(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/DK99/00556 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA () OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (8) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/DK99/0055 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/23098 PCT Gazette nr 17/00 (51) Int.Cl. A1K 38/28 (200.01) A1P 3/10 (200.01) (54) Trwałe stężone preparaty insulinowe do podawania do płuc (30) Pierwszeństwo: ,DK,PA (73) Uprawniony z patentu: NOVO NORDISK A/S,Bagsvaerd,DK (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 07/02 (72) Twórca(y) wynalazku: Svend Havelund,Bagsvaerd,DK (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/08 (74) Pełnomocnik: Barbara Bogdan, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. (57) 1. Wodny preparat insulinowy, znamienny tym, że zawiera: do mm insuliny ludzkiej lub jej analogu lub pochodnej, mniej niż 50 mm chlorku, mniej niż 10 mm dowolnego anionu innego niż chlorek i octan, 2 do 5 jonów Zn 2+ na sześć cząsteczek insuliny i co najmniej 3 cząsteczki owe na sześć cząsteczek insuliny. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy stężonych wodnych preparatów insulinowych o dużej fizycznej i chemicznej trwałości i odpowiednich do podawania do płuc. Cukrzyca jest określeniem ogólnym dla zaburzeń u ludzi polegających na nadmiernym wydalaniu moczu, tak jak w przypadku diabetes mellitus i diabetes insipidus. Diabetes mellitus jest zaburzeniem metabolicznym, w którym zdolność do przemiany cukru jest mniej lub bardziej całkowicie utracona. Około 2% ludzi cierpi na cukrzycę. Od czasu wprowadzenia insuliny w 1920 r., czynione są ciągłe postępy w leczeniu cukrzycy. Aby zapobiec zwiększonemu poziomowi obecności glukozy we krwi, pacjenci cukrzycowi często stosują terapie wielokrotnych iniekcji, przy czym insulina podawana jest przy każdym posiłku. W roztworze, samoasocjacja insuliny jest złożoną zależnością stężenia białka, jonów metalu, ph, siły jonowej i składu rozpuszczalnika. W obecnie stosowanych rozpuszczalnych preparatach zawierających 100 U insuliny, jony cynku, środek izotoniczny i owe środki konserwujące, należy wziąć pod uwagę następujące równania: In 3 In 2 3 In Zn 2+ In (T ) T T 3 R 3 R Znany rozpad cząsteczki insuliny obejmuje a) tworzenie się fibryli; b) deamidację w pozycji A18, A21 i B3; c) dimeryzację poprzez transamidację lub tworzenie zasady Schiffa; d) reakcję wymiany disiarczkowej. Według Brange'a (Stability of Insulin, Kluwer Academic Press, 1994), każda z tych reakcji degradacji przebiega szybciej w stanie monomerycznym niż w stanie heksamerycznym. Dlatego też, najbardziej skutecznym środkiem stabilizacji preparatów insulinowych jest przesunięcie powyższej równowagi na prawo najbardziej jak to jest możliwe. Niezależnie od tej ogólnej wymiany masy, reaktywność wybranych reszt modyfikowana jest dalej w zależności od wywołanej w T R zmianie konformacyjnej. Tak więc, reaktywność B3Asn jest dużo niższa w stanie R (gdy reszta znajduje się w α-heliksie) niż w stanie T. Wewnętrzna przemiana pomiędzy konformacjami T, T 3 R 3 i R dwu cynkowych insulinowych heksamerów jest modulowana poprzez ligandy wiążące do postaci T 3 R 3 i R. Aniony takie jak chlorowce, mają powinowactwo do czterech pozycji koordynacyjnych w jonach metalu T 3 R 3 i R, podczas gdy środki konserwujące, takie jak, wiążą się z hydrofobowymi kieszeniami umieszczonymi bliżej powierzchni postaci T 3 R 3 i R (Derewenda, Nature 338, 594, 1989 i Brzovic, Biechemistry 