM, Schwiebert LM (1998) Characterization of CFTR expression and chloride channel activity in human endothelia. Am J Physiol 275: C1555-C Robert R, Norez C, Becq F (2005) Disruption of CFTR chloride channel alters mechanical properties and camp-dependent Cl- transport of mouse aortic smooth muscle cells. J Physiol 568: Sprague RS, Ellsworth ML, Stephenson AH, Kleinhenz ME, Lonigro AJ (1998) Deformation-induced ATP release from red blood cells requires CFTR activity. Am J Physiol 275: H1726-H Mattoscio D, Evangelista V, De Cristofaro R, Recchiuti A, Pandolfi A, Di Silvestre S (2010) Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) expression in human platelets: impact on mediators and mechanisms of the inflammatory response. FASEB J 24: Sprague RS, Ellsworth ML, Stephenson AH, Lonigro AJ (2001) Participation of camp in a signal-transduction pathway relating erythrocyte deformation to ATP release. Am J Physiol Cell Physiol 281: C C Aguilar-Bryan L, Nichols CG, Rajan AS, Parker C, Bryan J (1992) Co-expression of sulfonylurea receptors and KATP channels in hamster insulinoma tumor (HIT) cells. Evidence for direct association of the receptor with the channel. J Biol Chem 267: Larsson O, Ammala C, Bokvist K, Fredholm B, Rorsman P (1993) Stimulation of the K ATP channel by ADP and diazoxide requires nucleotide hydrolysis in mouse pancreatic beta-cells. J Physiol 463: Hassessian H, Bodin P, Burnstock G (1993) Blockade by glibenclamide of the flow-evoked endothelial release of ATP that contributes to vasodilatation in the pulmonary vascular bed of the rat. Br J Pharmacol 109: Reddy MM, Quinton PM, Haws C, Wine JJ, Grygorczyk R, Tabcharani JA (1996) Failure of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to conduct ATP. Science 271: Tu J, Le G, Ballard HJ (2010) Involvement of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in the acidosis-induced efflux of ATP from rat skeletal muscle. J Physiol 588: Devenish RJ, Prescott M, Rodgers AJ (2008) The structure and function of mitochondrial F1F0-ATP synthases. Int Rev Cell Mol Biol 267: Moser TL, Stack MS, Asplin I, Enghild JJ, Hojrup P, Everitt L (1999) Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 96: Moser TL, Kenan DJ, Ashley TA, Roy JA, Goodman MD, Misra UK (2001) Endothelial cell surface F1-F0 ATP synthase is active in ATP synthesis and is inhibited by angiostatin. Proc Natl Acad Sci USA 98: Gerasimovskaya EV,Woodward HN, Tucker DA, Stenmark KR (2008) Extracellular ATP is a pro-angiogenic factor for pulmonary artery vasa vasorum endothelial cells. Angiogenesis 11: Yamamoto K, Shimizu N, Obi S, Kumagaya S, Taketani Y, Kamiya A (2007) Involvement of cell surface ATP synthase in flow-induced ATP release by vascular endothelial cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 293: H1646-H Koval M (2006) Pathways and control of connexin oligomerization. Trends Cell Biol 16: Orellana JA, Froger N, Ezan P, Jiang JX, Bennett MV, Naus CC (2011) ATP and glutamate released via astroglial connexin 43 hemichannels mediate neuronal death through activation of pannexin 1 hemichannels. J Neurochem 118: Eltzschig HK, Eckle T, Mager A, Kuper N, Karcher C, Weissmuller T (2006) ATP release from activated neutrophils occurs via connexin 43 and modulates adenosinedependent endothelial cell function. Circ Res 99: Wong CW, Christen T, Roth I, Chadjichristos CE, Derouette JP, Foglia BF (2006) Connexin37 protects against atherosclerosis by regulating monocyte adhesion. Nat Med 12: Postępy Biochemii 60 (4)

