Hemolizyny bakteryjne. Bacterial hemolysins

Transkrypt

1 Radosław Stachowiak i Jacek Bielecki Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Warszawa, Nowy Świat 67. Hemolizyny bakteryjne 1. Wstęp. 2. Właściwości fizyczne i biochemiczne. 3. Regulacja aktywności. 4. Molekularny mechanizm działania. 5. Efekty działania toksyn na żywe komórki. 6. Udział w patogenezie. 7. Zastosowanie. 8. Podsumowanie. Bacterial hemolysins 1. Introduction. 2. Physical and biochemical properties. 3. Regulation of activity. 4. Molecular mechanism of action. 5. Effects of toxins action upon living cells. 6. Role in pathogenesis. 7. Applications. 8. Summary. Abstract Hemolysins also known as cytolysins are a group of pore-forming proteins capable of disruption of eucariotic cell s membrane. This group consists of the following families: the largest one is called thiol-activated hemolysins and includes toxins produced by a variety of Gram-positive bacteria. The second family named RTX toxins is also well known. All members of this family are secreted by Gram-negative bacteria. The rest of hemolysins are grouped in smaller and recently formed families. Two of them include proteins produced by micro-organisms that belong to only one genus: Serratia and Vibrio. The last of the revised types is β-barrel family. Proteins with this characteristic structural motif can be found in both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Every type has some unique biochemical and physical properties. Despite these differences all cytolysins have one thing in common. Although they differ in molecular mechanism of cytolysis all hemolysins share the same mode of action. Process of lysis is two-phased: the first step is independent from environmental conditions required for full cytolytic activity, that is toxin association with cell surface. The second phase is a major step of cytolysis strongly relaying on proper biochemical conditions. These biochemical conditions are needed for correct changes of protein conformation leading to polymerisation and pore formation. Discussed proteins are not only capable of cytolysis. They also possess the ability to influence functioning of host s defence system. Evasion of immune response is a great opportunity for pathogen. 1. Wstęp 1

2 Hemolizyny są egzotoksynami zdolnymi do tworzenia por w błonie komórek eukariotycznych. Jednak na wstępie należy zaznaczyć, że określenie hemolizyny jest niezbyt precyzyjne, ponieważ sugeruje, że białka te są zdolne jedynie do lizy erytrocytów. Tymczasem hemolizyny są toksynami o małej specyficzności, zdolnymi do uszkadzania większości komórek eukariotycznych. Dlatego też właściwsza jest druga nazwa tej rodziny białek, cytolizyny. Określenie hemolizyny pochodzi od najbardziej charakterystycznej aktywności biologicznej tych toksyn, dzięki której zostały odkryte. Liza erytrocytów jest nadal najłatwiejszym i najpowszechniej stosowanym sposobem wykrywania i badania aktywności hemolizyn i jest też jedną z niewielu właściwości wspólnych dla wszystkich białek z tej rodziny. Dlatego też ta grupa białek jest nadal najczęściej nazywana hemolizynami, chociaż w świetle obecnej wiedzy na temat ich wpływu na żywe komórki, nazwa ta odnosi się raczej do ich właściwości spotykanych w laboratorium. Początkowe trudności w zrozumieniu mechanizmu działania hemolizyn wynikały ze słusznego poza tym przypadkiem stwierdzenia, że białka rozpuszczalne mają hydrofilną powierzchnię i hydrofobowy rdzeń. Białka transbłonowe natomiast cechują się niepolarną powierzchnią dzięki której mogą funkcjonować we wnętrzu błon cytoplazmatycznych. Zatem należało wyjaśnić w jaki sposób rozpuszczalne białko może dokonać penetracji pozornie dla niego niedostępnej błony? Odpowiadając na to pytanie poznano przyczyny tego zjawiska. Polega ono na tym, że monomeryczne, hydrofilne białko zmienia swoją konformację tworząc polimeryczne układy o hydrofobowej naturze. Pierwszymi odkrytymi białkami zdolnymi do tworzenia por w błonie były składniki układu dopełniacza. Dzięki temu przełomowemu odkryciu zaczęto szukać innych białek o podobnym mechanizmie działania, po czym wkrótce stwierdzono podobne właściwości dla hemolizyny bakteryjnej, α-toksyny Staphylococcus aureus. Większość hemolizyn jest wytwarzana przez bakterie Gram-dodatnie, głównie przez bakterie należące do rodzin Bacillaceae, Streptococcaceae i Lactobacillaceae [1, 9, 18, 55, 56]. Prawie wszystkie cytolizyny bakterii Gram-dodatnich należą do najliczniejszej i wciąż powiększającej się rodziny hemolizyn aktywowanych przez grupy tiolowe. Grupa ta jest reprezentowana przez streptolizynę, toksynę Streptococcus pyogenes. Warto również wymienić hemolizynę Clostridium perfringens, nazwaną jak większość białek z tej grupy od nazwy gatunkowej bakterii z której pochodzi, perfringolizyną. Jest ona również dobrze opisana zarówno pod względem strukturalnym jak i funkcjonalnym i wraz z streptolizyną stanowi model do badań nad mechanizmem działania tej grupy cytolizyn. α-toksyna S. 2

3 aureus nie należy do hemolizyn aktywowanych przez grupę SH, i jak się okazało prezentuje nie tylko odmienne właściwości biochemiczne, ale również inny mechanizm perforacji błon cytoplazmatycznych. Do niedawna uważano ją za unikalną cytolizynę bakterii Gramdodatnich, która nie należy do rodziny hemolizyn aktywowanych przez ugrupowania tiolowe. Jednak po dokładnym poznaniu struktury α-toksyny S. aureus [59] okazało się, że jest ona podobnie zbudowana jak aerolizyna, toksyna Aeromonas hydrophila. Obie wyżej wspomniane cytolizyny zawierają domenę strukturalną przypominającą wyglądem beczkę, nazywaną β baryłką. Od tej charakterystycznej domeny strukturalnej powstała nazwa dla nowo utworzonej rodziny β baryłek. Do tej rodziny należą też prawdopodobnie α toksyna Clostridium septicum oraz cytotoksyna Pseudomonas aureginosa [59]. Zatem α-toksyna S. aureus nie jest pojedynczym przypadkiem, lecz członkiem niewielkiej rodziny, która prawdopodobnie będzie się powiększać wraz z poznawaniem kolejnych struktur cytotoksyn. Warto zaznaczyć, iż rodzina β baryłek jest jedyną, do której przyporządkowano cytolizyny wytwarzane zarówno przez bakterie Gram-dodatnie jak i Gram-ujemne. Poza tą grupą rozgraniczenie to w przypadku hemolizyn nadal obowiązuje, ponieważ większość cytolizyn bakterii Gram-ujemnych tworzy dość jednorodną rodzinę toksyn RTX. Nazwa ta jest skrótem od angielskiego określenia toksyny z powtórzeniami (ang. repeats in toxin), ponieważ charakterystyczną cechą tych białek są właśnie powtórzenia w sekwencji aminokwasów. Grupa ta jest reprezentowana przez hemolizynę E. coli, doskonale scharakteryzowaną pod względem genetycznym. Natomiast budowa i mechanizm perforacji błony komórkowej tej grupy toksyn nie jest zbyt dobrze poznany, w odróżnieniu od pozostałych rodzin cytolizyn. Toksyny RTX są wytwarzane również przez bakterie z rodzajów; Pasteurella, Actinobacillus, Bordetella, Proteus i Morganella [3, 28, 39, 66]. Wśród hemolizyn bakterii Gram-ujemnych wyróżnia się jeszcze dwie pomniejsze rodziny. Pierwszą z nich stanowią cytolizyny syntetyzowane przez Vibrio sp [15, 31, 34, 68]. Najlepiej scharakteryzowana są toksyny produkowane przez V. cholerae. Biotyp El Tor (należący do serotypu O1) wydziela cytolizynę nazwaną odpowiednio El Tor. Natomiast niecholeragenne szczepy V. cholerae wytwarzają cytolizynę określaną w skrócie VCC. Do hemolitycznych gatunków należą także V. parahaemolyticus oraz V. vulnificus. Hemolizyna Serratia marcescens reprezentuje ostatnią z omawianych rodzin [8]. Podobnie jak w poprzednim przypadku, ta rodzina składa się z hemolizyn wytwarzanych przez bakterie należące do tylko jednego rodzaju. Występowanie cytolizyn nie jest ograniczone wyłącznie do bakterii. Znajdujemy coraz to nowe hemolizyny wytwarzane przez organizmy eukariotyczne, nawet przez zwierzęta 3