22, , 1994). Stosując Co 2+ insulinę wykazano, że połączony efekt anionowego i owego wiązania jest szczególnie skuteczny w stabilizowaniu stanu R. (Brader, Trends Biochem. Sci. 30, 3, 1991 i Bloom, J. Mol. Biol , 1995). Ponadto, wykazano zarówno dla Zn 2+ jak i Co 2+ insuliny, że jest bardziej skuteczny niż m-krezol w indukowaniu stanu R w heksamerze insulinowym (Wollmer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 38, 903, 1987 i Choi, Biochemistry 32, 1138, 1993). Pochodnymi owymi o wysokim powinowactwie indukującymi stan R są 7-hydroksyindol ((Dodson, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 345,3, 1993), rezorcinol oraz 2,- i 2,7-dihydroksynaftalen ((Bloom, J. Mol. Biol. 245,324,1995). Fizyczna denaturacja insuliny znana jest jako fibrylacja. W stanie fibrylacji powiększone łańcuchy peptydowe ułożone są równolegle lub przeciwrównolegle i wodorowe związane jeden z drugim, tak zwana β-struktura lub β-harmonijkowa struktura. Fibryle mają zwykle najniższy stan energii proteiny, i tylko bardzo ostre warunki, takie jak silna zasada mogą umożliwić regenerację z tego stanu do stanu natywnego prawidłowo zwiększonej proteiny. Czynnikami zwiększającymi stopień tworzenia się fibryli są podwyższona temperatura, zwiększona powierzchnia pomiędzy fazą ciekłą i fazą powietrzną, i, dla insuliny wolnej od cynku, zwiększone stężenie. Dla heksamerycznej insuliny cynkowej stopień tworzenia się fibryli zmniejsza się wraz ze zwiększonym stężeniem. Fibryle insuliny mają wygląd żelu lub wytrąceń. Pochodne insuliny mające wycięcia w C-końcu B-łańcucha, np. des-pentapeptyd (B2-B30) insuliny i des-oktapeptyd insuliny mają większą skłonność do tworzenia fibryli niż insulina ludzka. Analogi insuliny, które dysocjują od razu z jednostki hekasemerowej do postaci monomerycznej, na przykład AspB28 insulina ludzka i LizB28-ProB29 insulina ludzka, podobnie mają większą skłonność do tworzenia fibryli niż insulina ludzka. Stan natywny insuliny stabilizuje się doprowadzając do warunków bliskich tym, które stabilizują jednostkę heksameryczną, na przykład jony cynku (2-4 cynk/heksamer), (0,1 0,5% wagowo/objętościowy) i chlorek sodu (5-0 mm). Dodanie środków zmniejszających napięcie powierzchniowe na granicy powietrze-ciecz, dodatkowo zmniejsza tendencję do tworzenia fibryli. Tak więc, glikol polietylenowy, glikol polipropylenowy i kopolimery tychże o średnim ciężarze cząsteczkowym około 1800, okazały się być użyteczne jako

3 PL B1 3 stabilizatory w stężonych roztworach insulinowych do pomp infuzyjnych (Grau, In: Neue Insuline (Eds. Petersen, Schlüter & Kerp), Freiburger Graphische Betriebe, str i Thurow, 1982: patent DE Al). Dla dokładnego przeglądu fizycznej stabilności insuliny patrz Brange 1994, Stability of Insulin, Kluwer Academi Publisher, str Większość degradacji insuliny w preparatach wywołanych jest reakcjami powodującymi funkcję karboksamidową reszty asparginowej, zwłaszcza reszt B3 i A21. Hydroliza grup amidowych prowadzi do pochodnej desamido, a transamidacja wywołana grupami aminowymi z innych cząsteczek prowadzi do kowalentnie związanych dimerów i po podobnych kolejnych reakcjach, do trimerów i wyższych polimerów. W kwaśnych roztworach AsnA21 jest najbardziej reaktywny, prowadząc do AspA21 insuliny (Sundby, J. Biol. Chem. 237,340, 192). W surowej insulinie pochodzenia wołowego i świńskiego, uzyskanej poprzez kwasową ekstrakcję etanolową, najobficiej wyizolowanymi dimerami były AspA21 - GlyA1 i AspA21 PheB1- (Helbig 