Mikroekstrakcja do pojedynczej kropli w kapilarze

Transkrypt

1 Mikroekstrakcja do pojedynczej kropli w kapilarze Instrukcja do ćwiczeń opracowana w Katedrze Chemii Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. Wprowadzenie Termin elektroforeza zostało wprowadzone i sformułowane w 1909 r. przez Leonora Michaelisa. Definiuje się ją jako ruch cząstek obdarzonych ładunkiem pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego. Pierwsze zastosowanie elektroforezy jako techniki rozdzielania mieszanin przypada w 1937 r., kiedy to szwedzki naukowiec Arne Wilhelm Kaurin Tiselius zaobserwował, że składniki mieszaniny białek migrują w polu elektrycznym w stronę elektrody o przeciwnym znaku, których to ruchliwość uzależniona jest od ładunku. Wśród wielu znanych instrumentalnych metod analitycznych naczelne miejsce zajmują techniki separacyjne takie jak chromatografia i techniki elektromigracyjne. Techniki elektromigracyjne, które znalazły szerokie zastosowanie w oznaczaniu wielu substancji, posiadają duży potencjał analityczny dzięki większej możliwości miniaturyzacji aparatury w porównaniu do metod chromatograficznych. Rozdzielanie składników próbki odbywa się dzięki przyłożeniu zewnętrznego wysokiego napięcia, które może generować dwa zjawiska elektrokinetyczne - elektroforezę (ruch jonów w polu elektrycznym) oraz elektroosmozę (objętościowy przepływ cieczy w kapilarze pod wpływem pola elektrycznego). Elektroosmoza, inaczej przepływ elektroosmotyczny (EOF), pełni bardzo ważną rolę w elektroforezie kapilarnej (CE), ponieważ w pewnych warunkach możliwe jest jednoczesne oznaczanie kationów, anionów. Dużym wyzwaniem jakie napotyka się podczas optymalizacji warunków elektroforetycznych w CE jest obniżenie granicy wykrywalności (LOD) i granicy oznaczalności (LOQ). Wynika to z dwóch podstawowych przyczyn, tj. ograniczonej drogi optycznej w kapilarze dla najpopularniejszej detekcji spektrofotometrycznej (UV-Vis) oraz niewielkiej objętości roztworu próbki dozowanej do kapilary. Jest to jedno z głównych ograniczeń elektroforetycznych metod separacyjnych, w szczególności w porównaniu do tradycyjnych technik chromatografii cieczowej. Problem niskiej stężeniowej czułości w elektroforezie kapilarnej rozwiązuje się przez stosowanie różnych metod. Pierwszą z nich jest wydłużenie drogi optycznej w wyniku zastosowania kapilary z bańką w obszarze detekcyjnym, celki w kształcie litery Z oraz celki o wysokiej czułości, w której kapilara ma przekrój prostokąta. Drugą metodą jest wykorzystywanie bardzo czułych detektorów taki jak elektrochemiczny, chemiluminescencyjny lub z laserowo wzbudzaną fluorescencją (LIF). Kolejnym rozwiązaniem jest stosowanie metod zatężania próbki w układzie pomiarowym na 1

2 wejściu lub wewnątrz kapilary, przed rozdzieleniem analitów i ich detekcją, realizowane na drodze spiętrzania i/lub zmiatania. Polegają one na wprowadzaniu dużej objętości roztworu próbki do kapilary, a następnie skupieniu analitu w wąskim paśmie, dzięki wykorzystaniu efektów elektroforetycznych i chromatograficznych. W ostatnich latach coraz popularniejsze staje się stosowanie technik ekstrakcyjnych, opartych na ekstrakcji ciecz-ciecz, pozwalających na znaczne zatężenie próbki, a co za tym idzie uzyskanie bardzo niskich wartości LOD oraz LOQ. Ekstrakcja ciecz-ciecz jest klasyczną metodą przygotowania próbki do analizy oraz jej zatężania. Z powodu konieczności używania dużych objętości rozpuszczalników organicznych, które zazwyczaj są bardzo toksyczne, dąży się do redukcji ich zużycia poprzez wykorzystanie mikroekstrakcji do fazy ciekłej (LPME). Jedną z powszechnie stosowanych odmian LPME jest mikroekstrakcja do pojedynczej kropli (SDME), która posiada szereg znaczących zalet: istotnie zmniejsza zużycie rozpuszczalników organicznych, posiada zdolność oczyszczania próbki oraz wyróżnia się wysokim współczynnikiem wzbogacenia. Sposób wykonania SDME jest prosty i niedrogi, ponieważ nie wymaga specjalnej aparatury do wytwarzania kropli oraz może być z łatwością sprzężona z CE w trybie off- lub on-line. Technika SDME-CE polega na wytworzeniu na końcu kapilary kropli fazy akceptorowej, którą zanurza się w roztworze próbki lub zawiesza nad jej powierzchnią. Po zakończeniu ekstrakcji, część wzbogaconego ekstrahenta wprowadza się z powrotem do wlotowego końca kapilary. Schemat obrazujący proces mikroekstrakcji do pojedynczej kropli w trybie on-line w układzie trójfazowym przedstawiono poniżej. Rys.1. Schemat procedury mikroekstrakcji do pojedynczej kropli w trybie on-line w układzie trójfazowym ( kropla w kropli ). 2