4 kręgowe. Posiadają one inne właściwości biochemiczne i zapewne odmienny mechanizm działania i chociaż ich wytwarzanie jest niewątpliwie ciekawym zjawiskiem, nie stanowią przedmiotu niniejszego opracowania. 2. Właściwości fizyczne i biochemiczne Rodzina hemolizyn aktywowanych przez grupy tiolowe jest najliczniejsza ze wszystkich opisanych. Pomimo swej liczebności cechuje się dużą jednorodnością. Najbardziej charakterystyczną właściwością tej grupy jest wzrost aktywności w wyniku kontaktu z odczynnikami redukującymi zawierającymi grupę SH [25]. Do takich związków należą cysteina i β-merkaptoetanol. Hemolizyny aktywowane przez grupy tiolowe zawdzięczają swoją nazwę cysteinie, zawsze obecnej w cząsteczce białka omawianej rodziny. Ten właśnie aminokwas zawierający grupę SH w formie zredukowanej był uznawany za czynnik aktywujący toksynę. Obecnie wiadomo, że obecność grupy SH nie jest tak istotna dla aktywności cytolizyn z tej rodziny (problem zostanie szczegółowo omówiony w dalszej części rozdziału). Jednak nazwa-hemolizyny aktywowane przez grupy tiolowe-jest nadal stosowana. Tlen i kationy dwuwartościowe są inhibitorami tych cytolizyn [65]. Hemolizyny z tej rodziny posiadają zdolność tworzenia trwałych kompleksów z cholesterolem, oraz z blisko spokrewnionymi sterolami. Stereospecyficzność tej interakcji jest wysoka, ponieważ większość modyfikacji w cząsteczce cholesterolu uniemożliwia połączenie z hemolizyną. Ta właściwość wpływa na specyficzność cytolizy. Jedynie komórki zawierające cholesterol w błonie cytoplazmatycznej ulegają lizie [25]. Hemolizyna przyłącza się do cholesterolu zawartego w błonie komórki, po czym polimeryzuje tworząc pory. Błony komórek bakteryjnych nie zawierają lipidów rozpoznawanych przez cytolizyny. Zapewnia im to odporność na toksyny, które same wydzielają. Hemolizyny są zdolne do wiązania steroli bez względu na to, czy są one zintegrowane z błoną, czy też są rozpuszczone. Dlatego też inkubacja cytolizyn z cholesterolem powoduje trwałą inhibicję toksyny [1]. Wspólną właściwością dla prawie wszystkich hemolizyn jest termolabilność. W temperaturze powyżej 45 o C następuje ich szybka i nieodwracalna inaktywacja. Masa cząsteczkowa białka monomerycznego hemolizyn z tej grupy waha się od 50 do 80 kda. Różnice w masie wynikają przede wszystkim ze zmiennej długości amino-terminalnego regionu tych białek. Analiza 450 aminokwasów licząc od C-końca ujawnia bardzo dużą homologię sekwencji, od 40 do 70%. Właśnie w karboksy-terminalnym regionie znajduje się wysoce konserwatywny undekapeptyd o sekwencji ECTGLAWEWWR [33]. Zawiera on aż trzy reszty tryptofanu, 4

5 niezbędne do prawidłowego funkcjonowania tego białka. Ich rola została poznana poprzez analizę mutacji punktowych. Dokonano substytucji tryptofanu na fenyloalaninę w regionie konserwatywnym, jak i poza nim [55]. Mutacja we fragmencie genu kodującym konserwatywny undekapeptyd powodowała drastyczny spadek zdolności perfringolizyny do wiązania z błoną erytrocytów. Zmiany poza rejonem konserwatywnym powodowały nieznaczny spadek aktywności. Z jedenastu aminokwasów tego peptydu największą rolę przypisywano cysteinie, której obecność miała warunkować zależność omawianej rodziny hemolizyn od grup tiolowych. Właściwości nowego członka tej rodziny potwierdzały ten pogląd. Pyolizyna, toksyna Arcanobacterium pyogenes zawiera zamiast cysteiny, alaninę w konserwatywnym peptydzie, a jej aktywność nie zależy od czynników redukujących. Jednak po wymianie alaniny na cysteinę aktywność pyolizyny była nadal niezależna od grup SH [7]. Wynik ten uzupełnia się z danymi uzyskanymi w naszym laboratorium. Skonstruowano zmutowaną listeriolizynę (cytolizyna Listeria monocytogenes), w której zamiast cysteiny wstawiono alaninę. Jednak tak zmodyfikowana hemolizyna jest nadal aktywowana przez czynniki redukujące. Powyższe wyniki minimalizują rolę pojedynczego aminokwasu w aktywności całej cytolizyny. Ważniejsza jest konformacja całej domeny niż obecność czy brak konkretnego aminokwasu. Hemolizyny należące do rodziny β baryłek są produkowane przez bakterie o małym pokrewieństwie filogenetycznym. Wspólny jest tu mechanizm działania, który zostanie omówiony w rozdziale 4. Cytolizyny z rodziny β-baryłek charakteryzują się niższą masą cząsteczkową niż hemolizyny aktywowane przez grupy tiolowe. Dla α-toksyny S. aureus wynosi ona 33 kda, natomiast masa cząsteczkowa aerolizyny równa jest 52 kda. Uderzającą cechą tych hemolizyn jest brak specyficzności w oddziaływaniu z lipidami. Przyłączają się do powierzchni liposomów niezależnie od rodzaju lipidów wchodzących w skład sztucznej błony [59]. W przeciwieństwie do cytolizyn aktywowanych przez grupy tiolowe polimeryzacja toksyn z rodziny β-baryłek jest ściśle zdefiniowana. Tworzone są oligomery składające się ze stałej liczby podjednostek, zwane homomerami. Dla α-toksyny S. aureus i aerolizyny liczba ta wynosi zawsze siedem [59]. Hemolizyny aktywowane przez grupy SH polimeryzują w sposób bardziej dowolny. Tworzą heteromery, które zawierają monomerów [56, 65]. Cytolizyny bakterii Gram-ujemnych są znacznie większe od omówionych powyżej. Masa cząsteczkowa toksyn z rodziny RTX wynosi około 110 kda. Omawiane hemolizyny zawierają w swojej sekwencji powtórzenia składające się z tandemowo ułożonych nonapeptydów, bogatych w glicynę. Te krótkie sekwencje służą do wiązania jonów wapnia, 5