197, Insulindimere aus der B-Komponente von Insulinpräparationen, Thesis at the Rheinisch-Westfälichen Technischen Hochschule, Aachen). W roztworach obojętnych, które są preferowanymi roztworami dla preparatów insulinowych do iniekcji, najbardziej wrażliwą resztą jest AsnB3. Do produktów degradacji należą AspB3 insulina, AspB3-GlnB4 izopeptydoinsulina, i dimery oraz wyższe polimery, gdzie AspB3AspB3 dostarcza ugrupowanie karbonylowe wiązania peptydowego z grupą aminową innej cząsteczki. W celu obszernego przeglądu chemicznej stabilności insuliny patrz Brange 1994, Stability of Insulin, Kluwer Academic Publisher, str Jeśli chodzi o fizyczne warunki stabilizacji jednostki heksamerycznej, to obecność jonów cynkowych (2-4 cynk/heksamer), u (0,1-0,5% wagowo/objętościowych) i chlorku sodu (5-0 mm), zmniejsza stopień tworzenia produktów degradacji w czasie przechowywania przy ph obojętnym. Obserwuje się różnego typu reakcje polimeryzacji, gdy zaniedba się warunki stabilizujące jednostkę heksameryczną. Tak więc, pod nieobecność cynku, u i chlorku sodu, i stosując temperaturę 50 C, połączone dwuusiarczkowo dimery i polimery o wysokiej liczbie cząsteczkowej są produktami tworzącymi się w przewadze. Mechanizm tworzenia się jest reakcją wewnętrznej zmiany disiarczkowej, wynikającej z β-eliminacji disiarczków (Brems, Protein Engineering 5, 519, 1992). Rozpuszczalność insuliny jest funkcją ph, stężenia jonów metali, siły jonowej, substancji owych, składu rozpuszczalnika (poliole, etanol i inne rozpuszczalniki) czystości i rodzaju (wołowa, świńska, ludzka, inne analogi). Dla przeglądu patrz Brange: Galenics of Insulin, Springer-Verlag 1987, str. 18 i 4. Rozpuszczalność insuliny jest niższa przy wartościach ph bliskich jej izoelektrycznego ph, to jest przy ph w zakresie 4,0-7,0. Wysoko stężone roztwory insuliny świńskiej (5000 U/ml~30 mm) otrzymano blisko ph kwasowego (Galloway, Diabetes Care 4, 3, 1981), ale insulina w preparacie jest wysoce nietrwała z uwagi na deamidację przy AsnA21. Przy ph obojętnym można wytworzyć wysoce stężone roztwory insuliny wolnej od cynku, ale są one nietrwałe z uwagi na wysoki stopień polimeryzacji i deamidacji przy Asn B3. Dla roztworów cynkowych insuliny świńskiej zawierających przy obojętnym ph doniesiono o fizycznej trwałości przy stężeniu 1000 U/ml w podwyższonej temperaturze, ale roztwory te stają się nadnasyconymi, gdy temperatura zostanie obniżona do 4 C (Brange and Havelund in Artificial System for Insulin Delivery, Brunetti i in., eds, Raven Press 1983). W celu zmniejszenia niewygody iniekcji insulinowych dużą uwagę zwrócono na alternatywne drogi podawania (dla przeglądu patrz Brange i Langkjaer w Protein Delivery: Physical Systems, Sanders i Hendre, eds., Plenum Press 1997). Dostarczanie do płuc wydaje się najbardziej obiecujące (Sevice, Science 277, 1199, 1997). Insulinie można nadać postać aerozolu w postaci suchego proszku lub jako nebulizowanych kropelek z roztworu insuliny. Skuteczność można poprawić przez trenowanie oddychania (Gonda, opis patentowy nr US 5,743,250) i dodanie wzmacniacza absorpcji (Baekstroem, opis patentowy nr US 5,747,445) lub inhibitorów proteazy (Okumura, Int. J. Pharm. 