17 56. Faigle M, Seessle J, Zug S, El Kasmi KC, Eltzschig HK (2008) ATP release from vascular endothelia occurs across Cx43 hemichannels and is attenuated during hypoxia. PLoS ONE 3:e Song M, Yu X, Cui X, Zhu G, Zhao G, Chen J (2009) Blockade of connexin 43 hemichannels reduces neointima formation after vascular injury by inhibiting proliferation and phenotypic modulation of smooth muscle cells. Exp Biol Med 234: Stout CE, Costantin JL, Naus CC, Charles AC (2002) Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J Biol Chem 277: Lamont C, Vial C, Evans RJ, Wier WG (2006) P2X1 receptors mediate sympathetic postjunctional Ca 2+ transients in mesenteric small arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol 291: H3106-H Contreras JE, Saez JC, Bukauskas FF, Bennett MV (2003) Functioning of cx43 hemichannels demonstrated by single channel properties. Cell Commun Adhes 10: Gomes P, Srinivas SP, Van Driessche W, Vereecke J, Himpens B (2005) ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 46: Sanchez HA, Orellana JA, Verselis VK, Saez JC (2009) Metabolic inhibition increases activity of connexin-32 hemichannels permeable to Ca 2+ in transfected HeLa cells. Am J Physiol Cell Physiol 297: C665- -C Locovei S, Bao L, Dahl G (2006) Pannexin 1 in erythrocytes: function without a gap. Proc Natl Acad Sci USA 103: Johnstone S, Isakson B, Locke D (2009) Biological and biophysical properties of vascular connexin channels. Int Rev Cell Mol Bio 278: de Wit C, Roos F, Bolz SS, Kirchhoff S, Kruger O, Willecke K (2000) Impaired conduction of vasodilation along arterioles in connexin40-deficient mice. Circ Re 86: Isakson BE (2008) Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca 2+ communication. J Cell Sci 121: Nishiyama A, Rahman M, Inscho EW (2004) Role of interstitial ATP and adenosine in the regulation of renal hemodynamics and microvascular function. Hypertens Res 27: Toma I, Bansal E, Meer EJ, Kang JJ, Vargas SL, Peti-Peterdi J (2008) Connexin 40 and ATPdependent intercellular calcium wave in renal glomerular endothelial cells. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294: R1769-R Bodin P, Burnstock G (1995) Synergistic effect of acute hypoxia on flow-induced release of ATP from cultured endothelial cells. Experientia 51: Bao X, Altenberg GA, Reuss L (2004) Mechanism of regulation of the gap junction protein connexin 43 by protein kinase C-mediated phosphorylation. Am J Physiol Cell Physiol 286: C647-C Robertson J, Lang S, Lambert PA, Martin PE (2010) Peptidoglycan derived from Staphylococcus epidermidis induces Connexin43 hemichannel activity with consequences on the innate immune response in endothelial cells. Biochem J 432: Ley K, Miller YI, Hedrick CC (2011) Monocyte and macrophage dynamics during atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 31: da Silva CG, Specht A, Wegiel B, Ferran C, Kaczmarek E (2009) Mechanism of purinergic activation of endothelial nitric oxide synthase in endothelial cells. Circulation 119: Umapathy NS, Fan Z, Zemskov EA, Alieva IB, Black SM, Verin AD (2010) Molecular mechanisms involved in adenosine-induced endothelial cell barrier enhancement. Vasc Pharmacol 52: Erlinge D, You J, Wahlestedt C, Edvinsson L (1995) Characterisation of an ATP receptor mediating mitogenesis in vascular smooth muscle cells. Eur J Pharmacol 289: Lu D, Soleymani S, Madakshire R, Insel PA (2012) ATP