6 niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania toksyn RTX [3]. Natomiast kationy cynku hamują ich aktywność [3]. Do charakterystycznych motywów strukturalnych tych toksyn należy również N-terminalna domena o hydrofobowym charakterze. Z powodu dużej masy cząsteczkowej oraz wyeksponowanych fragmentów hydrofobowych, hemolizyny RTX są słabiej rozpuszczalne od białek z wyżej omówionych rodzin i wykazują silną tendencję do spontanicznej agregacji. Toksyny zawierające powtórzenia są dobrze poznane pod względem mechanizmów regulacji aktywności i specyficzności samej hemolizyny (rozdział 3). Cytolizyny produkowane przez rodzaj Vibrio tworzą bardzo nietypową klasę, chociaż są syntetyzowane przez Gram-ujemne przecinkowce, w swoich właściwościach upodabniają się do hemolizyn bakterii Gram-dodatnich. Masa cząsteczkowa hemolizyn V.cholerae wynosi 65 kda w przypadku El Tor, 63 kda dla VCC. Są to wartości typowe dla cytolizyn aktywowanych przez ugrupowania tiolowe. Podobnie jak w przypadku toksyn aktywowanych przez grupy tiolowe, aktywność hemolizyn Vibrio sp. jest hamowana przez tlen [53]. Hemolizyny rodzaju Vibrio tworzą trwałe kompleksy ze specyficznymi lipidami. Są to cholesterol i sfingolipidy [70]. Zdolność do wiązania z cholesterolem także jest wspólna z rodziną toksyn aktywowanych przez grupy SH. Jednak wspomniana podwójna specyficzność jest unikalna dla hemolizyn Vibrio. Przy czym sfingolipidy wiążą cytolizyny w większym stopniu. Z kolei sposób tworzenia oligomerów jest wspólny z grupą hemolizyn z motywem β- baryłki. Otóż w tym przypadku polimeryzacja także prowadzi do powstania homooligomerów. Tworzone przez cytolizynę V. cholerae pierścienie są pentameryczne [70]. Termostabilna hemolizyna V. parahaemolyticus zgodnie z nazwą cechuje się dużą wytrzymałością na ciepło, co jest absolutnie unikalne wśród hemolizyn. Różnice pomiędzy cytolizynami tych dwóch gatunków dotyczą również mechanizmu perforacji błony [29]. Ostatnią z omawianych klas reprezentuje hemolizyna Serratia marcescens. Zawarte tu cytolizyny rodzaju Serratia tworzą nową rodzinę [8] o nietypowych właściwościach. Toksyny z tej grupy charakteryzują się największą masą cząsteczkową z dotychczas opisanych. Masa cząsteczkowa hemolizyny S. marcescens wynosi 160 kda. Tak duże rozmiary mają wielki wpływ na właściwości omawianych białek. Już w formie monomeru są one słabo rozpuszczalne w wodzie i szybko dochodzi do ich agregacji, prowadzącej do nieodwracalnej inaktywacji. W związku z tym okres półtrwania w formie aktywnej jest bardzo krótki, wynosi zaledwie 3 minuty [27]. Nie pozostaje to bez wpływu na jej aktywność hemolityczną. Polimeryzacja i tworzenie por zachodzi niemal natychmiast, w przeciwieństwie do pozostałych rodzin. Jednak mała trwałość białka przesądza o niskiej aktywności hemolitycznej Serratia. 6

7 Powyższa charakterystyka nie obejmuje wszystkich hemolizyn bakteryjnych. Przykładowo hemolizyna Prevotella melaninogenica posiada wyróżniające ją właściwości. Głównym powodem, dla którego nie została włączona do żadnej z powyższych rodzin jest unikalna sekwencja nukleotydowa kodującego ją genu [2]. Istnieją hemolizyny sprawiające jeszcze większe problemy taksonomiczne. Gen kodujący cytolizynę Treponema denticola wykazuje znaczącą homologię do genów kodujących aminotransferazy [11]. Niektóre hemolizyny zawierają podjednostki o aktywności enzymatycznej. Powstały one najprawdopodobniej w wyniku fuzji determinujących ich wytwarzanie genów z genami odpowiednich enzymów. Toksyna AC Bordetella pertussis jest połączeniem hemolizyny RTX z eukariotyczną cyklazą adenylanową [66]. Fuzja tego typu niezwykle poszerza spektrum działania toksyny (rozdział 5). Niezwykle ciekawą toksynę wykryto u Enterococcus faecalis. Białko to składa się z dwóch podjednostek o aktywności hemolizyny i bakteriocyny. Jest to unikalna toksyna zdolna do uszkadzania błony eukariotycznej i bakteryjnej [12]. 3. Regulacja aktywności Aktywność cytolizyn zależy od czynników środowiskowych oraz od wewnętrznych mechanizmów regulacyjnych. Warunki zewnętrzne wpływają na aktywność hemolityczną przez modyfikację aktywności samego białka oraz ekspresji genu kodującego toksynę. Te dwa czynniki zazwyczaj nakładają się na siebie. Warunki optymalne dla aktywności danej hemolizyny sprzyjają również ekspresji kodującego ją genu. U bakterii Gram-ujemnych dochodzi jeszcze jeden element regulacji wewnętrznej. Cytolizyny tej grupy bakterii są zawsze wydzielane w formie nieaktywnej. Do uzyskania pełnej zdolności litycznej niezbędna jest posttranslacyjna modyfikacja przez specyficzny enzym, która polega na acylacji toksyny. Najlepiej zbadano ten mechanizm w przypadku hemolizyny E. coli. Acylacji ulegają tu dwie konserwatywne lizyny. Substytucja jednej z nich uniemożliwia pełną acylację. Tak częściowo zmodyfikowana hemolizyna jest aktywna tylko w 40%, natomiast toksyna nie poddana acylacji jest całkowicie nieaktywna biologicznie [22]. Większość cytolizyn jest zdolna do tworzenia por nie tylko w błonie erytrocytów, ale także w błonie większości komórek eukariotycznych. Istnieje jednak pewne zróżnicowanie we wrażliwości komórek eukariotycznych wobec danej cytolizyny. Każda toksyna powoduje lizę pewnego typu komórek w większym stopniu, niż pozostałych komórek. Również w obrębie danego typu komórek zaobserwowano zmienną wrażliwość, zależnie od tego, z jakiego organizmu pochodzi dana komórka [65]. Na przykład listeriolizyna powoduje lizę wszystkich komórek 7