88,3, 1992). Wykazano, że biodostępność nebulizowanych stężonych roztworów insulinowych (500 U/ml) wynosiła 20-25% w porównaniu z iniekcjami podskórnymi (Ellit, Aust. Paediatr. J , 1987). Stosując μl roztworu insuliny na dmuchnięcie roztwór insuliny musi być 5-20 razy bardziej stężony niż zwykłe stężenie wynoszące 0, mm. Stosując jednodawkowy pojemnik, na przykład opakowanie konturowe (Gonda, opis patentowy nr US 5,743,250), nie ma konieczności stosowania środka konserwującego. Większość preparatów insulinowych konserwuje się em lub m-krezolem, które są toksyczne, podrażniają śluzówkę i mają nieprzyjemny zapach. Jednakże pominięcie u powoduje problemy z trwałością. Poza skutecznością bakteriostatyczną, e działają jako stabilizatory fizyko-chemiczne insuliny w połączeniu z jonami cynku. Tak więc, korzystnie, preparaty insulinowe do

4 4 PL B1 inhalacji wykonuje się z minimalnym stężeniem u lub zastępuje się bardziej akceptowalnymi substytutami. Przez określenie analog insuliny ludzkiej" (i podobne określenia) należy rozumieć insulinę ludzką, w której jeden lub więcej aminokwasów został usunięty i/lub zastąpiony przez inny aminokwas, włączając aminokwasy niekodowalne, lub insulinę ludzką zawierającą dodatkowe aminokwasy, to jest więcej niż 51 aminokwasów. Przez określenie pochodne insuliny ludzkiej" (i podobne określenia) należy rozumieć insulinę ludzką lub jej analog, w którym co najmniej jeden podstawnik organiczny jest związany z jednym lub więcej aminokwasami. Przez określenie e" lub cząsteczki owe" należy rozumieć lub jego pochodne, takie jak m-krezol lub chlorokrezol. Celem wynalazku jest dostarczenie stężonego preparatu insulinowego do podawania do płuc o akceptowalnej fizycznej i chemicznej trwałości. Nieoczekiwanie cel ten osiągnięto dostarczając preparat insulinowy, w którym stężenie chlorku utrzymuje się poniżej 50 mm, i w którym stężenie innych anionów, takich jak fosforanów jest zminimalizowane. Tak więc, wynalazek dotyczy wodnego preparat insulinowego zawierającego: 3 do 20 mm insuliny ludzkiej lub jej analogu lub jej pochodnej, mniej niż 50 mm chlorku, mniej niż 10 mm anionów innych niż chlorkowe i octanowe, 2 do 5 jonów Zn 2+ na sześć cząsteczek insuliny i co najmniej 3 cząsteczki owe na sześć cząsteczek insuliny. Preparat insulinowy według wynalazku zawiera korzystnie 3 do, jeszcze korzystniej 4 do mm, jeszcze korzystniej 5 do mm, a najkorzystniej do mm insuliny ludzkiej lub jej analogu lub jej pochodnej. W pewnych korzystnych wykonaniach preparat według wynalazku zawiera około 3 mm, około mm, około 9 mm lub około mm insuliny ludzkiej lub jej analogu lub jej pochodnej. Gdy preparat insulinowy według wynalazku ma być podawany z wielodawkowych pojemników pożądane jest, aby był on konserwowany i dlatego korzystnie zawiera on do 50 mm cząsteczek owych. Jednakże, nieoczekiwanie, odpowiednią trwałość uzyskuje się stosując stosunkowo niskie stężenie cząsteczek owych, to jest 3 do cząsteczek owych na sześć cząsteczek insuliny, korzystnie 3 do 9 cząsteczek owych na sześć cząsteczek insuliny. Można stosować niskie stężenie cząsteczek owych, gdy nie ma konieczności konserwowania lub jest ona niewielka, tak jak w przypadku jednodawkowych pojemników. Dalszą zaletą stosowania małych ilości cząsteczek owych jest wygoda dla pacjenta. Preparat insulinowy według wynalazku w celu zapewnienia optymalnej trwałości korzystnie zawiera mniej niż 40 mm, jeszcze korzystniej mniej niż 30 mm, a najkorzystniej 5 do 20 mm chlorku. W szczególnym wykonaniu insulina może zawierać małą ilość buforu fosforanowego, zwłaszcza do 5 mm fosforanu. Preparaty według wynalazku zawierające 2 do 4 jonów Zn 2+, zwłaszcza 2,2 do 3,2 jonów Zn 2+ na sześć cząsteczek insuliny są bardzo stabilne. Korzystnie preparaty insulinowe zawierają 3 do 5 jonów Zn 2+, korzystnie 3,5 