released from cardiac fibroblasts via connexin hemichannels activates profibrotic P2Y 2 receptors. FASEB J 26: Panchin Y, Kelmanson I, Matz M, Lukyanov K, Usman N, Lukyanov S (2000) A ubiquitous family of putative gap junction molecules. Curr Biol 10: R473-R Ambrosi C, Gassmann O, Pranskevich JN, Boassa D, Smock A, Wang J (2010) Pannexin1 and Pannexin2 channels show quaternary similarities to connexons and different oligomerization numbers from each other. J Biol Chem 285: Sosinsky GE, Boassa D, Dermietzel R, Duffy HS, Laird DW, MacVicar B (2011) Pannexin channels are not gap junction hemichannels. Channels (Austin) 5: Penuela S, Bhalla R, Nag K, Laird DW (2009) Glycosylation regulates pannexin intermixing and cellular localization. Mol Biol Cell 20: Bruzzone R, Barbe MT, Jakob NJ, Monyer H (2005) Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J Neurochem 92: Bao L, Locovei S, Dahl G (2004) Pannexin membrane channels are mechanosensitive conduits for ATP. FEBS Lett 572: Billaud M, Lohman AW, Straub AC, Looft-Wilson R, Johnstone SR, Araj CA, Best AK, Chekeni FB, Ravichandran KS, Penuela S (2011) Pannexin1 regulates a1-adrenergic receptor- mediated vasoconstriction. Circ Res 109: Godecke S, Roderigo C, Rose CR, Rauch BH, Godecke A, Schrader J (2012) Thrombin-induced ATP release from human umbilical vein endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 302: C915-C Chekeni FB, Elliott MR, Sandilos JK, Walk SF, Kinchen JM, Lazarowski ER (2010) Pannexin 1 channels mediate find-me signal release and membrane permeability during apoptosis. Nature 467: Woehrle T, Yip L, Elkhal A, Sumi Y, Chen Y, Yao Y (2010) Pannexin-1 hemichannelmediated ATP release together with P2X 1 and P2X 4 receptors regulate T-cell activation at the immune synapse. Blood 116: Iwabuchi S, Kawahara K (2011) Functional significance of the negative-feedback regulation of ATP release via pannexin-1 hemichannels under ischemic stress in astrocytes. Neurochem Int 58: Farrell AW, Gadeock S, Pupovac A,Wang B, Jalilian I, Ranson M (2010) P2X 7 receptor activation induces cell death and CD23 shedding in human RPMI 8226 multiple myeloma cells. Biochim Biophys Acta 1800: Sridharan M, Adderley SP, Bowles EA, Egan TM, Stephenson AH, Ellsworth ML (2011) Pannexin 1 is the conduit for low oxygen tension-induced ATP release from human erythrocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol 299: H1146-H Sprague RS, Stephenson AH, Bowles EA, Stumpf MS, Lonigro AJ (2006) Reduced expression of Gi in erythrocytes of humans with type 2 diabetes is associated with impairment of both camp generation and ATP release. Diabetes 55: Abraham EH, Okunieff P, Scala S, Vos P, Oosterveld MJ, Chen AY (1997) Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and adenosine triphosphate. Science 275: Billaud M, Sandilos JK, Isakson BE (2012) Pannexin 1 in the regulation of vascular tone. Trends Cardiovasc Med 22: Lohman AW, Billaud M, Straub AC, Johnstone SR, Best AK, Lee MY (2012) Expression of pannexin isoforms in the systemic murine arterial network. J Vasc Res. 49: D Hondt C, Ponsaerts R, De Smedt H, Bultynck G, Himpens B (2009) Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions? BioEssays 31: Gordon EL, Pearson JD, Slakey LL (1986) The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J Biol Chem 261: Banz Y, Beldi G, Wu Y, Atkinson B, Usheva A, Robson SC (2008) CD39 is incorporated into plasma microparticles where it maintains functional properties and impacts endothelial activation. Br J Haematol 142:

18 97. Yegutkin GG, Wieringa B, Robson SC, Jalkanen S (2012) Metabolism of circulating ADP in the bloodstream is mediated via integrated actions of soluble adenylate kinase-1 and NTPDase1/CD39 activities. FASEB J 26: Kauffenstein G, Drouin A, Thorin-Trescases N, Bachelard H, Robaye B, D Orleans-Juste P (2010) NTPDase1 (CD39) controls nucleotide-dependent vasoconstriction in mouse. Cardiovasc Res 85: Goepfert C, Imai M, Brouard S, Csizmadia E, Kaczmarek E, Robson SC (2000) CD39 modulates endothelial cell activation and apoptosis. Mol Med 6: Drosopoulos JH, Kraemer R, Shen H, Upmacis RK, Marcus AJ, Musi E (2010) Human solcd39 inhibits injury-induced development of neointimal hyperplasia. Thromb Haemost 103: Kauffenstein G, Fürstenau CR, D Orléans-Juste P, Sévigny J (2010) The ectonucleotidase NTPDase1 differentially regulates P2Y 1 and P2Y 2 receptordependent vasorelaxation. Br J Pharmacol 159: Niemelä J, Henttinen T, Yegutkin GG, Airas L, Kujari AM, Rajala P, Jalkanen S (2004) IFN-a induced adenosine production on the endothelium: a mechanism mediated by CD73 (ecto-59-nucleotidase) up-regulation. J Immunol 172: Osman L, Amrani M, Ilsley C, Yacoub MH, Smolenski RT (2008) Atorvastatin accelerates extracellular nucleotide degradation in human endothelial cells. Mol Cell Biochem 308: Khalpey Z, Yuen AH, Kalsi KK, Kochan Z, Karbowska J, Slominska EM, Forni M, Macherini M, Bacci ML, Batten P (2005) Loss of ecto-59nucleotidase from porcine endothelial cells after exposure to human blood: Implications for xenotransplantation. Biochim Biophys Acta 1741: Quillen EE, Haslam GC, Samra HS, Amani-Taleshi D, Knight JA, Wyatt DE, Bishop SC, Colvert KK, Richter ML, Kitos PA (2006) Ectoadenylate kinase and plasma membrane ATP synthase activities of human vascular endothelial cells. J Biol Chem 281: Kaczmarek E, Koziak K (2011) Targeting stenosis with nucleotide-hydrolyzing enzymes. Curr Pharm Biotechnol 12: Raqeeb A, Sheng J, Ao N, Braun AP (2011) Purinergic P2Y 2 receptors mediate rapid Ca 2+ mobilization, membrane hyperpolarization and nitric oxide production in human vascular endothelial cells. Cell Calcium 49: Wang L, Karlsson L, Moses S, Hultgårdh-Nilsson A, Andersson M, Borna C, Gudbjartsson T, Jern S, Erlinge D (2002) P2 receptor expression profiles in human vascular smooth muscle and endothelial cells. J Cardiovasc Pharmacol 40: Webb TE, Feolde E, Vigne P, Neary JT, Runberg A, Frelin C, Barnard EA (1996) The P2Y purinoceptor in rat brain microvascular endothelial cells couple to inhibition of adenylate cyclase. Br J Pharmacol 119: Wei WL, He H, Guan YY (2003) Characteristic of Cl- current induced by ATP in bovine aortic endothelial cells. Drug Dev Res 58: You J, Golding EM, Bryan RM Jr (2005) Arachidonic acid metabolites, hydrogen peroxide, and EDHF in cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol 289: H1077-H Hechler B, Gachet C (2011) P2 receptors and platelet function. Purinergic Signal 7: Hess CN, Kou R, Johnson RP, Li GK, Michel T (2009) ADP signaling in vascular endothelial cells: ADP-dependent activation of the endothelial isoform of nitricoxide synthase requires the expression but not the kinase activity of AMPactivated protein kinase. J Biol Chem 284: da Silva CG, Jarzyna R, Specht A, Kaczmarek E (2006) Extracellular nucleotides and adenosine independently activate AMP-activated protein kinase in