8 eukariotycznych, ale jej działanie jest najbardziej efektywne wobec erytrocytów, a najbardziej wrażliwe na listeriolizynę są erytrocyty mysie. Zjawisko to nazywamy specyficznością aktywności cytolizyn. W przypadku toksyn RTX specyficzność hemolizy jest spowodowana selektywnym wiązaniem toksyn z powierzchnią komórek-cząsteczki hemolizyn przyłączają się efektywniej do powierzchni wybranych komórek, dzięki czemu można zaobserwować zróżnicowany poziom wrażliwości komórek na toksyny RTX [3]. Za specyficzność wiązania z błoną cytoplazmatyczną są odpowiedzialne konserwatywne fragmenty białka, zawierające dwie reszty lizyny [3, 39]. Większość toksyn RTX powoduje lizę erytrocytów, za wyjątkiem leukotoksyny wytwarzanej przez Pasteurella haemolytica, specyficznej wobec leukocytów. Wymieniając konserwatywne fragmenty pomiędzy leukotoksyną, a toksyną Bordetella Pertussis, uzyskano cytolizyny o zmienionej specyficzności działania [66]. Specyficzność hemolizyny E. coli zmodyfikowano dokonując jedynie wymiany pojedynczych aminokwasów w regionie konserwatywnym [48]. Rodzaj kwasu tłuszczowego, który ulega przyłączeniu do reszty lizyny ma wpływ na poziom aktywności toksyny, ale nie zmienia specyficzności toksyn wobec komórek docelowych [28]. Hemolizyny są najczęściej acylowane przez proste kwasy tłuszczowe takie jak kwas palmitynowy. Natomiast cytolizyna S. marcescens jest aktywowana jedynie przez fosfatydyloetanoloaminę [23]. Modyfikacja hemolizyny jest niezbędna do zajścia drugiego etapu cytolizy (rozdział 4). Prawdopodobnie grupy acylowe pełnią rolę dodatkowych ligandów podczas łączenia z powierzchnią komórek. Być może również zwiększają interakcje pomiędzy poszczególnymi monomerami, ułatwiając późniejszą polimeryzację. Główną funkcją przyłączonych kwasów tłuszczowych jest zwiększenie hydrofobowości hemolizyny, co umożliwia jej insercję wewnątrz błony cytoplazmatycznej [60]. 4. Molekularny mechanizm działania Pomimo różnych właściwości biochemicznych, hemolizyny wykazują ten sam schemat działania. Cytoliza zawsze zachodzi w dwóch etapach. Pierwszym z nich jest przyłączenie monomerów toksyny do błony komórkowej. W drugim etapie dochodzi do perforacji błony cytoplazmatycznej. Powyższe zdarzenia są wyraźnie rozdzielone w czasie. Połączenie toksyn z błoną komórkową jest błyskawiczne, następuje w ciągu kilkunastu sekund [3]. Jednak efekt działania hemolizyn jest zazwyczaj zauważalny dopiero po kilkunastu minutach. Wiązanie cytolizyn z błoną lipidową jest niezależne [3, 56, 65] od warunków fizykochemicznych wymaganych dla pełnej ich aktywności (rozdział 2). Etap ten 8

9 nie zależy również od białek regulujących aktywność hemolizyn (rozdział 3). Komórki wykazują duże zróżnicowanie wrażliwości na cytolizyny. Erytrocyty są rodzajem komórek najłatwiej ulegającym lizie. Również w obrębie jednego typu komórek stopień wrażliwości jest zmienny. Erytrocyty różnych gatunków ssaków poddane działaniu streptolizyny ulegają hemolizie w niejednakowym stopniu [65]. Zjawisko zróżnicowanej wrażliwości nie jest dokładnie wyjaśnione. Jako jedną z przyczyn podaje się specyficzność przyłączania hemolizyn do powierzchni komórek. To wyjaśnienie jest wystarczające w przypadku toksyn RTX (rozdział 3). Dla tej rodziny wykazano zależność pomiędzy stopniem hemolizy a wiązaniem różnych cytolizyn z erytrocytami [3]. Powyższa zależność nie znajduje zastosowania dla pozostałych hemolizyn. Toksyny aktywowane przez grupy SH przyłączają się do cholesterolu, który jest obecny we wszystkich komórkach eukariotycznych. Niewielkie różnice w zawartości tego lipidu w błonach poszczególnych komórek nie mogą być wytłumaczeniem dla tak wielkiego zróżnicowania wrażliwości. Cytolizyny aktywowane przez grupy tiolowe przyłączają się do wszystkich komórek. Zaobserwowano jednak, że komórki mniej wrażliwe są zdolne do usuwania monomerów toksyn ze swojej powierzchni [65]. Większe znaczenie przypisuje się jednak różnicom powstającym na etapie tworzenia por. Podobnie jest dla toksyn z motywem β-baryłki oraz wydzielanymi przez V. cholerae. Przy niskim (nanomolarnym) stężeniu cytolizyny wykazują specyficzność w stosunku do króliczych erytrocytów [68], a przy wysokim (mikromolarnym) stężeniu powodują lizę innych komórek. Nie zidentyfikowano jeszcze żadnego czynnika na powierzchni komórek odpowiedzialnego za zróżnicowaną wrażliwość komórek na aktywność cytolizyn. Po związaniu się hemolizyn z powierzchnią komórek następuje drugi etap działania tych białek. W tym momencie zaadsorbowane cząsteczki toksyn zmieniają swoją konformację. Hydrofilne dotychczas monomery ulegają przeobrażeniu w hydrofobowe cząsteczki penetrujące błonę cytoplazmatyczną. Proces ten zachodzi jedynie w odpowiednich warunkach fizykochemicznych, charakterystycznych dla danej rodziny (rozdział 2 i 3). W przeciwieństwie do poprzedniego, etap ten jest nieodwracalny. Hemolizyny tworzą pory w błonie o strukturze pierścienia poprzez polimeryzację znajdujących się na błonie monomerów. Wyjątkiem są toksyny RTX. Nie stwierdzono w ich przypadku tworzenia wspomnianych struktur. Integracji z błoną dokonują monomery. Insercja jest ograniczona do zewnętrznej warstwy błony lipidowej [44]. Obecność toksyn powoduje zmiany bocznego napięcia w błonie i powstanie por o niewielkich rozmiarach (1,5-3 nm). Włączeniu w błonę ulega blisko połowa cząsteczki, fragment N-terminalny, region środkowy zawierający powtórzenia oraz C- koniec [40]. Szczegółowy mechanizm oraz struktura toksyn RTX w trakcie interakcji z błoną 9

