(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (1) Int. Cl. A61K39/ (06.01) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy /21 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Kompozycja immunogenna i sposoby () Pierwszeństwo: US047876P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 0/1 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 29.. Wiadomości Urzędu Patentowego / (73) Uprawniony z patentu: Wyeth LLC, Madison, US (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 ELDRIDGE John H., Somers, US ISRAEL Zimra R., New York, US EGAN Michael A., Chester, US UDEM Stephen A., New York, US (74) Pełnomocnik: Sulima Grabowska i Sierzputowska Biuro Patentów i Znaków Towarowych sp.j. rzecz. pat. Sulima Zofia Warszawa skr. poczt. 6 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-13VAL EP B1 Opis 1 2 TŁO WYNALAZKU [0001] W celu zwiększenia skuteczności kompozycji immunogennych, opisano wiele róŝnych kompozycji immunogennych i sposobów z zastosowaniem kompozycji białkowych, kompozycji opartych na plazmidach oraz rekombinowanych konstruktów wirusowych jako kompozycji immunogennych. Wcześniejsze badania wykazały, Ŝe oparte na plazmidach kompozycje immunogenne, po zastosowaniu ogólnoustrojowym, preaktywują ogólnoustrojowy układ immunologiczny względem drugiej immunizacji ogólnoustrojowej tradycyjnym antygenem, takim jak białko lub rekombinowany wirus (patrz np. Xiang i in., 1997 Springer Semin. Immunopathol., 19:27-268; Schneider, J i in.,1998 Nature Med, 4:397; i Sedeguh, M. i in., 1998 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 9:7648; Rogers, W. O. i in., 01 Infec. & Immun., 69(9):6-72; Eo, S. K, i in., 01 J. Immunol., 166(9):473-9; Ramshaw L A. i Ramsay, A. J., 00 Immunol. Today, 21(4):163-). Praca przeglądowa na temat znanych układów dostarczania szczepionek w odniesieniu do HIV, patrz Sutter i in., 01 AIDS 1(suplement ): S139-S14. [0002] Często stosowany tryb szczepienia DNA w dawce pierwotnej/ŝywy wektor w dawce przypominającej obejmuje zastosowanie wirusów krowianki jako dawki przypominającej. Niedawno opublikowane przykłady w literaturze obejmują taką immunizację dla ludzkiego wirusa nabytego niedoboru odporności (HIV) (Hanke T. i in., 02 Vaccine. (1):199-8; Amara R.R. i in., 02 Vaccine. (1):1949-; Wee B.G. i in., 02 J. Gen. Virol., 83(Pt1):7-80; Amara R.R. i in., 01 Science. 292(14):69-74). Opisano, Ŝe immunizacja dawką pierwotną-dawką przypominającą z zastosowaniem DNA i zmodyfikowanych wektorów krowianki eksprymujących antygeny, takie jak glikoproteina D wirusa opryszczki pospolitej-2, antygen P36/LACK Leishmania infantum, antygen TRAP Plasmodium falciparum, antygeny HIV/SIV, antygeny mysiej gruźlicy oraz antygeny grypy, wywołuje specyficzne odpowiedzi przeciwciał i cytokin (patrz np. Meseda C.A. i in., 02 J. Infect. Dis., 186(8):6-73; Amara RR. i in., 02 J. Virol, 76(1):762-31; Gonzalo RM. i in., 02 Vaccine. (7-8): ; Schneider J. i in., 01 Vaccine, 19(32):49-602; Hel Z. i in., 01 J. Immunol, 167(12): ; McShame H. i in., 01 Infec. & Immun, 69(2):681-6 i Dagano P. i in Vaccine, 18(7-8): modele grypy i malarii). [0003] Niedawno opisano, Ŝe tryby szczepień plazmidem w dawce pierwotnej-

3 adenowirusem w dawce przypominającej wywołują specyficzną względem alfafetoproteiny odporność przeciwnowotworową i chronią świnie przed klasyczną świńską gorączką (patrz np. Meng W.S. 01 Cancer Res., 61(24):8782-6; Hammond, J.M. i in., 01 Vet. Microbio, 80(2):1-19; oraz opis patentowy US nr 62663). [0004] Opisano inne tryby plazmid w dawce pierwotnej-wirus w dawce przypominającej. Patrz np. Matano T. i in., 01 J. Virol., 7(23): (DNA w dawce pierwotnej/wektor wirusa Sendai w dawce przypominającej). Dawkę pierwotną z DNA z dawką przypominającą z rekombinowanym pokswirusem opisano w leczeniu HIV-1 (Patrz np. Kent, S.J. i in., 1998 J. Virol, 72:180-8; Robinson, H.L. i in., 1999 Nat. Med, :26-34; and Tartaglia, J. i in., 1998 AIDS Res. Human Retrovirus., 14:S291-8). [000] Rekombinowane wektory VSV opisano w Haglund i in., 02 Journal of Virology 76(6): , WO 96/3462 i WO 02/ Pomimo, Ŝe oceniano kilka trybów DNA w dawce pierwotnej/wirus w dawce przypominającej, obecnie opisane tryby sczepienia wykazują kilka wad. Przykładowo, niektóre z tych wspomnianych powyŝej wirusów wywołują u pacjentów objawy chorobowe; inne mogą powodować rekombinację in vivo. Jeszcze inne wirusy trudno jest wytwarzać i/lub wykazują one ograniczoną zdolność do akceptowania obcych genów. Jeszcze inne wirusy mają wady wywołane przez istotną istniejącą juŝ oporność na wektor u człowieka oraz inne względy bezpieczeństwa. [0006] W dziedzinie wynalazku pozostaje potrzeba opracowania nowych i przydatnych trybów immunizacji, które mogą wytworzyć zwiększone poziomy humoralnych odpowiedzi immunologicznych na dane antygeny i spełniają wymagania bezpieczeństwa, produkcji oraz wykazują zdolność przełamania naturalnych odpowiedzi immunologicznych ssaczych gospodarzy na wektory stosowane w immunizacji przypominającej. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0007] Niniejszy wynalazek dotyczy nowego sposobu i kompozycji oraz dostarcza zestaw do wywoływania u osobnika będącego ssakiem odpowiedzi immunologicznej przeciw patogennemu antygenowi lub innemu antygenowi przez szczepienie w trybie dawka pierwotna/dawka przypominająca, które wykazuje zaskakująco synergistyczną stymulację komórkowych odpowiedzi immunologicznych na antygen w porównaniu z wynikami uzyskanymi dla składnika plazmidu DNA lub składnika rekombinowanego wirusa, gdy podaje się je pojedynczo. [0008] W jednej postaci wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla antygenu u osobnika będącego ssakiem. Sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi skutecznej ilości pierwszej kompozycji zawierającej plazmid DNA zawierający sekwencję DNA kodującą antygen pod kontrolą sekwencji regulatorowych

4 kierujących jego ekspresją przez plazmid DNA w komórce ssaczej. Sposób ponadto obejmuje podawanie osobnikowi skutecznej ilości drugiej kompozycji zawierającej rekombinowany wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (rvsv) zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą antygen pod kontrolą sekwencji regulatorowych kierujących jego ekspresją przez rvsv w komórce ssaczej. W jednej postaci rekombinowany VSV jest wirusem atenuowanym, zdolnym do replikacji. W innej postaci rekombinowany VSV jest wirusem niereplikującym się. Pierwszą i druga kompozycję moŝna podawać w dowolnej kolejności. Ponadto wynalazek bierze pod uwagę podawanie wielu dawek jednej z kompozycji, po czym podaje się wiele dawek drugiej kompozycji. W jednej postaci korzystnie współpodaje się cytokinę. [0009] W innej postaci wynalazek dotyczy immunogennej kompozycji do wywoływania odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla antygenu na antygen osobnika będącego ssakiem. Kompozycja immunogenna zawiera pierwszą kompozycję zawierającą plazmid DNA zawierający sekwencję DNA kodującą antygen pod kontrolą sekwencji regulatorowych kierujących jego ekspresją przez plazmid DNA w komórce ssaczej. Kompozycja ta takŝe zawiera co najmniej jeden zdolny do replikacji, rekombinowany wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ten sam antygen pod kontrolą sekwencji regulatorowych kierujących jego ekspresją przez rekombinowany VSV. [00] W jeszcze innej postaci wynalazek dostarcza zestaw do stosowania w terapeutycznym lub profilaktycznym sposobie wywoływania zwiększonego poziomu odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla antygenu u osobnika będącego ssakiem. Zestaw zawiera, między innymi, co najmniej jedną pierwszą kompozycję zawierającą plazmid DNA zawierający sekwencję DNA kodującą antygen pod kontrolą sekwencji regulatorowych kierujących jego ekspresją w komórce ssaczej; co najmniej jedną drugą kompozycję zawierającą zdolny do replikacji, rekombinowany wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (rv- SV) zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą wspomniany antygen pod kontrolą sekwencji regulatorowych kierujących jego ekspresją we wspomnianej komórce ssaczej; oraz instrukcje wykonywania wspomnianego powyŝej sposobu. [0011] W innej postaci wynalazek dostarcza zastosowanie opisanej powyŝej kompozycji immunogennej lub jej składników do wytwarzania leku do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia na antygen stosowany w kompozycji. [0012] Inne aspekty i postaci niniejszego wynalazku są ujawnione w poniŝszym szczegółowym opisie. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW

5 [0013] FIG. 1A przedstawia schematyczny diagram plazmidu DNA kodującego białko gag p37 małpiego wirusa niedoboru odporności (SIV). Diagram pokazuje, Ŝe plazmid zawiera promotor/wzmacniacz ludzkiego wirusa cytomegalii (HCMV) kierujący ekspresją białka gag, miejsce poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH polia), sekwencję miejsca startu replikacji (ori) oraz gen markerowy oporności na kanamycynę (kan R ). FIG. 1B przedstawia schematyczny diagram bicistronowego plazmidu DNA kodujący dwie podjednostki p3 i p40 interleukiny 12 rezusa. Podjednostka p3 jest pod kontrolą promotora HCMV i zawiera miejsce polia SV40. Podjednostka p40 jest pod kontrolą promotora małpiego wirusa cytomegalii (SCMV) i zawiera miejsce polia BGH i jest transkrybowana w odwrotnym kierunku. Plazmid zawiera takŝe sekwencję ori oraz gen kan R. FIG. 2 przedstawia wykres słupkowy pokazujący VSV N-specyficzne odpowiedzi ELISpot interferonu gamma (IFN-γ) w niefrakcjonowanych komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od zwierząt szczepionych w trybie dawka pierwotna/dawka przypominająca według niniejszego wynalazku. Ciemne słupki znajdujące się najbardziej po lewej reprezentują protokół immunizacji plazmidem DNA kodującym białko gag SIV z dawką przypominającą wektorem VSV eksprymującym białko hemaglutyninę grypy (flu HA). Słupki jasno szare reprezentują protokół według wynalazku obejmujący pierwotną immunizację plazmidem DNA gag, a następnie dawką przypominającą VSV eksprymującą białka gag i env HIV. Jasne słupki reprezentują protokół obejmujący pierwotną immunizację pustym lub kontrolnym plazmidem DNA (con DNA), a następnie immunizację VSV eksprymującym białka gag i env HIV. Ciemne słupki znajdujące się najbardziej po prawej reprezentują protokół obejmujący pierwotną immunizację plazmidem con DNA, a następnie immunizację VSV eksprymującym białko HA grypy. KaŜda grupa przedstawia wyniki dla zwierząt. FIG. 3 przedstawia wykres słupkowy pokazujący HIVenv 61-specyficzne odpowiedzi ELISpot interferonu gamma (IFN-γ) w niefrakcjonowanych PBMC od zwierząt szczepionych harmonogramem dawka pierwotna/dawka przypominająca według niniejszego wynalazku. Jasno szare słupki znajdujące się najbardziej po lewej reprezentują protokół immunizacji plazmidowym DNA kodującym białko gag SIV z dawką przypominającą wektorem VSV eksprymującym białko HA grypy. PrąŜkowane słupki reprezentują protokół według wynalazku obejmujący immunizację

6 1 2 3 pierwotną plazmidem DNA gag, a następnie immunizację przypominającą VSV eksprymującym białka gag i env HIV. PrąŜki z szachownicą reprezentują protokół obejmujący immunizację pierwotną pustym kontrolnym DNA, a następnie immunizację VSV eksprymującym białka gag i env HIV. Słupki kropkowane reprezentują protokół obejmujący immunizację pierwotną kontrolnym plazmidem DNA, a następnie immunizację przypominającą VSV eksprymującym białko HA grypy. KaŜda grupa przedstawia wyniki dla zwierząt. Gwiazdki wskazują, gdzie wystąpiły róŝnice istotne statystycznie przy p=0,0001. FIG. 4 przedstawia wykres pokazujący miano surowiczych przeciwciał przeciw-gag p27 SIV mierzone testem immunonenzymatycznym (ELISA) u zwierząt szczepionych według harmonogramu dawka pierwotna/dawka przypominająca według niniejszego wynalazku. Plazmid DNA podano w dniu 0, tygodniu 4 oraz tygodniu 8, a dawki przypominające VSV (serotyp Indiana G) i VSV (serotyp Chandipura G) podano odpowiednio w tygodniu 1 i 23. Protokół immunizacji plazmidem DNA kodującym białko gag SIV z dawką przypominającą wektora VSV eksprymującego białko HA grypy oznaczono ( ). Protokół według wynalazku obejmujący immunizację pierwotną plazmidem DNA gag, a następnie immunizację przypominającą VSV eksprymującym białka gag i env HIV przedstawiono symbolem ( ). Protokół obejmujący immunizację pierwotną pustym kontrolnym DNA, a następnie immunizację VSV eskprymującym białka gag i env HIV przedstawiono symbolem ( ). Protokół obejmujący immunizację pierwotną kontrolnym plazmidem DNA, a następnie immunizację VSV eksprymującym białko HA grypy przedstawiono symbolem ( ). KaŜda grupa przedstawia wyniki uzyskane dla zwierząt. RóŜnice istotne statystycznie pomiędzy grupami przedstawiono jako p=0,0073 (*); p=0,941 (#) lub p=0,0027 ( ). FIG. stanowi wykres przedstawiający liczbę komórek tworzących punkty specyficzne dla gag SIV na milion komórek, ocenianą w teście ELISpot dla zwierząt szczepionych w trybie dawka pierwotna/dawka przypominająca według niniejszego wynalazku. Plazmid DNA podano w dniu 0, tygodniu 4 oraz tygodniu 8, a dawki przypominające VSV (serotyp Indiana G) i VSV (serotyp Chandipura G) podano w tygodniach odpowiednio 1 i 23. Protokół immunizacji plazmidem DNA kodującym białko gag SIV z dawką przypominającą wektora VSV eksprymującego białko HA przedstawiono symbolem ( ). Protokół według wynalazku obejmujący immunizację pierwotną plazmidem DNA gag, a następnie immunizację przypominającą VSV eksprymującym białka gag i env HIV przedstawiono symbolem ( ). Protokół obejmują-