3 Procedura mikroekstrakcji do pojedynczej kropli w układzie trójfazowym sprzężona z CE składa się z następujących kroków: 1. Podstawienie wialki z fazą akceptorową, którą hydrodynamicznie wtłacza się do wlotowego końca kapilary wypełnionej buforem podstawowym. 2. Podstawienie wialki z fazą organiczną, którą stanowi pojedynczy rozpuszczalnik lub mieszanina kilku rozpuszczalników, którą hydrodynamicznie wtłacza się do wlotowego końca kapilary. 3. Podstawienie wialki zawierającą roztwór próbki, w którym zanurzony jest wlotowy koniec kapilary. Następnie hydrodynamiczne formowanie kropli fazy akceptorowej w fazie organicznej, tzw. kropla w kropli, poprzez zastosowanie ciśnienia wstecznego. 4. Ekstrakcja analitu z fazy donorowej (roztwór próbki) do fazy organicznej, a następnie reekstrakcja do roztworu fazy akceptorowej. 5. Po zakończeniu ekstrakcji następuje hydrodynamiczne wprowadzenie wzbogaconej kropli do kapilary. 6. Podstawienie wialki z roztworem buforu podstawowego do elektroforezy i przeprowadzenie analizy elektroforetycznej poprzez przyłożenie napięcia. Odczynniki i aparatura: - aparat do elektroforezy HP 3D CE z detektorem DAD; - ph-metr HANNA Instruments HI 221; - pipety automatyczne; - probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 2 ml - kolby miarowe o pojemności 25, 50 ml; - 0,04 M kwas borowy; - 0,04 M boran sodu; - 0,04 M bufor boranowy o ph = 9,00; - tabletka leku LEVOXA zawierająca 500 mg substancji czynnej Lewofloksacyny; - 1 M HCl; - roztwór NaOH o różnym stężeniu; - dichlorometan; - toluen; - woda dejonizowana. 3

4 Wymagane środki ostrożności: W trakcie wykonywania ćwiczenia student powinien nosić odzież ochronną. Roztworów nie należy wdychać i pipetować ustami. Identyfikacja zagrożeń (Klasyfikacja zgodnie z Rozporządzeniem WE nr 1272/2008): - dichlorometan - działa drażniąco na skórę, działa drażniąco na oczy, może powodować podrażnienie dróg oddechowych, może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy, podejrzewa się, że powoduje raka, może powodować uszkodzenie narządów (wątroba, krew) poprzez długotrwałe lub narażenie powtarzane drogą pokarmową, może powodować uszkodzenie narządów (centralny układ nerwowy) poprzez długotrwałe lub narażenie powtarzane drogą oddechową. nie wdychać pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy, stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu/ ochronę twarzy, w przypadku dostania się do oczu: ostrożnie płukać wodą przez kilka minut, wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć, nadal płukać. - toluen - wysoce łatwopalna ciecz i pary, połknięcie i dostanie się przez drogi oddechowe może grozić śmiercią, działa drażniąco na skórę, może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy, podejrzewa się, że działa szkodliwie na dziecko w łonie matki, może powodować uszkodzenie narządów poprzez długotrwałe lub narażenie powtarzane, przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu, palenie wzbronione, nie wdychać pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy, stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu/ ochronę twarzy, w przypadku połknięcia: natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć/ lekarzem, w przypadku pożaru: użyć suchy proszek lub suchy piasek do gaszenia, przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu, przechowywać w chłodnym miejscu. - kwas borowy - może działać szkodliwie na płodność, może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki, przed użyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostrożności, stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu/ ochronę twarzy, w przypadku narażenia lub styczności: zasięgnąć porady/ zgłosić się pod opiekę lekarza. Identyfikacja zagrożeń (Klasyfikacja zgodnie z Rozporządzeniem WE nr 1272/2008, Klasyfikacja zgodnie z dyrektywami UE 67/548/EWG lub 1999/45/WE): - boran sodu - może działać szkodliwie na płodność, może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki, Przed użyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostrożności, w przypadku narażenia lub styczności: zasięgnąć porady/ zgłosić się pod opiekę lekarza. Pierwsza pomoc: - w przypadku wdychania - jeżeli osoba poszkodowana oddycha, przenieść na świeże powietrze, jeżeli osoba poszkodowana nie oddycha, zastosować sztuczne oddychanie, zasięgnąć porady medycznej. 4