10 nie zostały dotychczas opisane. Zintegrowane fragmenty posiadają prawdopodobnie strukturę α helikalną [37]. Hemolizyny tworzące transbłonowe pierścienie są dużo lepiej scharakteryzowane pod tym względem. Utworzone w ten sposób pory są już widzialne w mikroskopie elektronowym. W przypadku cytolizyn aktywowanych przez grupy tiolowe obserwuje się nie tylko pełne pierścienie, powstają również łukowate struktury. Jest to wynik niekompletnej polimeryzacji cytolizyn. Toksyny z tej rodziny tworzą kompleksy o zmiennej liczbie cząstek. Istnieje jednak tendencja do tworzenia polimerów składających się z podobnej liczby molekuł. Kompletne pierścienie zawierają najczęściej około 50 monomerów [56]. Cytolizyny aktywowane przez grupy SH tworzą największe pory, o średnicy nm [56]. Dokładny opis struktury perfringolizyny [50] umożliwił wyjaśnienie mechanizmu działania tej rodziny toksyn. Na podstawie podobieństwa sekwencji uznano, że pozostałe cytolizyny aktywowane przez grupy tiolowe mają niemal identyczną budowę. Hemolizyna C. perfringens składa się z czterech domen. Największą rolę spełnia domena czwarta [58], zlokalizowana przy C-końcu. Właśnie tam znajduje się konserwatywny undekapeptyd wiążący cholesterol. Połączenie z cholesterolem rozpoczyna proces zmian konformacji białka i w efekcie jego insercję w błonę. Interkalacji dokonuje motyw β-szpilki. Ten hydrofobowy fragment toksyny atakuje błonę niczym sztylet [50, 51]. Przekształceniu ulega struktura trzeciorzędowa i C-terminalna część białka pogrąża się w błonie [50, 51]. W przypadku perfringolizyny stwierdzono działanie dwóch szpilek na każdy monomer. Te motywy dokonujące inwazji powstają z sześciu α heliks [25]. Zatem mamy tu do czynienia ze znaczącymi zmianami w strukturze drugorzędowej. Trudno powiedzieć, czy mechanizm działania perfringolizyny jest unikalny, czy też zmiany tego typu nie zostały jeszcze wykryte u pozostałych (słabiej poznanych pod tym względem) członków tej rodziny. Za drugim wyjaśnieniem przemawia duże podobieństwo właściwości i sekwencji hemolizyn aktywowanych przez grupy SH. W związku z powyższym powinny podzielać również wspólny mechanizm działania. Nie wiadomo dokładnie, czy toksyny polimeryzują przed [18, 65], czy po [1, 45, 46] integracji z błoną. Obecność nieaktywnych polimerów na błonie komórek odpornych na lizę sugeruje, iż insercji dokonuje kompleks cytolizyn [65]. Czynnik hamujący integrację toksyn z błoną nie został jeszcze zidentyfikowany. W polimeryzacji bierze udział domena pierwsza i czwarta, zaangażowana również w insercję. Rozpoznawany przez nią cholesterol prawdopodobnie spełnia wiele funkcji, nie tylko warunkuje przyłączanie toksyn, ale także penetrację błony [33, 50], a może nawet polimeryzację i stabilizację utworzonych pierścieni [50]. Zaadsorbowane hemolizyny zaczynają się poruszać w błonie, 10

11 albo po jej powierzchni łącząc się ze sobą dzięki oddziaływaniom niekowalencyjnym. Niedawno odkryta zdolność cytolizyn do spontanicznej polimeryzacji w roztworze [18] uzasadnia model insercji uformowanego pierścienia w błonę. Na poparcie teorii polimeryzacji w błonie przytaczane są następujące argumenty: Produkty niekompletnej polimeryzacji, czyli łukowate struktury mogą dalej polimeryzować, powodując dynamiczne zmiany w błonie cytoplazmatycznej [45]. Zmiany konformacyjne monomeru podczas wiązania z błoną sugerują allosteryczną aktywację, dzięki której możliwa staje się polimeryzacja [1, 46]. Jest całkiem prawdopodobne, że obie hipotezy są prawdziwe i tworzenie pierścieni może zachodzić zarówno ponad, jak i wewnątrz błony cytoplazmatycznej. Mechanizm działania hemolizyn V. cholerae i cytolizyn z rodziny β-baryłek jest prawdopodobnie zbliżony [68]. W ogólnym zarysie zasada działania jest podobna jak u omówionych powyżej toksyn aktywowanych przez ugrupowania tiolowe. Poniżej przedstawiono najważniejsze różnice: W tym przypadku powstają pory z udziałem homooligomerów. Hemolizyna S. aureus tworzy heptamery [59]. Natomiast cytotoksyna V. cholerae łączy się w pentamery [70]. W związku z małą liczbą cząstek budujących jeden pierścień tworzone pory są znacznie mniejsze, niż u powyżej opisanej klasy cytolizyn aktywowanych przez grupy SH. Kanał wodny zbudowany przez α toksyny mierzy w swoim najszerszym miejscu 4,6 nm [59]. Średnica por tworzonych przez VCC i El Tor wynosi od 1do 2 nm [31, 68]. W przypadku rodziny β-baryłek wiadomo, że oligomeryzacja rozpoczyna się na zewnątrz błony komórek, zarówno wrażliwych jak i opornych [57, 63]. O insercji kompleksu w błonę decyduje nieznany czynnik obecny prawdopodobnie na powierzchni komórek. W przypadku komórek wrażliwych następuje integracja pierścienia z błoną. Każdy monomer α-toksyny dokonuje inwazji przy użyciu 23 aminokwasowego odcinka o strukturze dwóch przeciwległych β-kartek [55, 59]. Fragment ten, pochodzący z centralnej części białka zagłębia się w błonie. Po niekowalencyjnym połączeniu z sąsiednimi, poprzez kooperatywne oddziaływania (zmiana konformacji jednego składnika kompleksu wymusza zmianę struktury u pozostałych), tworzy się wspomniany motyw β-baryłki. Podczas integracji z błoną kompleks przechodzi przez trzy stany pośrednie, stopniowo nabierając hydrofobowego charakteru [62]. Proces ten zależy od płynności błony białkowo-lipidowej i z tego właśnie powodu hemoliza nie zachodzi w temperaturze poniżej 4 o C [57]. Mechanizm działania hemolizyn V. cholerae nie jest tak dobrze poznany, za to interakcje z lipidami zostały opisane wyczerpująco. Jak już wspomniano, (rozdział 2) cytolizyny z rodzaju Vibrio posiadają podwójną specyficzność. Sfingolipidy, a zwłaszcza niektóre ceramidy promują adsorpcję 11

12 toksyn w większym stopniu niż cholesterol [70]. Natomiast w procesie oligomeryzacji obecność sterolu jest niezastąpiona [31]. Najsłabiej poznany jest mechanizm działania hemolizyn wydzielanych przez rodzaj Serratia. Najbardziej uderzającą cechą tej grupy białek jest zdolność do hemolizy w temperaturze blisko 0 o C. Ta niezwykła cecha wynika zapewne z ich silnej tendencji do agregacji, gdyż zmienione białka o obniżonej tendencji do polimeryzacji nie posiadają tej zdolności [27]. Tworzą one niewielkie pierścienie o wewnętrznej średnicy 2,5-3 nm. W temperaturze poniżej 4 o C, na wskutek obniżonej płynności błony, pory miały rozmiar zaledwie 1-1,5 nm [54]. 5. Efekty działania toksyn na żywe komórki Efekt działania hemolizyn na komórki zależy w głównej mierze od stężenia toksyn. W przypadku wysokiego stężenia występuje najbardziej charakterystyczny skutek aktywności cytolizyn, czyli śmierć komórki na skutek jej lizy. Przy mniejszym stężeniu powodują one zaburzenia metaboliczne. Zmiany wynikają z naruszenia integralności błony komórkowej co doprowadza komórkę do utraty homeostazy. Objawy te są zależne od rodzaju cząsteczek dla których błona cytoplazmatyczna już nie stanowi bariery. O tym decyduje rozmiar por, dlatego też te efekty są charakterystyczne dla danej rodziny hemolizyn. Do innych zmian należą zaburzenia metaboliczne niezależne od uszkodzenia błony komórkowej, wynikające z indywidualnych właściwości farmakologicznych danej toksyny. Dlatego też efekty tego typu są unikalne dla każdej hemolizyny. Powstałe w błonie komórkowej pory umożliwiają swobodne przemieszczanie się przez nią wody, jonów i molekuł o niskiej masie cząsteczkowej. Odpowiednia ilość tych por pozwala na przepływ wody w skali indukującej cytolizę. Ilość uszkodzeń błony cytoplazmatycznej letalna dla komórki zależy od wrażliwości komórki i rozmiarów transbłonowych kanałów (rozdział 4). W ekstremalnym przypadku, gdy ludzkie erytrocyty są poddane działaniu toksyn aktywowanych przez grupy tiolowe wystarczający może się okazać jeden kompleks lityczny [65]. Mechanizm cytolizy in vivo może spełniać rolę drugorzędową. Celem ataku cytolizyn są tu także pozostałe komórki, dużo odporniejsze. Do tego dochodzi mniejsza ilość toksyn oddziałujących na jedną komórkę niż w warunkach doświadczalnych. Dlatego też uważa się, że większe znaczenie praktyczne mają pozostałe, bardziej subtelne mechanizmy działania hemolizyn. Śmierć komórki może nastąpić także w przypadku działania mniejszej liczby cząsteczek toksyn. Wytworzone pory umożliwiają przepływ 12