7 cy immunizację pierwotną pustym kontrolnym plazmidem DNA, a następnie immunizację VSV eksprymującym białka gag i env HIV przedstawiono symbolem ( ). ( ) reprezentuje protokół obejmujący immunizację pierwotną kontrolnym plazmidem DNA, a następnie immunizację VSV eksprymującym białko HA grypy. KaŜda grupa przedstawia wyniki uzyskane dla zwierząt. Statystycznie istotne róŝnice pomiędzy grupami wskazano przez nawiasy dla p=0,0001 i p=0,0002. FIG. 6 przedstawia wykres pokazujący, Ŝe podwyŝszone odpowiedzi immunologiczne wywoływane przez połączenia dawka pierwotna/dawka przypominająca, wskazane symbolami, takimi jak na Fig., wywołują zwiększoną ochronę przeciw AIDS, co zmierzono przez zmniejszoną utratę komórek CD4 T w dniach po teście prowokacji. FIG. 7 przedstawia wykres pokazujący, Ŝe podwyŝszone odpowiedzi immunologiczne wywoływane przez połączenia dawka pierwotna/dawka przypominająca, wskazane przez symbolami, takimi jak na Fig., wywołują zwiększoną ochronę przeciw AIDS, co zmierzono przez spadek wirusa krąŝącego w osoczu (kopie wirusa/ml) w dniach po teście prowokacji. SZCZEGÓŁOWY OPIS WEDŁUG WYNALAZKU [0014] Wynalazek dotyczy sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla antygenu u osobnika będącego ssakiem lub osobnika będącego kręgowcem przez zastosowanie połączenia pewnych składników kompozycji immunogennych opisanych wcześniej w dziedzinie wynalazku oraz optymalizacji składników w celu wytworzenia zaskakujących i synergistycznych wyników. Ogólnie sposób obejmuje podawanie osobnikowi skuteczniej ilości kompozycji, która zawiera plazmid DNA zawierający sekwencję DNA kodującą antygen pod kontrolą sekwencji regulatorowych kierujących jej ekspresją przez plazmid DNA w komórce ssaczej lub komórce kręgowca. Sposób takŝe obejmuje etap podawania osobnikowi skuteczniej ilości kompozycji zawierającej zdolny do replikacji, rekombinowany wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (rvsv). Ten rvsv zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą antygen pod kontrolą sekwencji regulatorowych kierujących jego ekspresją przez rvsv w komórce ssaczej lub komórce kręgowca. [001] Pierwsza z tych dwóch kompozycji immunogennych, które mają być podawane w kolejności jest nazywana kompozycją pierwotną. Druga z tych dwóch kompozycji immunogennych, które mają być podawane w kolejności jest nazywana kompozycją przypominającą. Zatem moŝna podawać kompozycję DNA jako kompozycję pierwotną, a kompozycję wektora VSV moŝna podawać jako kompozycję przypominającą lub na odwrót. W jednej postaci kompozycję pierwotną podaje się osobnikowi co najmniej raz lub wiele razy

8 przed podaniem kompozycji przypominającej. Następnie kompozycję przypominającą podaje się kolejno osobnikowi co najmniej raz lub wiele razy. Wynalazek uwzględnia podawanie wielu dawek innej kompozycji. Sposób dalej uwzględnia zastosowanie skutecznej ilości cytokiny jako etapu w sposobie. [0016] Nieoczekiwanie stwierdzono, Ŝe realizacja tego sposobu wywołuje u osobnika będącego ssakiem odpowiedź immunologiczną obejmującą wzrost odpowiedzi komórek CD8+ T na antygen, wyŝszy niŝ uzyskiwany przez podawanie samego plazmidu DNA lub rekombinowanego VSV. W rzeczywistości, jak wskazano w przykładach poniŝej, odpowiedź immunologiczna jest wyŝsza niŝ ta oczekiwana przez addytywne połączenie tych dwóch kompozycji immunogennych. Zatem odpowiedź immunologiczna wywoływana nowym sposobem oznacza zdecydowany i synergistyczny wzrost odpowiedzi komórkowych i/lub przeciwciał na antygen. Patrz np. Tabela 1 poniŝej oraz FIG. 4 i, na których szczytowa specyficzna dla antygenu odpowiedź komórkowa na gag HIV-1 jest ponad 3- krotnie wyŝsza niŝ odpowiedź na podanie samej kompozycji immunogennej z plazmidem DNA lub prawie 9-krotnie wyŝsza niŝ odpowiedź na podanie samej kompozycji immunogennej rvsv. [0017] Choć bierze się pod uwagę, Ŝe osobnikiem będącym ssakiem jest ssak naczelny, korzystnie człowiek, wynalazek nie jest ograniczony przez identyfikację osobnika ssaczego. PoniŜej szczegółowo opisano składniki tego sposobu wraz z odniesieniem do cytowanych dokumentów w celu dostarczenia szczegółów znanych fachowcom w dziedzinie wynalazku. A. DNA. Kompozycja immunogenna z plazmidem [0018] Kompozycje immunogenne