do 5 jonów Zn 2+ na sześć cząsteczek insuliny. Nieoczekiwanie, możliwe jest dodanie do preparatów insulinowych według wynalazku stosunkowo wysokiego stężenia jonów obojnaczych, takich jak glicyloglicyna i glicyna bez obniżenia rozpuszczalności insuliny. Glicyloglicyna działa jako bufor przy obojętnym ph i ponadto zwiększa stopień rozpuszczalności insuliny cynkowej przy obojętnym do zasadowego ph z uwagi na umiarkowany efekt chelatujący cynku. Ponadto glicologlicyna w czasie przechowywania może działać jako wychwytywacz dla reakcji aminowych. Tak więc, preparat insulinowy według wynalazku korzystnie zawiera również 5 do 0 mm obojnaczej aminy, korzystnie glicyloglicyny lub glicyny. Korzystnie preparat insulinowy według wynalazku zawiera ponadto 5 do 50 mm trishydroksymetyloaminometanu, który działa jako bufor przy ph obojętnym i jako wychwytywacz dla związków reaktywnych aminowo. W innym korzystnym wykonaniu preparat insulinowy według wynalazku zawiera jako kationy jony sodu. Jony sodu mają niski efekt wysalania. W innym korzystnym wykonaniu preparat insulinowy według wynalazku zawiera jako kationy potas lub mieszaninę jonów potasowych i sodowych. Jony potasowe w stężeniu większym niż stężenie plazmy wynoszącym 4-5 mm zwiększają transport insuliny poprzez płuca. W innym korzystnym wykonaniu jony potasowe w stężeniu większym niż 4-5 mm stosuje się w połączeniu z umiarkowanymi środkami rozszerzającymi oskrzela takimi jak mentol. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wynalazku preparat insulinowy według wynalazku zawiera od 0,001 do 1% wagowego niejonowego środka powierzchniowo czynnego, korzystnie monolaurynianu polioksoetylenoheksa-2,4-dienodiolu (tween 20) lub związku o wzorze

5 PL B1 5 (OH(CH 2 CH 2 O) 75 (CH (CH 3 ) CH 2 O) 30 (CH 2 CH 2 O) 75 H) (Polox 188). Detergenty niejonowe można dodawać w celu stabilizowania insuliny, aby w czasie przechowywania i nebulizacji nie tworzyły się fibryle. W innym korzystnym wykonaniu preparat insulinowy według wynalazku zawiera 1 mm do 10 mm anionowego środka powierzchniowo czynnego, korzystnie taurocholanu sodu, który dodatkowo zwiększa biodostępność insuliny. Korzystnie stosowaną insuliną jest insulina ludzka. W innym korzystnym wykonaniu stosowaną insuliną jest analog insuliny ludzkiej, w którym w pozycji B28 jest Asp, Liz, Leu, Val lub Ala a pozycji B29 Liz lub Pro; lub des (B28-B30), des(b27) lub des(b30) insulina ludzka. Korzystnymi analogami insuliny ludzkiej są te, w których w pozycji B28 jest Asp lub Liz, a w pozycji B29 jest Liz lub Pro, korzystnie Asp B28 insulina ludzka lub Liz B28 Pro B29 insulina ludzka. W innym korzystnym wykonaniu insulinę wybiera się spośród grupy długo działających pochodnych insuliny, takich jak pochodne insuliny ludzkiej mające jeden lub więcej lipofilowych podstawników, korzystnie insuliny acylowane. Pochodną insuliny według korzystnego wykonania wynalazku wybiera się spośród grupy obejmującej B29-N ε -myristoil-des(b30) insulinę ludzką, B29-N ε -palmitoildes(b30) insulinę ludzką, B29-N ε -myristoil insulinę ludzką, B29-N ε -palmitoil insulinę ludzką, B28-N E - myristoil Liz B28 Pro B29 insulinę ludzką, B28-N ε -palmitoil Liz B28 Pro B29 insulinę ludzką, B30-N ε -myristoil- Thr B29 Liz B30 insulinę ludzką, B30-N ε -palmitoil-thr B29 Liz B30 insulinę ludzką, B29-N ε -(N-palmitoil-γ- -glutamyl)-des(b30) insulinę ludzką, B29-N ε -(N-litocholil-γ-glutamyl)-des(B30) insulinę ludzką, B29-N ε -(ω-karboksyheptadekanoil)-des (B30) insulinę ludzką