13 kationów jednowartościowych takich jak K + i H +, powodując depolaryzację błony. Efektem końcowym jest obumarcie komórki na skutek spadku poziomu ATP [64, 69]. Hemolizyny aktywowane przez grupy SH cechuje dodatkowy mechanizm zwiększający skuteczność cytolizy. Toksyny te są zdolne do wiązania fragmentu Fc przeciwciał. Zaadsorbowane na błonie cytolizyny łączą się z przeciwciałami, bez względu na ich antygenową specyficzność. Nagromadzenie immunoglobulin na powierzchni komórek jest sygnałem do aktywacji układu dopełniacza. Białka komplementu przyłączają się do błony komórek własnego organizmu, tworząc w nich pory niezależnie od toksyn bakteryjnych [4]. Większość hemolizyn (oprócz wydzielanych przez V. cholerae) [69] indukuje przedostawanie się kationów Ca 2+ do komórki. Zwiększenie poziomu tak istotnego wewnątrzkomórkowego przekaźnika sygnału poważnie zakłóca metabolizm. Wzrasta poziom także innych mediatorów, takich jak fosforan inozytolu. Efekt końcowy jest też zależny od rodzaju komórki. Może dojść do nadprodukcji interleukin, prostaglandyn i innych czynników modulujących aktywność sąsiednich komórek [20]. Hemolizyny wywołują szereg zróżnicowanych efektów, które tylko częściowo i nie we wszystkich przypadkach mogą być wytłumaczone istnieniem transbłonowych kanałów. Tak jest w przypadku interakcji listeriolizyny z makrofagami. Hemolizyna ta indukuje zwiększoną produkcję interleukiny 1. Efekt ten jest niezależny od uszkodzenia błony makrofagów, ponieważ występuje nawet po inaktywacji cytolizyn cholesterolem [67]. Ta sama cytolizyna, umieszczona w kompleksie z MHC II na powierzchni komórek prezentujących antygen powoduje nieodwracalną inaktywację limfocytów T [14]. Hemolizyna L. monocytogenes powoduje także aktywację MAP kinazy (ang. Mitogen Activated Protein). W tym przypadku aktywność cytolityczna wpływa na reakcję komórek, ponieważ streptolizyna oraz detergent również prowadzą do aktywacji MAP kinazy [61]. Inna toksyna z rodziny aktywowanych poprzez grupy sulfhydrylowe, pneumolizyna zwiększa wydzielanie tlenku azotu przez makrofagi [9]. Omawiane w tym rozdziale cząsteczki sygnalne, w małych ilościach aktywują komórki należące do układu immunologicznego. Jednak ich nadprodukcja prowadzi do zachwiania równowagi pomiędzy poszczególnymi składowymi układu odpornościowego. Nadmierna aktywność komórek efektorowych prowadzi między innymi do przewlekłego stanu zapalnego. Aerolizyna jest zdolna do zwiększenia wewnątrz komórkowego stężenia jonów Ca 2+. Polega to na standardowym przenikaniu jonów przez pory wytworzone przez hemolizyny. Innym mechanizmem jest proces uwalniania Ca 2+ z magazynów wewnątrzkomórkowych. Proces ten jest niezależny od pierwszego, aktywowanym mediatorem jest w tym przypadku białko G [35]. Toksyna S. aureus oraz hemolizyny RTX również wywołują nadprodukcję mediatorów zapalnych, jak NO czy prostaglandyny. 13

14 Toksyny RTX wykazują jednak większą skuteczność w indukcji tych procesów [20]. Należąca do tej rodziny dwufunkcyjna toksyna B. pertussis dzięki posiadaniu dodatkowej domeny cyklazy adenylanowej odznacza się zacznie zwiększoną skutecznością. Efekty działania hemolitycznej podjednostki są widoczne dopiero po dłuższym czasie i przy większym stężeniu tego białka. Tymczasem aktywność podjednostki enzymatycznej objawia się w błyskawicznej ucieczce kationów K + z komórki. Naturalnie dwie podjednostki współdziałają ze sobą, domena cyklazy adenylanowej dostaje się do wnętrza komórki dzięki lizie błony [19]. Hemolizyna Burkholderia cepacia oddziałuje bardziej bezpośrednio na fagocyty, gdyż wywołuję ich apoptozę [30]. Cytolizyny wydzielane przez rodzaj Vibrio również nie ograniczają swej aktywności do lizy komórki. Insercja toksyny V. vulnificus w błonę komórek prowadzi do aktywacji cyklazy guanylowej [34]. Hemolizyna V. parahaemolyticus powoduje degenerację komórek poprzez dezorganizację cytoszkieletu [15]. Natomiast białko V. cholerae wywołuje wakuolizację komórek [13]. Zdolność do lizy komórek poprzez wakuolizację jest obserwowana także u hemolizyny S. marcescens [24]. Przedstawione powyżej efekty wywoływane przez cytolizyny w sublitycznych dawkach, zostały w większości odkryte w ciągu kilku ostatnich lat. Nieznane są dokładne mechanizmy odpowiedzialne za opisane powyżej reakcje komórek. W wielu przypadkach nie wiadomo, w jakim stopniu efekt działania toksyn jest zależny od istnienia transbłonowych kanałów. 6. Udział w patogenezie Hemolizyny są bardzo ważnymi determinantami patogenezy. Delecja genu cytolizyny prowadzi do znacznego spadku wirulencji, czasami nawet do jej całkowitej utraty. Tak jest w przypadku wewnątrzkomórkowego patogena, L. monocytogenes. Cytolizyna tych bakterii jest niezbędna do ich ucieczki z fagosomu do cytoplazmy. Znaczenie listeriolizyny wykazano w pracy, gdzie gen kodujący toksynę przeklonowano do Bacillus subtilis. Zupełnie awirulentna, glebowa bakteria nabrała zdolności do wzrostu wewnątrz komórek eukariotycznych [6]. Doświadczenie powtórzono także z inną hemolizyną z rodziny aktywowanych przez grupy tiolowe. Perfringolizyna również umożliwiała B. subtilis wzrost wewnątrzkomórkowy [49]. Większość bakterii chorobotwórczych nie jest całkowicie zależna od posiadania cytolizyn. Jednak ich brak prawie zawsze wpływa ujemnie na wirulencję mikroorganizmu. Jest to związane z możliwościami, jakie stwarza patogenowi posiadanie hemolizyny. Wykraczają one znacznie poza cytotoksyczność (rozdział 5). Naturalnie wspomniany proces nie jest bez znaczenia. Cytoliza prowadzi do uszkodzenia tkanki, w której namnaża się patogen. Skutkiem 14