według wynalazku zawierają plazmid DNA zawierający sekwencję DNA kodującą wybrany antygen, na który poŝądana jest odpowiedź immunologiczna. W plazmidzie wybrany antygen jest pod kontrolą sekwencji regulatorowych kierujących jego ekspresją w komórce ssaczej lub kręgowca. Składniki samego plazmidu są standardowe. [0019] Niewirusowe, plazmidowe wektory uŝyteczne w wynalazku zawierają izolowane i oczyszczone sekwencje DNA zawierające sekwencje DNA, które kodują wybrany antygen immunogenny. Cząsteczka DNA moŝe być pochodzenia wirusowego lub niewirusowego, np. z gatunku bakterii, które zaprojektowano do kodowania egzogennej lub heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego. Takie plazmidy lub wektory mogą zawierać sekwencje z wirusów lub fagów. W dziedzinie wynalazku znanych jest wiele róŝnych wektorów niewirusowych i mogą one obejmować, ale nie tylko, plazmidy, wektory bakteryjne, wektory bakteriofagowe, nagi DNA oraz DNA skondensowany z kationowymi lipidami lub po-

9 limerami. [00] Przykłady wektorów obejmują, ale nie tylko, sekwencje pochodzące między innymi z Bacille Calmette Guérin (BCG), Salmonella, Shigella, E. coli i Listeria. Odpowiednie wektory plazmidowe obejmują przykładowo pbr322, pbr32, pacyc177, pacyc184, puc8, puc9, puc18, puc19, plg339. pr290, pk37, pkc1,pac, pva1, pkh47, pub1, pmb9, pbr32, Col E1, psc1, pbr313, pml21, RSF2124, pcr1, RP4, pbad18 oraz pbr328. [0021] Przykłady odpowiednich indukowalnych wektorów ekspresyjnych Escherichia coli obejmują ptrc (Amann i in.,1988 Gene, ), arabinozowe wektory ekspresyjne (np., pbad18, Guzman i in., 199 J. Bacteriol., 177: ) oraz petiid (Studier i in.,1990 Methods in Enzymology, 18:60-89). Ekspresja docelowego genu z wektora ptrc zaleŝy od transkrypcji przez polimerazę RNA gospodarza z hybrydowego promotora fuzyjnego tip-lac. Ekspresja genu docelowego z wektora petiid zaleŝy od transkrypcji z promotora fuzyjnego 77 gn-lac kierowanej przez koeksprymowaną wirusową polimerazę RNA T7 gn1. Ta wirusowa polimeraza jest dostarczana przez szczepy gospodarzy BL21 (DE3) lub HMS I74(D133) z rezydentnego profaga niosącego gen T7 gn1 pod kontrolą transkrypcyjną promotora lacuv. System pbad zaleŝy od indukowalnego promotora arabinozowego, który jest regulowany przez gen arac. Promotor jest indukowalny w obecności arabinozy. [0022] Promotor i inne sekwencje regulatorowe, które kierują ekspresją antygenu w wymaganym gospodarzu będącym ssakiem lub kręgowcem, mogą być podobnie wybrane z długiej listy promotorów znanych z tego, Ŝe są przydatne do tego celu. Wiele róŝnych takich promotorów ujawniono tutaj poniŝej. W jednej opisanej poniŝej postaci immunogennej kompozycji plazmidu DNA przydatnymi promotoramni są promotor/wzmacniacz z wirusa cytomegalii (HCMV) (opisany np. opisach patentowych US nr i 38839) oraz promotor/wzmacniacz SCMV. [0023] Dodatkowe sekwencje regulatorowe do włączenia do sekwencji kwasu nukleinowego, cząsteczki lub wektora według wynalazku obejmują, ale nie tylko, sekwencję wzmacniacza, sekwencję poliadenylacji, splicingową sekwencję donorową i splicingową sekwencję akceptorową, miejsce startu transkrypcji i miejsce końca transkrypcji umiejscowione, odpowiednio, na początku i na końcu polipeptydu, który ma ulec translacji, miejsce wiązania rybosomu do translacji transkrybowanego regionu, znacznik epitopowy, sekwencję lokalizacji jądrowej, element IRES, element TATA Goldberg-Hogness, miejsce/rozszczepienia przez enzym restrykcyjny, marker selekcyjny itp. Sekwencje wzmacniacza obejmują np. tandemowe powtórzenie o wielkości 72 pz z DNA SV40 lub retrowi-

10 tusowe długie końcowe powtórzenia czyli lub LTR itd., przy czym stosuje się je do zwiększenia wydajności transkrypcji. [0024] Te inne składniki uŝyteczne w plazmidach DNA, obejmujące np. miejsca startu replikacji, sekwencje poliadenylacji (np. polia BGH, polia SV40), markery oporności na lek (np. oporności na kanamycynę) itp., moŝna takŝe wybrać z szeroko znanych sekwencji, włącznie z tymi, które opisano w przykładach i konkretnie wymieniono poniŝej. [002] Wybór promotorów oraz innych powszechnych elementów wektora jest standardowy i dostępnych jest wiele takich sekwencji, z uŝyciem których moŝna zaprojektować plazmidy uŝyteczne w wynalazku. Patrz np. Sambrook i in., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1989) oraz cytowane tam pozycje literaturowe, przykładowo na stronach i oraz Ausubel i in., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989). Wszystkie