i B29-N ε -(ω-karboksyheptadekanoil) insulinę ludzką. Najbardziej korzystnymi pochodnymi są B29-N ε -myristoil-des(b30) insulina ludzka i B29-N ε -(N- -litocholil-γ-glutamyl)-des(b30) insulina ludzka. Wyżej wymienione rozpuszczalne długo działające pochodne insuliny wiążą albuminę i wskazane są do dostarczania stałej zasadniczej dawki insuliny (Markussen, Diabetogia 39, 281,199). Podawanie podskórne raz lub dwa razy dziennie zapewnia wymaganą zasadniczą dawkę insuliny, podczas gdy zaleca się kilkakrotne dzienne inhalacje, gdy stosuje się urządzenia do dostarczania do płuc, korzystnie razem z posiłkami. Pochodne insuliny mają wydłużony czas rozpoczęcia działania i dlatego mogą kompensować bardzo gwałtowny wzrost w plazmie insuliny związany na ogół z dostarczaniem do płuc. Dzięki dokładnej selekcji rodzaju insuliny, wynalazek umożliwia dostosowanie czasu i żądanego profilu działania. W szczególnym wykonaniu wynalazku, preparat insulinowy zawiera analog insuliny lub ludzką insuliny oraz pochodną insuliny. Cząsteczki owe w preparacie insulinowym korzystnie wybiera się z grupy obejmującej, m-krezol, chlorokrezol, tymol lub ich dowolną mieszaninę. Preparaty insulinowe według wynalazku korzystnie mają ph w zakresie od 7 do 8,5, jeszcze korzystniej 7,4 do 7,9. Wynalazek będzie zilustrowany przykładami, które jednak nie stanowią jego ograniczenia. P r z y k ł a d 1 Przygotowano 2,5 ml z zapasu 21 mm roztworu insuliny rozpuszczając 337 mg cynkowej insuliny ludzkiej w 37 μl wody i dodano 23 μl 0,1 M ZnCl 2 i 37 μl wody zanim doprowadzono ph za pomocą 38 μl 0,2 M NaOH i na koniec dodano wodę do objętości 2,5 ml, obliczając objętość właściwą insuliny na poziomie 0,7 μl/mg. Następnie przygotowano preparat mm dodając 350 μl 0,1 M m-krezolu, 175 μl 0,32 M u i soli lub detergentu uzyskując stężenia podane w Tabeli 1, a następnie rozcieńczając w środowisku do, 9,, 3 i 0, mm i przechowywano w temperaturze 5 C. P r z y k ł a d 2 Insulinę cynkową zdyspergowano w wodzie (1:10) w łaźni z lodem, dodano glicyloglicynę (7/) równoważnika i wodorotlenek sodu (3,1 równoważnika) i mieszano wolno przez noc w temperaturze 5 C. Następnie dodano 0,1 równoważnika chlorku cynku i detergent, dostosowano ph do 7,5 za pomocą 0,8 równoważnika kwasu solnego i doprowadzono objętość zanim dodano i wodę i na koniec rozcieńczono mm preparat za pomocą środowiska zawierającego chlorek sodu, glicyloglicynę i detergent uzyskując, 9, i 3 mm insuliny ludzkiej (Tabela 2 i 3). Wyniki przedstawiono w Tabeli 1 do 3. Dane z Tabeli 1 wykazują, że nawet mała ilość fosforanów (to jest 5 mm) zmniejsza trwałość insuliny, a zastąpienie chlorku sodu chlorowodorkiem trihydroksymetyloaminometanem również prowadzi do zmniejszenia rozpuszczalności insuliny. Przeciwnie do soli obojnacza glicyloglicyna i glicyna zwiększa rozpuszczalność insuliny, i możliwe jest dodanie nieoczekiwanie wysokiego stężenia obojnaczej glicyloglicyny i glicyny nie obniżając trwałości insuliny. Glicyloglicyna działa jak bufor przy obojętnym ph, a ponadto zwiększa rozpuszczalność insuliny cynkowej przy ph od obojętnego do zasadowego dzięki umiarkowanemu chelatowaniu cynkowym. W trakcie przechowywania glicyloglicyna