endothelial cells: involvement of P2 receptors and adenosine transporters. Circ Res 98: e39-e Purkiss JR, Boarder MR (1992) Stimulation of phosphatidate synthesis in endothelial cells in response to P2-receptor activation. Evidence for phospholipase C and phospholipase D involvement, phosphatidate and diacylglycerol interconversion and the role of protein kinase C. Biochem J 287: Hashmi-Hill MP, Sandock K, Bates JN, Robertson TP, Lewis SJ (2007) Flavin adenine dinucleotide may release preformed stores of nitrosyl factors from the vascular endothelium of conscious rats. J Cardiovasc Pharmacol 50: Korda A, Guns PJD, Crauwels HM, Van Hove CE, Holvoet P, Bult H (2005) Endothelium-dependent relaxation by purinergic receptors in the aorta of apolopoprotein E-deficient mice. Fundam Clin Pharmacol 19: Kirby BS, Crecelius AR, Voyles WF, Dinenno FA (2010) Vasodilatory responsiveness to adenosine triphosphate in ageing humans. J Physiol 588: Alefishat E, Alexander SPH, Ralevic V (2013) Antagonism of P2Y 1 -induced vasorelaxation by acyl CoA: a critical role for palmitate and 39-phosphate. Br J Pharmacol 68: Tanaka N, Kawasaki K, Nejime N, Kubota Y, Nakamura K, Kunitomo M, Takahashi K, Hashimoto M, Shinozuka K (2004) P2Y receptor-mediated Ca 2+ signaling increases human vascular endothelial cell permeability. J Pharmacol Sci 95: Sanabria P, Ross E, Ramírez E, Colón K, Hernández M, Maldonado HM, Silva I, Jiménez-Rivera CA, González FA (2008) P2Y 2 receptor desensitization on single endothelial cells. Endothelium 15: Jacobson JR, Dudek SM, Singleton PA, Kolosova IA, Verin AD, Garcia JG (2006) Endothelial cell barrier enhancement by ATP is mediated by the small GTPase Rac and cortactin. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 291: L289-L Härtel FV, Rodewald CW, Aslam M, Gündüz D, Hafer L, Neumann J, Piper HM, Noll T (2007) Extracellular ATP induces assembly and activation of the myosin light chain phosphatase complex in endothelial cells. Cardiovasc Res 74: Ray FR, Huang W, Slater M, Barden JA (2002) Purinergic receptor distribution in endothelial cells in blood vessels: a basis for selection of coronary artery grafts. Atherosclerosis 162: Glass R, Loesch A, Bodin P, Burnstock G (2002) P2X 4 and P2X 6 receptors associate with VE-cadherin in human endothelial cells. Cell Mol Life Sci 59: Yamamoto K, Sokabe T, Matsumoto T, Yoshimura K, Shibata M, Ohura N, Fukuda T, Sato T, Sekine K, Kato S, Isshiki M, Fujita T, Kobayashi M, Kawamura K, Masuda H, Kamiya A, Ando J (2006) Impaired flow-dependent control of vascular tone and remodeling in P2X 4 -deficient mice. Nat Med 12: Harrington LS, Mitchell JA (2004) Novel role for P2X receptor activation in endothelium-dependent vasodilation. Br J Pharmacol 143: Harrington LS, Evans RJ, Wray J, Norling L, Swales KE, Vial C, Ali F, Carrier MJ, Mitchell JA (2007) Purinergic 2X1 receptors mediate endothelial dependent vasodilation to ATP. Mol Pharmacol 72: Korenaga R, Yamamoto K, Ohura N, Sokabe T, Kamiya A, Ando J (2001) Sp1-mediated downregulation of P2X 4 receptor gene transcription in endothelial cells exposed to shear stress. Am J Physiol Heart Circ Physiol 280: H2214-H Wilson HL, Varcoe RW, Stokes L, Holland KL, Francis SE, Dower SK, Surprenant A, Crossman DC (2007) P2X receptor characterization and IL-1/IL-1Ra release from human endothelial cells. Br J Pharmacol 151: Ray CJ, Marshall JM (2006) The cellular mechanisms by which adenosine evokes release of