15 są objawy chorobowe, zależne od rodzaju zakażonej tkanki. Sam proces hemolizy prowadzi do uwolnienia z erytrocytów żelaza zawartego w hemoglobinie. Limitowane stężenie tego pierwiastka jest jedną z przeszkód, jakie napotyka bakteria chorobotwórcza. Dlatego też zdobycie żelaza zwiększa szansę pasożytniczego mikroorganizmu na przeżycie. Najgroźniejszym jednak wrogiem patogena jest układ immunologiczny. Odpowiednio do sytuacji zadaniem o największym priorytecie dla bakterii jest uniknięcie ataku ze strony układu odpornościowego. Jak wykazały badania przeprowadzone w ciągu ostatnich kilku lat, w tej działalności uczestniczą również cytolizyny. Indukując zwiększone wydzielanie różnego rodzaju cząsteczek sygnalnych zakłócają poprawne funkcjonowanie układu immunologicznego (rozdział 5). Znaczny spadek wirulencji z powodu braku hemolizyny jest spowodowany jeszcze jednym czynnikiem. Komórki bakteryjne często posiadają kilka determinant patogenezy takich jak adhezyny czy fosfolipazy, a posiadają tylko jedną cytolizynę. Są oczywiście wyjątki od tej reguły. Actinobacillus pleuropneumoniae wydziela dwie różne toksyny RTX [16]. Jedna z nich jednak charakteryzuje się niską aktywnością i nie może efektywnie zastępować drugiej. S. aureus posiada aż trzy białka cytolityczne: α, β, oraz γ toksynę. Największe znaczenie dla procesu patogenezy mają α i γ toksyna. Obie cytolizyny są niezbędne, ich funkcje uzupełniają się wzajemnie [42]. W przypadku enterotoksycznych szczepów E. coli udział hemolizyny w patogenezie jest znikomy. Delecja genu kodującego toksynę nie miała wpływu na rozwój zakażenia u prosiąt [41]. Jest to zasługujący na uwagę wyjątek od reguły przedstawionej na początku rozdziału. Wynika to z faktu, iż E. coli nie jest typowym patogenem, który w toku ewolucji polegał na własnych czynnikach wirulencji. Bakteria ta otrzymała gen hemolizyny w wyniku transferu horyzontalnego stosunkowo niedawno. Dlatego też jej cykl życiowy nie jest jeszcze zależny od posiadania cytolizyn. Naturalnie posiadanie genu kodującego toksynę przez dany szczep daje mu pewną przewagę nad innymi. Wykazanie tej zależności zależy w znacznym stopniu od modelu doświadczalnego. Przebieg zapalenia otrzewnej u szczurów w dużej mierze zależał od wytwarzania hemolizyn przez E. coli. Rozmiar i letalność infekcji były znacząco większe w przypadku szczurów zakażonych przez szczepy hemolityczne [38]. 7. Zastosowanie Szczególne właściwości hemolizyn sprawiły, iż są one obecnie nie tylko obiektem badań, lecz są również wykorzystywane podczas prowadzenia badań z różnych dziedzin biologii. Geny kodujące cytolizyny są często znajdowane w nowo poznawanych bakteriach 15

16 chorobotwórczych. Identyfikacja większości z odkrywanych toksyn jest stosunkowo prosta. Używając konserwatywnych fragmentów genów jako sondy można określić przynależność opisywanej hemolizyny do danej rodziny [10]. Niska zmienność niektórych fragmentów omawianych białek stwarza możliwość opracowania szczepionki o szerokim zakresie. Zmienność antygenowa bakterii i duża liczba serotypów jest głównym problemem przy opracowaniu skutecznej szczepionki. Zastosowanie konserwatywnych determinantów patogenezy pozwala ominąć ten problem. W związku z powyższym podjęto próbę skonstruowania szczepionki z wykorzystaniem hemolizyny jako antygenu, która miałaby skutecznie zabezpieczać przed infekcją różnorodnych szczepów E. coli [43]. Jeszcze bardziej obiecująca wydaje się być zdolność monoklonalnych przeciwciał rozpoznających konserwatywny undekapeptyd do neutralizacji wszystkich toksyn aktywowanych przez grupy tiolowe [33]. Wykorzystanie listeriolizyny stwarza ogromne możliwości dla opracowania szczepionek nowej generacji. Jak już wspomniano w poprzednim rozdziale, białko to jest czynnikiem patogenezy umożliwiającym ucieczkę bakterii z wakuoli do cytoplazmy. Umieszczenie wybranego antygenu w tej przestrzeni jest niezwykle pożądane, gdyż umożliwia prezentację obcego białka na powierzchni komórki przez kompleks MHC I. Tradycyjne szczepionki stymulują głównie odporność humoralną. Podany antygen jest przetwarzany przez komórki prezentujące antygen po czym prezentowany wspólnie z MHC II. Tymczasem obcy oligopeptyd połączony z MHC I aktywuje limfocyty Tc (cytotoksyczne). Komórki te są odpowiedzialne za zwalczanie wirusów oraz komórek nowotworowych. L. monocytogenes zawierająca gen kodujący nukleoproteinę wirusa grypy pobudziła limfocyty Tc do aktywności cytotoksycznej wobec zakażonych komórek [32]. Ekspresja przez L. monocytogenes antygenów charakterystycznych dla komórek nowotworowych daje również zachęcające wyniki. Omawiany wektor był skuteczny jako szczepionka uodparniająca myszy na podaną następnie śmiertelną dawkę komórek rakowych. Powodował również regresję uformowanego już nowotworu [47]. Dostarczanie antygenu na teren cytoplazmy jest możliwe także przez inne bakterie dzięki ekspresji listeriolizyny. E. coli z genem kodującym cytolizynę ulegała lizie w fagosomie, lecz syntetyzowane przez nią białka znalazły się w cytozolu dzięki kanałom w błonie wakuoli utworzonym przez toksyny [26]. Ponieważ sekrecja hemolizyn nie jest niezbędna, możliwe jest zastosowanie liposomów jako wektora. Użycie liposomów zawierających toksynę L. monocytogenes i wybrane białko również zapewnia dostarczenie antygenu do cytoplazmy [36]. Hemolizyny aktywowane przez grupy tiolowe są aktualnie używane jako narzędzie badawcze w biologii komórki. Zastosowane w odpowiednich ilościach umożliwiają przeprowadzenie molekularnej iniekcji, 16