6 PL B1 może również działać jako wychwytacz dla reakcji aminowych. Dodanie niejonowego detergenta tween 20 i poloxameru 188 do 1% wagowego i 3 mm anionowego detergentu taurocholanianu sodu nie zmniejsza trwałości przy przechowywaniu w 5 C. Ocenę wpływu substancji owych dodanych równomolarnie do insuliny pokazano w tabeli 2. Trzy z cząsteczek owych zwiększają trwałość fizyczną od do mm insuliny lub więcej przy niższej temperaturze i zmniejszają tworzenie polimerów przy podwyższonej temperaturze przy czynniku 2-3 (przy niskim stężeniu chlorkowym). W innej grupie badań (tabela 3) odpowiednia ilość u lub chlorokrezolu zmienia się od 0 do 2 w przeliczeniu na insulinę przy wzroście trwałości chemicznej. P r z y k ł a d mg B29-N ε -(N-litocholilo-γ-glutamylo)-des (B30) insuliny ludzkiej (143 nmol/mg) zawieszono w 5 ml wody w 0 C i dodano 220 μl 1N NaOH. Po rozpuszczeniu analogu insuliny dodano 295 μl 0,1 M ZnCl 2 i roztwór mieszano aż rozpuściły się tymczasowe wytrącenia. Dodano kolejno 3 μl 0,32 mm u i 98 μl 0,5 M glicyloglicyny oraz 70 μl 1% Tween 20 i doprowadzono ph do 7,0. W końcu dodano 93 μl wody i roztwór przepuszczono przez sterylny filtr 0,22 μm Millex -GV uzyskując 7 ml 9 mm B29-N ε -(N- -litocholilo-γ-glutamylo)-des(b30) insuliny ludzkiej. Roztwór pozostał trwały po 3 miesiącach w 5 C. T a b e l a 1 Trwałość roztworów insuliny ludzkiej przy konwencjonalnych stężeniach /krezol (stosowanych w wielodawkowych pojemnikach ) jako funkcja stężenia soli, ładunku jonowego i stężenia detergenta. Zaróbka 0,5 Zn 2+ /insulina i krezol 1 mm ph 7,5 i dodano (mm): porównawczy (norm. rozcieńczanie)*) porównawczy (niska siła jonowa) NaCl 10 NaCl 20 NaCl 40 NaCl 0 NaH 2 PO NaCl 20 + NaCl 25 + NaCl 37,5 + NaCl 50 glicyloglicyna 7 glicyloglicyna glicyloglicyna 24 glicyloglicyna 48 glicyloglicyna 72 glicyloglicyna 9 glicyloglicyna 0 glicyna 10 glicyna 20 glicyna 40 glicyna 0 glicyna 80 glicyna 100 trishydroksymetyloaminometan** 7 tris tris 24 tris 48 tween 20 0,05% tween 20 0,2% tween 20 1% tween 20 5% Polox 188 0,2% Polox 188 1% taurocholanian sodu 3 taurocholanian sodu Trwałość fizyczna roztworu w 5 C. Maksymalne stężenie bez wytrąceń w ciągu 4 miesięcy. Badanymi roztworami były odpowiednio 0,, 3,, 9 i mm insuliny 3- < <3 9 *) dodanie 1 μl 1 N kwasu solnego na mg insuliny odpowiadający około równoważnikom chlorku **) zobojętniony kwasem solnym

7 PL B1 7 T a b e l a 2 Trwałość insuliny ludzkiej przy równomolowych stężeniach konserwantów owych Zaróbka 0,5 Zn 2+ /insulina NaCl mm glicyloglicyna 7 mm, tween 20 0,01%, ph 7,5 i równoważnik krezol chlor-krezol tymol porównawczy (bez związków owych) Fizyczna trwałość roztworu w 5 C Maksymalne trwałe stężenie bez wytrąceń w ciągu 3 miesięcy przy 3,, 9,, mm insuliny 9 Chemiczna trwałość w 37 C % polimer/tydzień 3 i mm insuliny 0,55 0,5 0,37 0,39 0,51 0,40 0,85 1,25 0,94 1,49 T a b e l a 3 Trwałość insuliny ludzkiej przy różnych stężeniach konserwantów owych Zaróbka 0,5 Zn 2+ /insulina NaCl mm, glicyloglicyna 7 mm, tween 20 0,01%, ph 7,5 porównawczy chloro-krezol chloro-krezol chloro-krezol chloro-krezol Równoważnik związku owego na cząsteczkę insuliny 0 0,33 0,7 1 2 i 1,33 0,33 0,7 1 2 i 1,33 Chemiczna trwałość w 37 C % polimer/tydzień 3 i 9 mm insuliny 0,99 1,43 0,9 0,9 0,52 0,55 0,4 0,38 0,27 0,2 0, 0,93 0,48 0,58 0,30 0,30 0,13 0,18 Zastrzeżenia patentowe 1. Wodny preparat insulinowy, znamienny tym, że zawiera: do mm insuliny ludzkiej lub jej analogu lub pochodnej, mniej niż 50 mm chlorku, mniej niż 10 mm dowolnego anionu innego niż chlorek i octan, 2 do 5 jonów Zn 2+ na sześć cząsteczek insuliny i co najmniej 3 cząsteczki owe na sześć cząsteczek insuliny. 2. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera około mm, około 9 mm, około mm, lub około mm insuliny ludzkiej lub jej pochodnej lub jej analogu. 