nitric oxide from rat aortic endothelium. J Physiol 570: Auchampach JA (2007) Adenosine receptors and angiogenesis. Circ Res 101: Feoktistov I, Ryzhov S, Goldstein AE, Biaggioni I (2003) Mast cell-mediated stimulation of angiogenesis: cooperative interaction between A2B and A3 adenosine receptors. Circ Res 92: Grant MB, Tarnuzzer RW, Caballero S, Ozeck MJ, Davis MI, Spoerri PE, Feoktistov I, Biaggioni I, Shryock JC, Belardinelli L (1999) Adenosine receptor activation induces vascular endothelial growth factor in human retinal endothelial cells. Circ Res 85: Postępy Biochemii 60 (4)

19 135. Wiktorowska-Owczarek A, Namiecinska M, Balcerczyk A, Nowak JZ (2007) Human micro- and macrovessel-derived endothelial cells: a comparative study on the effects of adrenaline and a selective adenosine A2-type receptor agonist under normoxic and hypoxic conditions. Pharmacol Rep 59: Khoa ND, Williams AJ, Montesinos MC, Reiss AB, Cronstein BN (2003) Cytokines regulate adenosine receptors and their downstream signaling elements in human microvascular endothelial cells. Arth Rheum 48: S470-S Thakur S, Du J, Hourani S, Ledent C, Li JM (2010) Inactivation of adenosine A2A receptor attenuates basal and angiotensin II-induced ROS production by Nox2 in endothelial cells. J Biol Chem 285: Henttinen T, Jalkanen S, Yegutkin GG (2003) Adherent leukocytes prevent adenosine formation and impair endothelial barrier function by Ecto-59- nucleotidase/cd73-dependent mechanism. J Biol Chem 278: Devaux Y, Bousquenaud M, Rolland-Turner M, Maskali F, Zhang L, Marie PY, Azuaje F, Wagner DR (2012) Systems-based investigation of the effects of adenosine on endothelial progenitor cells. Cardiovasc Res 93 (Suppl): S Fernandez P, Jara C, Aguilera V, Caviedes L, Diaz F, Radojkovic C, Veas C, Lamperti L, Escudero C, Aguayo C (2012) Adenosine A2A and A3 receptors are involved in the human endothelial progenitor cells migration. J Cardiovasc Pharmacol 59: Inscho EW, Cook AK, Imig JD (2004) Renal autoregulation in P2X 1 knockout mice. Acta Physiol Scand 181: Schluter H, Offers E, Brüggemann G, van der Giet M, Tepel M, Nordhoff E, Karas M, Spieker C, Witzel H, Zidek W (1994) Diadenosine phosphates and the physiological control of blood pressure. Nature 367: Hollah P, Hausberg M, Kosch M (2001) A novel assay for determination of diadenosine polyphosphates in human platelets: studies in normotensive subjects and in patients with essential hypertension. J Hypertens 19: Jankowski V, Tölle M, Vanholder R, Schönfelder G, van der Giet M, Henning L, Schlüter H, Paul M, Zidek W, Jankowski J (2005) Uridine adenosine tetraphosphate: a novel endothelium- derived vasoconstrictive factor. Nat Med 11: Hashimoto M, Shinozuka K, Shahdat HM, Kwon YM, Tanabe Y, Kunitomo M, Masumura S (1998) Antihypertensive effect of all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoate of aged rats is associated with an increase in the release of ATP from the caudal artery. J Vasc Res 35: Karoon P, Burnstock G (1998) Reduced sympathetic noradrenergic neurotransmission in the tail artery of Donryu rats fed with high cholesterol-supplemented diet. Br J Pharmacol 123: Hansson GK (2005) Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med 352: Wang L, Jacobsen SE, Bengtsson A, Erlinge D (2004) P2 receptor mrna expression profiles in human lymphocytes, monocytes and CD34+ stem and progenitor cells. BMC Immunol 5: Ferrari D, Chiozzi P, Falzoni S, Dal Susino M, Melchiorri