5 - w przypadku kontaktu ze skórą - zmyć mydłem i dużą ilością wody, zasięgnąć porady medycznej. - w przypadku kontaktu z oczami - przemywać dokładnie dużą ilością wody przynajmniej przez 15 minut i skonsultować się z lekarzem. - w przypadku połknięcia - nieprzytomnej osobie nigdy nie podawać nic doustnie, wypłukać usta wodą, zasięgnąć porady medycznej. - porady ogólne - zasięgnąć porady medycznej, przedstawić lekarzowi dołączoną Kartę Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej. Dokładne instrukcje postępowania są zawarte w dołączonych kartach charakterystyk substancji. Wykonanie ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest optymalizacja podstawowych parametrów mikroekstrakcji do pojedynczej kropli (SDME) w układzie pomiarowym elektroforezy kapilarnej (CE) dla procedury oznaczania Lewofloksacyny. Przygotowanie aparatu do CE do pracy 1. Włączyć komputer oraz aparat do CE. 2. Włączyć program INSTRUMENT 1 ONLINE. 3. Przeprowadzić inicjalizację oprogramowania oraz aparatu: na pasku zadań kliknąć INSTRUMENT i z listy wybrać System INIT. 4. Po skończonej inicjalizacji przeprowadzić procedurę przygotowania kapilary: - Kliknąć lewym przyciskiem myszy na ikonkę wialki w miejscu INLET i z listy wybrać SET VIAL, a następnie wpisać nr 42 (wialka z roztworem 0,1 M NaOH). To samo wykonać w miejscu OUTLET z tym, że należy wpisać nr 44 (pusta wialka na zlewki ). - Kliknąć lewym przyciskiem myszy na niebieską ikonkę butli z gazem, z listy wybrać FLUSH CAPILLARY i wpisać czas 20 minut. (W tym czasie można przygotować bufor do elektroforezy). - Następnie w miejscu INLET ustawić wialkę z numerem 43 (wialka z wodą dejonizowaną) i płukać kapilarę przez 5 minut (komenda FLUSH CAPILLARY). - Po przepłukaniu kapilary roztworem wodorotlenku i wodą dejonizowaną należy przeprowadzić kondycjonowanie kapilary buforem podstawowym. W tym celu w miejscu INLET ustawić wialkę z numerem 3 (roztwór BGE), a w miejscu OUTLET wialkę z numerem 4 (pusta wialka na zlewki ). 5