składniki plazmidów uŝytecznych w wynalazku moŝe łatwo wybrać fachowiec w dziedzinie wynalazku spośród innych materiałów znanych w dziedzinie wynalazku oraz dostępnych z przemysłu. Wybór składników plazmidu i sekwencji regulatorowych z zamierzenia nie ogranicza zakresu wynalazku. [0026] Przykłady odpowiednich konstruktów plazmidu DNA do zastosowania w kompozycjach immunogennych opisano szczegółowo w następujących opisach patentowych, przykładowo, między innymi, w międzynarodowych publikacjach patentowych nr WO98/17799, WO99/43839 i WO98/17799; oraz opisach patentowych US nr 93972, , 8876 i [0027] Podobnie wybranym antygen moŝe być antygen zidentyfikowany w poniŝszej dyskusji. W jednej postaci niniejszych kompozycji immunogennych, wybranym antygenem jest antygen HIV-1, taki jak ten eksprymowany przez gag pol, env, nef, vpr, vpu, vif oraz tat. Korzystnie, sekwencja antygenu oraz inne składniki plazmidu DNA są zoptymalizowane, przykładowo przez wybór kodonów odpowiednich dla wybranego gospodarza oraz przez usunięcie sekwencji hamujących, co takŝe omówiono poniŝej w odniesieniu do przygotowywania antygenu. [0028] Zatem ta kompozycja immunogenna moŝe zawierać jeden plazmid kodujący pojedynczy antygen do ekspresji w gospodarzu. Zgodnie z niniejszym sposobem, kompozycja plazmidowa zawiera takŝe jeden plazmid DNA zawierający sekwencję DNA kodującą więcej niŝ jedną kopię tego samego wybranego antygenu. Alternatywnie, kompozycja mo- Ŝe zawierać jeden plazmid eksprymujący wiele wybranych antygenów. KaŜdy antygen moŝe być pod kontrolą osobnych elementów lub składników regulatorowych. Alternatywnie, kaŝdy antygen moŝe być pod kontrolą takich samych elementów regulatorowych. W

11 1 2 3 jeszcze kolejnej postaci kompozycja plazmidu DNA moŝe zawierać wiele plazmidów, przy czym kaŝdy plazmid DNA koduje ten sam lub inny antygen. [0029] W jeszcze innej postaci, kompozycja immunogenna plazmidu DNA moŝe ponadto zawierać, jako składnik indywidualnego plazmidu DNA lub jako część plazmidu DNA zawierającego antygen, sekwencję nukleotydową kodującą wymaganą cytokinę, limfokinę lub inny adiuwant genetyczny. Gospodarza dla takich odpowiednich adiuwantów, dla których dostępne są sekwencje kwasu nukleinowego, zidentyfikowano poniŝej. W przykładowych postaciach podanych w wynalazku wymaganą cytokiną do podawania z kompozycją plazmidu DNA według wynalazku jest Interleukina-12. [00] Kompozycję plazmidu DNA korzystnie podaje się w farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalniku, zaróbce lub nośniku, takim jak te omówione poniŝej. Pomimo, Ŝe kompozycję moŝna podawać dowolną wybraną drogą podawania, w jednej postaci poŝądanym sposobem podawania jest współpodawanie domięśniowe kompozycji zawierającej plazmidy z bupiwakainą jako środkiem pomocniczym, jak opisano poniŝej. [0031] W jednej postaci sposobu według niniejszego wynalazku, w której kompozycja DNA jest kompozycją pierwotną, sposób obejmuje podawanie co najmniej jednego plazmidu DNA przed rvsv, przy czym plazmid zawiera sekwencję kodującą antygen, na który poŝądane jest wytworzenie odpowiedzi immunologicznej. W innej postaci kompozycja pierwotna DNA zawiera ponadto drugi plazmid kodujący wybraną cytokinę. W jeszcze innej postaci podanej przykładowo poniŝej kompozycja pierwotna DNA zawiera trzy plazmidy, jeden plazmid eksprymujący pierwszy antygen, drugi plazmid eksprymujący inny antygen oraz trzeci plazmid eksprymujący wybrany adiuwant cytokinowy. Jak to szczegółłowo podano w przykładach, jedna postać pierwotnej kompozycji DNA zawiera trzy zoptymalizowane plazmidy, (1) plazmid kodujący RNA zoptymalizowanego genu gag p37 SIV (patrz FIG. 1A); (2) plazmid kodujący dwie podjednostki IL-12 p3 i p40 rezusa, pod indywiduwalną kontrolą dwóch promotorów (patrz FIG. 1B) oraz (3) plazmid kodujący gen gp160 env HIV-1. [0032] Przy stosowaniu pierwotnej kompozycji, kompozycję plazmidu DNA podaje się raz lub korzystnie więcej niŝ jeden raz przed podaniem kompozycji przypominającej rvsv. Przy podawaniu kompozycji przypominającej, kompozycję plazmidu DNA podaje się raz lub korzystnie więcej niŝ raz po podaniu pierwotnej kompozycji rvsv. B. Kompozycja immunogenna rvsv [0033] Inną kompozycją immunogenną uŝyteczną w sposobach i kompozycjach według wynalazku jest nośnik dostarczający zdolny do replikacji, Ŝywy, atenuowany wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV). Ten rekombinowany VSV zawiera sekwencję