L, Baricordi OR, Di Virgilio F (1997) Extracellular ATP triggers IL-1β release by activating the purinergic P2Z receptor of human macrophages. J Immunol 159: Suzuki T, Hide I, Ido K (2004) Production and release of neuroprotective tumor necrosis factor by P2X 7 receptor-activated microglia. J Neurosci 24: Schmid-Antomarchi H, Schmid-Alliana A, Romey G, Ventura MA, Breittmayer V, Millet MA, Husson H, Moghrabi B, Lazdunski M, Rossi B (1997) Extracellular ATP and UTP control the generation of reactive oxygen intermediates in human macrophages through the opening of a charybdotoxin-sensitive Ca 2+ -dependent K + channel. J Immunol 159: Duhant X, Schandené L, Bruyns C, Gonzalez NS, Goldman M, Boeynaems JM, Communi D (2002) Extracellular adenine nucleotides inhibit the activation of human CD4+ T lymphocytes. J Immunol 169: Duarte MM, Loro VL, Rocha JB, Leal DB, Bem AF, Dorneles A, Morsch VM, Schetinger MR (2007) Enzymes that hydrolyze adenine nucleotides of patients with hypercholesterolemia and inflammatory processes. FEBS J 274: Robson SC, Enjyoji K, Goepfert C, Imai M, Kaczmarek E, Lin Y, Sévigny J, Warny M (2001) Modulation of extracellular nucleotide-mediated signaling by CD39/nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1. Drug Dev Res 53: Sarafoff N, Byrne RA, Sibbing D (2012) Clinical use of clopidogrel. Curr Pharm Des 18: Sitkovsky MV, Lukashev D, Apasov S, Kojima H, Koshiba M, Caldwell C, Ohta A, Thiel M (2004) Physiological control of immune response and inflammatory tissue damage by hypoxia-inducible factors and adenosine A 2A receptors. Annu Rev Immunol 22: Ralevic V, Hoyle CHV, Burnstock G (1995) Pivotal role of phosphate chain length in vasoconstrictor versus vasodilator actions of adenine dinucleotides in rat mesenteric arteries. J Physiol 483: Nilsson J, Nilsson LM, Chen YW, Molkentin JD, Erlinge D, Gomez MF (2006) High glucose activates nuclear factor of activated T cells in native vascular smooth muscle. Arterioscler Thromb Vasc Biol 26: Schuchardt M, Tölle M, van der Giet M (2012) P2Y purinoceptors as potential emerging therapeutical target in vascular disease. Curr Pharm Des 18: Involvement of nucleotide receptors in the regulation of vascular function Zofia Magier, Robert Jarzyna Department of Metabolic Regulation, Institute of Biochemistry, Faculty of Biology, University of Warsaw, 1 Miecznikowa St., Warsaw, Poland rjarzyna@biol.uw.edu.pl Key words: nucleotide receptors, adenosine receptors, endothelium, vascular smooth muscle ABSTRACT A novel function of ATP as a signal molecule was described nearly 50 years ago. Since then many receptors that could be activated via ATP, ADP, UTP, UDP and adenozine binding were discovered. The mechanism of signal transduction as well as quite complicated regulation of changes of extracellular nucleotides concentration is currently studied. Purinergic signaling in blood vessels is mostly engaged in vascular tone regulation thus maintaining proper blood pressure. ATP coreleased with noradrenaline from perivascular sympathetic nerves cause vasoconstriction whereas ATP in blood vessel lumen stimulate endothelial cells to release endothelium derived relaxing factor. Nucleotides and nucleosides contributes also to growth and differention of new blood vessels. Changes in purinergic signaling is commonly observed in cardiovascular diseases that plague our times, that is why nucleotide receptors seems to be good pharmacological target