3. Preparat insulinowy według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera do 50 mm cząsteczek owych, zwłaszcza 3 do cząsteczek owych na sześć cząsteczek insuliny, szczególnie 3 do 99 cząsteczek owych na sześć cząsteczek insuliny. 4. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera poniżej 40 mm, korzystnie poniżej 30 mm, a zwłaszcza od 5 do 20 mm chlorku. 5. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera do 5 mm fosforanu.. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera 2 do 4 jonów Zn 2+, zwłaszcza 2,2 do 3,2 jonów Zn 2+ na sześć cząsteczek insuliny. 7. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera 5 do 0 mm obojnaczej aminy, zwłaszcza glicyloglicynę lub glicynę. 8. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera 5 do 50 mm trishydroksymetyloaminometanu. 9. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera jako kationy jony sodu, jony potasu lub ich mieszaninę. 10. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera od 0,001 do 1% wagowego niejonowego środka powierzchniowo czynnego, zwłaszcza monolaurynianu polioksoetylenoheksa-2,4-dienodiolu lub związku o wzorze (OH (CH 2 CH 2 O) 75 (CH(CH 3 ) CH 2 O) 30 (CH 2 CH 2 O) 75 H).

8 8 PL B1 11. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dodatkowo 1 mm do 10 mm anionowego środka powierzchniowo czynnego, zwłaszcza taurocholanu sodu.. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera insulinę ludzką. 13. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera analog insuliny ludzkiej, w którym w pozycji B28 jest Asp, Liz, Leu, Val lub Ala a pozycji B29 Liz lub Pro; lub des(b28-b30), des(b27) lub des(b30) insulinę ludzką. 14. Preparat insulinowy według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera analog insuliny ludzkiej, w których w pozycji B28 jest Asp lub Liz, a w pozycji B29 jest Liz lub Pro, zwłaszcza Asp B28 insulinę ludzką lub Liz B28 Pro B29 insulinę ludzką.. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera pochodną insuliny ludzkiej, mającą jeden lub więcej lipofilowych podstawników, zwłaszcza insulinę acylowaną. 1. Preparat insulinowy według zastrz., znamienny tym, że pochodną insuliny wybiera się spośród grupy obejmującej B29-N ε -myristoil-des(b30) insulinę ludzką, B29-N ε -palmitoil-des(b30) insulinę ludzką, B29-N ε -myristoil insulinę ludzką, B29-N ε -palmitoil insulinę ludzką, B28-N ε -myristoil Liz B28 Pro B29 insulinę ludzką, B28-N ε -palmitoil Liz B28 Pro B29 insulinę ludzką, B30-N ε -myristoil-thr B29 Liz B30 insulinę ludzką, B30-N ε -palmitoil-thr B29 Liz B30 insulinę ludzką, B29-N ε -(N-palmitoil-γ-glutamyl) - des(b30) insulinę ludzką, B29-N ε -(N-litocholil-γ-glutamyl)-des(B30) insulinę ludzką, B29-N ε -(ω-karboksyheptadekanoil)-des(b30) insulinę ludzką i B29-N ε -(ω-karboksyheptadekanoil) insulinę ludzką. 17. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że pochodną insuliny ludzkiej jest B29-N ε -myristoil-des(b30) insulina ludzka lub B29-N ε -(N-litocholil-γ-glutamyl)-des (B30) insulina ludzka. 18. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera analog insuliny lub ludzką insulinę oraz pochodną insuliny. 19. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że cząsteczki owe wybiera się spośród grupy obejmującej, m-krezol, chlor-krezol, tymol lub dowolnej ich mieszaniny. 20. Preparat insulinowy według zastrz. 1, znamienny tym, że ma ph w zakresie od 7 do 8,5, zwłaszcza 7,4 do 7,9. Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.