6 - Teraz należy kliknąć na niebieską ikonę butli i ustawić czas płukania na 30 minut. (W tym czasie można przygotowywać potrzebne roztwory do optymalizacji parametrów mikroekstrakcji). Optymalizacja podstawowych parametrów mikroekstrakcji 1. Sporządzić roztwór buforu podstawowego do elektroforezy: Przygotowanie buforu boranowego o stężeniu 0,04 M i ph = 9,00: odważyć w naczynkach wagowych odpowiednią ilość boranu sodu i kwasu borowego tak by stężenia obydwu wynosiły 0,04 M, a następnie rozpuścić w kolbach miarowych o pojemności odpowiednio 50 i 25 ml, uzupełniając wodą dejonizowaną do kreski. Następnie do zlewki wlać część roztworu boranu sodu o stęż. 0,04 M włożyć bączek i zanurzyć elektrodę ph-metru. Włączyć ph-metr w celu rozpoczęcia pomiaru ph. Do roztworu boranu dodawać porcjami kwas borowy do momentu aż wskazania ph-metru będą wyświetlały wartość ph = 9,00. Następnie do dwóch z trzech wialek dodać po 700 L przygotowanego buforu, zaś do trzeciej wlać 1000 L. Nadmiar buforu można przelać do kolbki miarowej. Wialki z mniejszą objętością elektrolitu umieścić w pozycjach 1 i 2 karuzeli automatycznego dozownika próbek, natomiast wialkę trzecią umieścić w pozycji 3. Do pozycji 4 w karuzeli wstawić pustą wialkę. 2. Sporządzić roztwory fazy akceptorowej o różnym stężeniu: Przygotowanie roztworu NaOH o stężeniach w zakresie od 0,075-0,125 M: do 3 probówek typu Ependorf o pojemności 2 ml wlać odpowiednią objętość 1 M NaOH aby stężenia końcowe wynosiły 0,075, 0,1, 0,125 M, następnie uzupełnić wodą dejonizowaną do 2 ml. Do 3 wialek wlać po 700 L przygotowanych roztworów fazy akceptorowej. 3. Sporządzić mieszaninę fazy organicznej (stanowisko pod dygestorium): Przygotowanie mieszaniny dichlorometanu i toluenu w stosunku 1:1 (v/v): do wialki dodać równe objętości (350 L) dichlorometanu i toluenu i dobrze wymieszać. 4. Sporządzić roztwory Lewofloksacyny o różnym ph: Przygotowanie roztworów Lewofloksacyny o ph w zakresie 2-5: do 4 probówek typu Ependorf odważyć po około 0,01 g preparatu farmaceutycznego LEVOXA. Do zlewki wlać część roztworu boranu sodu o stęż. 0,04 M, włożyć bączek i zanurzyć elektrodę ph-metru. Do roztworu boranu sodu dodawać porcjami 1 M HCl do momentu uzyskania żądanego ph, tj. 2,00, 3,00, 4,00, 5,00. Z otrzymanych buforów pobrać po 2 ml każdego, dodać do probówki z odważoną Lewofloksacyną i kilkakrotnie wymieszać. Uzyskany roztwór 6

7 odwirować przy obr/min przez 5 minut, a następnie pobrany supernatant rozcieńczyć 10 krotnie do 2 ml wodą dejonizowaną. 5. Przeprowadzić optymalizację parametrów mikroekstrakcji do pojedynczej kropli: Przed rozpoczęciem wyznaczania optymalnych parametrów mikroekstrakcji należy do oprogramowania aparatu wprowadzić odpowiednie etapy procedury ekstrakcji, tj. hydrodynamiczne pobieranie fazy akceptorowej oraz fazy organicznej do kapilary, hydrodynamiczne generowanie kropli na końcu kapilary, czas ekstrakcji, hydrodynamiczne pobieranie wzbogaconego ekstrahenta. W tym celu należy kliknąć na ikonkę ilustrującą strzykawkę, z listy wybrać SETUP HPCE INJECTION, w miejscu INJECTED BY wybrać USE TABLE, po czym kliknąć EDIT, następnie kliknąć INSERT i dodać odpowiednie komendy w miejscu FUNCTION, potwierdzając wprowadzenie przyciskiem ENTER zgodnie z poniższym schematem: 1) PRESSURE: 50 mbar; 120 sec; I: [wialka z fazą akceptorową]; O: 2; 2) PRESSURE: 40 mbar; 20 sec; I: 10 [wialka z fazą organiczną]; O: 2; 3) INLET: Inject Vial [wialka z próbką LEWOFLOKSACYNY]; 4) PRESSURE: -50 mbar; 100 sec; I: Inject Vial; O: 2; 5) WAIT: 3 min; 6) PRESSURE: 2,5 mbar; 2 sec; I: Inject Vial; O: 2; 7) INLET: 1. Po utworzeniu tabeli należy kliknąć dwa razy OK. Od tego momentu można rozpocząć optymalizację parametrów. Optymalizacja odpowiedniego ph próbki: Umieścić wialki w karuzeli automatycznego podajnika próbek: przygotowaną fazę organiczną w miejsce 10, przygotowane roztwory fazy akceptorowej w miejsca od 11 do 13 oraz przygotowane roztwory Lewofloksacyny w miejsca od 21 do 24. Następnie kliknąć lewym przyciskiem myszy na ikonkę strzykawki i w tabeli procedury ekstrakcji w punkcie 1) w miejscu I wpisać numer 12 (roztwór 0,1 M NaOH). W celu rozpoczęcia analizy należy kliknąć lewym przyciskiem myszy na ikonkę wialki do analizy, z listy wybrać SINGLE SAMPLE INFO, wpisać nazwę pliku w miejscu FILENAME (np. prac_1), odpowiednią nazwę folderu do zapisywania elektroforegramów w miejscu SUBDIRECTORY, numer analizowanej próbki Lewofloksacyny o danym ph w miejscu VIAL (np. ph = 2 - wialka nr 21), a na koniec kliknąć RUN METHOD. Dla każdego ph wykonać jedną analizę. Po zakończonej analizie należy zintegrować uzyskane sygnały na elektroforegramach, tzn. odczytać wysokość piku i jego pole powierzchni, oraz wykonać odpowiednie zależności 7