17 czyli wprowadzenia do komórki cząsteczek o wymiarach nie przekraczających średnicy kanałów transbłonowych [5]. Raz utworzone pory nie ulegają zamknięciu, co stanowiło problem w przypadku badań wpływu wprowadzanych molekuł na metabolizm komórkowy. Trudność ta została wyeliminowana dzięki zastosowaniu zmodyfikowanej cytolizyny. Składające się z niej kompleksy lityczne są zdolne do odwracalnej penetracji błony komórkowej, w zależności od stężenia kationów cynku [52]. Wykorzystano również zdolność wiązania cholesterolu przez toksyny aktywowane przez grupy tiolowe. Ta charakterystyczna właściwość umożliwia badanie rozmieszczenia cholesterolu w błonie komórkowej oraz szlaki transportu tej cząsteczki. Warunkiem jest zastosowanie odpowiednio oznakowanego białka, oraz jego modyfikacja w celu eliminacji aktywności cytolitycznej [17]. Hemolizyna S. aureus jest obecnie badana pod kątem wykorzystania jej jako molekularnego sensora. W obecności cyklodekstryny przepływające przez transbłonowy kanał cząsteczki powodują chwilowe zablokowanie kanału. Wydarzenie to może być wykryte poprzez pomiar zmian potencjału transbłonowego. Częstotliwość takich zaburzeń pozwala ustalić stężenie analizowanej substancji, a ich wartość i okres trwania informuje o rodzaju cząsteczki. System ten wydaje się być obiecującym układem do identyfikacji i jednoczesnego pomiaru stężenia poszczególnych składników mieszaniny różnych substancji organicznych [21]. 8. Podsumowanie Cytolizyny są niezwykle różnorodną grupą białek. Na podstawie homologii sekwencji wyróżniamy wśród nich rodziny skupiające białka o podobnych właściwościach. Jednak aktualna klasyfikacja nie obejmuje wszystkich znanych hemolizyn. W obrębie każdej rodziny występują wyjątki, w przypadku których przynależność do danej grupy jest dyskusyjna. Jest to kolejny przykład ukazujący, iż różnorodność natury dalece przewyższa nasze zdolności do jej klasyfikacji. Elementem wspólnym dla wszystkich hemolizyn jest mechanizm działania. W ogólnym zarysie jest on podobny u wszystkich toksyn i zawsze składa się z dwóch niezależnych etapów: asocjacja z błoną komórkową i jej penetracja. Drugi etap jest wysoce zależny od odpowiednich parametrów fizykochemicznych. Umożliwiają one cytolizynom zmiany konformacyjne i przejście monomeru w formę aktywną, zdolną do inicjacji procesu cytolizy. Liza komórki nie jest jedynym efektem działalności toksyn. Zaburzają one również funkcjonowanie metabolizmu wewnątrzkomórkowego. Ponieważ celem ataku hemolizyn są 17

18 także komórki układu odpornościowego, końcowym efektem są zaburzenia funkcjonowania wspomnianego układu. Daje to patogenowi większe szanse na udaną kolonizację jego niszy ekologicznej. Najbliższe lata z pewnością przyniosą nowe informacje z zakresu mechanizmu działania cytolizyn, oraz wpływu ich działania na komórki eukariotyczne. Być może nowe dane wprowadzą zmiany w obecnej klasyfikacji tej grupy białek. Prawdopodobnie będziemy też świadkami dalszego rozwoju zastosowań cytolizyn w różnych dziedzinach biologii. Piśmiennictwo: 65. Abdel Ghani E.M., Weis S., Walev I., Kehoe M., Bhakdi S., Palmer M.: Streptolysin O: inhibition of the conformational change during membrane binding of the monomer prevents oligomerization and pore formation. Biochemistry, 38, (1999) 66. Allison H.E., Hillman J.D.: Cloning and characterization of a Prevotella melaninogenica hemolysin. Infect. Immun. 65, 2765 (1997) 67. Bauer M.E., Welch R.A.: Association of RTX toxins with erythrocytes. Infect. Immun. 64, 4665 (1996) 68. Bhakdi S., Tranum-Jensen J.: Complement activation and attack on autologous cell membranes induced by streptolysin O. Infect. Immun. 48, 713 (1985) 69. Bhakdi S., Weller U., Walev I., Martin E., Jonas D., Palmer M.: A guide to the use of pore forming toxins for controlled permeabilization of cell membranes. Med. Microbiol. Immun. 182, 167 (1993) 70. Bielecki J.E., Youngman P., Connely P., Portnoy D.A.: Bacillus subtilis expressing haemolisyn gene from Listeria monocytogenes can grow in mammalian cells. Nature, 345, 175 (1990) 71. Billington S.J., Jost B.H., Cuevas W.A., Bright K.R., Songer J.G.: The Arcanobacterium (Actinomyces) pyogenes hemolysin, pyolysin, is a novel member of the thiol-activated cytolysin family. J. Bacteriol. 179, 6100 (1997) 72. Braun V., Hobbie S., Ondraczek R.: Serratia marcescens forms a new type of cytolysin. FEMS Microbiol. Lett. 79, 299 (1992) 73. Braun J.S., Novak R., Gao G., Murray P.J., Shenep J.L.: Pneumolysin, a protein toxin of Streptococcus pneumoniae, induces nitric oxide production from macrophages. Infect. Immun. 67, 3750 (1999) 74. Burrows L.L., Lo R.Y.: Molecular characterization of an RTX toxin determinant from 18

19 Actinobacillus suis. Infect. Immun. 60, 2166 (1992) 75. Chu L., Burgum A., Kolodrubetz D., Holt S.C.: The 46-kilodalton-hemolysin gene from Treponema denticola encodes a novel hemolysin homologous to aminotransferases. Infect. Immun. 63, 4448 (1995) 76. Coburn P.S., Hancock L.E., Booth M.C., Gilmore M.S.: A novel means of self-protection, unrelated to toxin activation, confers immunity to the bactericidal effects of the Enterococcus faecalis cytolysin. Infect. Immun. 67, 3339 (1999) 77. Coelho A., Andrade J.R.C., Vicente C.P., Dirita V.J.: Cytotoxic cell vacuolating activity from Vibrio cholerae hemolysin. Infect. Immun. 68, 1700 (2000) 78. Darji A., Stockinger B., Wehland J., Chakraborty T., Weiss S.: Antigen-specific T cell receptor antagonism by antigen-presenting cells treated with the hemolysin of Listeria monocytogenes: a novel type of immune escape. Eur. J. Immun. 27, 1696 (1997) 79. Fabbri A., Falzano L., Frank C., Donelli G., Matarrese P., Raimondi F., Fasano A., Fiorentini C.: Vibrio parahaemolyticus thermostable direct hemolysin modulates cytoskeletal organization and calcium homeostasis in intestinal cultured cells. Infect. Immun. 67, 1139 (1999) 80. Frey J., van den Bosch H., Segers R., Nicolet J.: Identification of a second hemolysin (HlyII) in Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 and expression of the gene in Escherichia coli. Infect. Immun. 60, 1671 (1992) 81. Fujimoto T., Hayashi M., Iwamoto M., Ohno-Iwashita Y.: Crosslinked plasmalemmal cholesterol is sequestered to caveolae: analysis with a new cytochemical probe. J. Histochem. Cytochem. 45, 1197 (1997) 82. Gilbert R.J., Rossjohn J., Parker M.W., Tweten R.K., Morgan P.J., Mitchell T.J., Errington N., Rowe A.J., Andrew P.W., Byron O.: Self-interaction of pneumolysin, the pore-forming protein toxin of Streptococcus pneumoniae. J. Mol. Biol. 284, 1223 (1998) 83. Gray M., Szabo G., Otero A.S., Gray L., Hewlett E.: Distinct mechanisms for K+ efflux, intoxication, and hemolysis by Bordetella pertussis AC toxin. J. Biol. Chem. 273, (1998) 84. Grimminger F., Rose F., Sibelius U., Meinhardt M., Potzsch B., Spriestersbach R., Bhakdi S., Suttorp N., Seeger W.: Human endothelial cell activation and mediator release in response to the bacterial exotoxins Escherichia coli hemolysin and staphylococcal alphatoxin. J. Immun. 159, 1909 (1997) 85. Gu L., Braha O., Conlan S., Cheley S., Bayley S.: Stochastic sensing of organic analytes by a pore-forming protein containing a molecular adapter. Nature, 398, 686 (1999) 19