12 kwasu nukleinowego kodującą wybrany antygen pod kontrolą sekwencji regulatorowych kierujących jego ekspresją w komórce ssaczej lub kręgowca. Rekombinowane wektory VSV opisano w Haglund i in., 02 Journal of Virology 76(6): , WO 96/3462 i WO 02/ W sposobach według wynalazku antygen stosowany w kompozycji plazmidu DNA jest taki sam jak antygen stosowany w kompozycji immunogennej rvsv. [0034] VSV jest wirusem bydła, który jest członkiem rzędu takosnomicznego nazwanego Mononegavirales i zawiera niesegmentowany genom RNA o wielkości 11 kilopar zasad (kpz), o ujemnej polarności, kodujący cztery wewnętrzne białka strukturalne oraz jedno zewnętrzne białko transbłonowe. W kierunku 3' do ' geny kodują białka nazwane nukleokapsydem (N), fosfoproteiną (P), białkiem macierzowym (M), glikoproteiną transbłonową (G) oraz polimerazą (L). śywy VSV moŝe zostać wyizolowany i odzyskany technikami znanymi w dziedzinie wynalazku. Patrz np. opisy patentowe US nr , i ; międzynarodowa publikacja patentowa WO99/0267; Conzelmann, 1998, Ann. Rev. Genet., 32: ; Roberts i Rose, 1998, Virol., 247:1-6; Lawson i in., 199 Proc. Natl. Acad Sci., USA 92: Dodatkowo, przykładowo, genomowa sekwencja VSV (Indiana) jest dostępna pod nr dostępu NC00160 w bazie danych NCBI. Inne sekwencje VSV, włącznie z sekwencjami VSV (Chandipura), są dostępne w tej bazie danych; przykładowo, patrz, między innymi, nr dostępu Ay382603, Af128868, V018, V017, V016, M16608, M1471, M147 i J04. Szczepy VSV, takie jak New Jersey i Indiana, są między innymi takŝe dostępne z depozytów, takich jak American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (patrz np. nr dostępu VR-1238 i VR-1239). Inne sekwencje opisano lub wspomniano w dokumentach cytowanych w niniejszym opisie. [003] Wykazano, Ŝe genomy VSV przyjmują więcej niŝ jeden obcy gen, ze zwiększeniem wielkości genomu do co najmniej trzech kpz. Genomy tych wirusów są bardzo stabilne, nie przechodzą rekombinacji oraz rzadko ulegają znacznej mutagenezie. Ponadto, poniewaŝ ich replikacja jest cytoplazmatyczna oraz ich genomy są złoŝone z RNA, nie są one zdolne do integracji z genomami zakaŝonych komórek gospodarzy. Ponadto te wirusy RNA o polarności ujemnej mają stosunkowo proste sekwencje kontrolujące transkrypcję, które moŝna łatwo modyfikować w celu wydajnego wstawienia obcego genu. Ostatecznie poziom ekspresji obcego genu moŝna modulować przez zmianę pozycji obcego genu względem wirusowego promotora transkrypcyjnego. Gradient 3' do ' ekspresji genów odzwierciedla zmniejszające się prawdopodobieństwo, Ŝe transkrypcyjna polimeraza wirusowa z powodzeniem przejdzie kaŝdy napotkany międzygenowy sygnał stop/start genu wraz z tym jak postępuje ona wzdłuŝ matrycy genomu. Zatem obce geny umiejsowione w pobliŝu 3'-końcowego promotora rozpoczynającego transkrypcję są eksprymowane na wy-

13 sokim poziomie, podczas gdy te wstawione w bardziej odległych pozycjach genomu ulegają słabszej ekspresji. [0036] VSV replikuje się do wysokiego miana w szerokim wachlarzu róŝnych typów komórek, a białka wirusowe są eksprymowane na bardzo wysokim poziomie. Oznacza to nie tylko, Ŝe VSV będzie działać jako silny, funkcjonalny nośnik dostarczający obce geny, ale takŝe, Ŝe odpowiednie wektory rvsv moŝna wyskalować do poziomów wytwarzania w liniach komórkowych zatwierdzonych do wytwarzania ludzkich substancji biologicznych. [0037] rvsv wykazuje niezwykłą zdolność dostarczania obcych genów kodujących krytyczne immunogeny ochronne z wirusowych patogenów do szerokiego zakresu róŝnych typów komórek, a następnie wywoływania wysokiej ekspresji autentycznie skonfigurowanych białek immunogennych (Haglund, K., i in., 00 Virol., 268:112-21; Kahn, J. S. i in., 1999 Virol., 24:81-91; Roberts, A. i in., 1999 J. Virol., 73: ; Rose, N. F. i in., 00 J. Virol., 74:903-; oraz Schlereth, B. i in. 00 J. Virol., 74:462-7). Tak eksprymowane immunogeny równocześnie wywołują wysoce trwałe odpowiedzi przeciwciała neutralizującego, jak równieŝ odpowiedź ochronnych limfocytów T cytotoksycznych (CTL) (Roberts, A. i in., 1998 J. Virol, 72: ). [0038] Oprócz skuteczności rvsv ten nośnik dostarczający geny w postaci Ŝywego wirusa jest bezpieczny, poniewaŝ VSV typu dzikiego wywołuje niewielkie objawy chorobowych lub patologicznych u zdrowych ludzi lub nie wywołuje ich wcale, nawet pomimo znacznej replikacji wirusa (Tesh, R. B. i in., 1969 Am. J. Epidemiol., 90:2-61). Ponadto zakaŝenie człowieka, a zatem istniejąca oporność