8 w arkuszu Microsoft EXCEL. W tym celu włączyć program INSTRUMENT 1 OFFLINE, kliknąć lewym przyciskiem myszy na przycisk LOAD SIGNAL(S) OF DATA FILE, wyszukać folder z zapisanym elektroforegramem w oknie DIRECTORIES i w oknie FILE NAME odnaleźć szukany plik, następnie kliknąć OK. Odczytać podane wartości wysokości oraz pola powierzchni w tabeli, a w arkuszu EXCEL wykreślić zależności wysokości sygnału od ph próbki oraz pola powierzchni od ph. Na podstawie wyznaczonych zależności wybrać odpowiednie ph próbki do dalszej procedury optymalizacji. Optymalizacja odpowiedniego stężenia fazy akceptorowej: Aby przeprowadzić optymalizację stęż. NaOH należy zmienić w tabeli procedury ekstrakcji numery wialek w punkcie 1) odpowiadające wialkom zawierającym dany roztwór wodorotlenku sodu, od 11 do 13, i przeprowadzić analizę w ten sam sposób jak przy optymalizacji ph, nadając każdej z nich odpowiednią nazwę pliku. Dla każdego stężenia wykonać jedną analizę, a następnie przeprowadzić integrację sygnałów na elektroforegramach w programie INSTRUMENT 1 OFFLINE, wykonać wykresy zależności wysokości sygnału od stężenia NaOH oraz pola powierzchni od stężenia NaOH. Na podstawie wyznaczonych zależności wybrać odpowiednie stężenie roztworu zasady do dalszej procedury optymalizacji. Optymalizacja odpowiedniego czasu ekstrakcji: W celu przeprowadzenia optymalizacji czasu ekstrakcji należy zmienić w tabeli procedury ekstrakcji czas czekania WAIT w punkcie 5) wpisując czas w zakresie od 2 do 5 minut, zwiększając co 1 minutę dla kolejnych analiz, a następnie przeprowadzić pomiar w ten sam sposób jak przy optymalizacji ph, nadając każdemu z nich odpowiednią nazwę pliku. Dla danego czasu ekstrakcji wykonać jedną analizę. Przeprowadzić integrację sygnałów na elektroforegramach w programie INSTRUMENT 1 OFFLINE, wykonać wykresy zależności wysokości sygnału od czasu ekstrakcji oraz pola powierzchni od czasu ekstrakcji. 6. Po zakończeniu procesu optymalizacji, przeprowadzić procedurę mycia kapilary. W tym celu w miejscu INLET podstawić wialkę z numerem 43, zaś w miejscu OUTLET wialkę z numerem 44, następnie ustawić czas płukania kapilary na 15 minut. Aparat do CE wyłącza prowadzący ćwiczenia. Opracowanie wyników: 1. Na podstawie uzyskanych danych wykreślić odpowiednie zależności i wyznaczyć wybrane parametry oraz warunki pomiarowe, tj. ph próbki, stężenie fazy akceptorowej, czas ekstrakcji. 2. Sformułować wnioski końcowe. 8

9 Literatura: 1. "Techniki elektromigracyjne - teoria i praktyka" [Red.] Buszewski B., Dziubakiewicz E., Szumski M., Wydawnictwo Malamut, Warszawa 2012, ISBN Y. Wen, J. Li, J. Ma, L. Chen, Recent advances in enrichment techniques for trace analysis in capillary electrophoresis, Electrophoresis 2012, 33, ; 3. Z. A. ALOthmana, M. Dawod, J. Kim, D. S. Chung, Single-drop microextraction as a powerful pretreatment tool for capillary electrophoresis: A review, Analytica Chimica Acta 2012, 739,