na VSV występuje rzadko. Przy uwzględnieniu dalszej atenuacji, te kompozycje rvsv są odpowiednie do zastosowania u pozbawionych obrony immunologicznej lub pod innym względem mniej zdrowych ludzi. Znaczącą zaletą stosowania wektora VSV w tym sposobie jest fakt, Ŝe istnieje kilka serotypów VSV ze względu na wymianę lub modyfikację wirusowego białka przyłączającego G VSV. Zatem róŝne serotypy wektora VSV niosące ten sam heterologiczny antygen moŝna zastosować w powtarzanym podawaniu w celu uniknięcia przeszkadzającej odpowiedzi przeciwciał neutralizujących wytworzonych przeciw białku G VSV przez układ immunologiczny gospodarza. [0039] Rekombinowany VSV moŝna projektować z zastosowaniem technik wcześniej opisanych w dziedzinie wynalazku, które pozwalają przenieść i wstawić wybrany antygen oraz jego sekwencje regulatorowe w dowolną pozycję w VSV pod kontrolą wirusowego promotora transkrypcyjnego. W jednej postaci, heterologiczny gen kodujący wybrany antygen wstawia się pomiędzy regiony kodujące G i L w VSV. W innej postaci, heterologiczny gen moŝna zfuzować w miejscu białka G. W jeszcze innych postaciach heterolo-

14 giczny gen fuzuje się w miejscu, dowolnego z innych genów VSV lub teŝ w miejscu przylegającym do niego. [0040] W jeszcze innych postaciach, geny tasuje się do róŝnych pozycji w genomie. W szczególności, gen N tasuje się do róŝnych pozycji w genomie. Klonowanie z wytworzeniem tasowanych rekombinowanych sekwencji cdna obejmuje modyfikację oryginalnego szkieletu plazmidu VSV (pvsv-xn1). Trzy warianty oryginalnego wektora obejmują plazmidy, które róŝnią się od normalnego porządku genów (3'-N-P-M-G-L-') w następujący sposób: i) 3'-P-N-M-G-L-'; ii) 3'-P-M-N-G-L-'; oraz iii) 3'-P-M-G-N-L-'. W strategii klonowania stosowanej do wytworzenia tych plazmidów wykorzystuje się metodę opisaną przez Ball, L. A. i in J. Virol., 73: Technika ta wykorzystuje fakt, Ŝe sygnały końca genu/początku genu znajdujące się pomiędzy kaŝdą z sekwencji kodujących są prawie identyczne, oraz umoŝliwia skonstruowanie rearanŝacji genów bez wprowadzania dowolnych Podstawień nukleotydów. Alternatywnie, kilka strategicznych mutacji punktowych moŝna wprowadzić do sekwencji niekodujących w celu wytworzenia dogodnych miejsc restrykcyjnych, które ułatwią rearanŝacje genomu. [0041] W jeszcze innych postaciach tych wektorów C-końcową sekwencję kodującą 29- aminokwasową cytoplazmatyczną domenę genu G skraca się przez wydeletowanie aminokwasów z ' C-końca genu G. Alternatywnie, cały gen G usuwa się. W jednej postaci, usuwa się całą domenę cytoplazmatyczną genu G. W innej postaci, usuwa się co najmniej 28 aminokwasów domeny cytoplazmatycznej. W jeszcze kolejnej postaci, usuwa się około aminokwasów domeny cytoplazmatycznej. W jeszcze kolejnej postaci, usuwa się około lub mniej aminokwasów domeny cytoplazmatycznej. [0042] Opisano, Ŝe zarówno rozwiązanie z tasowaniem genomu, jak i rozwiązanie z modyfikacją białka G generują częściowe defekty wzrostu (Flanagan, E. B., i in. 01 J. Virol. 7:67-14; Schnell, M. J. i in EMBO J., 17: ). Przewiduje się, Ŝe takie modyfikacje VSV mogą prowadzić do bardziej atenuowanego fenotypu lub nawet do niereplikującego się VSV do zastosowania w róŝnych postaciach niniejszego wynalazku. Patrz np. Johnson, J. E. i in., 1998 Virol., 21: ; Johnson, J. E., i in., 1997 J. Virol., 71: [0043] Podobnie, wybranym antygenem moŝe być antygen zidentyfikowany w poniŝszej dyskusji. W jednej postaci w niniejszych kompozycjach immunogennych wybranym antygenem jest gen gag i/lub env (gp160) HIV-1 kladu B izolatu wirusa. W jeszcze innych postaciach antygenem jest gen pol, nef, vpr, vpu, vif lub tat HIV-1. Korzystnie sekwencja antygenu jest zoptymalizowana, przykładowo przez wybór kodonów odpowiednich dla zamierzonego gospodarza i/lub przez usunięcie dowolnych sekwencji hamujących, co takŝe

15 omówiono poniŝej w odniesieniu do przygotowania antygenu. [0044] W celu przezwycięŝenia dowolnego potencjalnego problemu osłabionej wydajności replikacji wirusa przy kolejnym jego podawaniu, zestaw wektorów o podobnym wzorze, z których kaŝdy niesie gen G z innego serotypu VSV, umoŝliwia pomyślne immunizację przypominającą. Pierwszorzędowe sekwencje aminokwasowe białek G z VSV Indiana, New Jersey i Chandipura, są wystarczająco rozbieŝne, tak aby istniejąca wcześniej odporność na jeden z nich nie wykluczała zakaŝenia i replikacji innych. I tak, odpowiedź przeciwciał neutralizujących wytworzona przez rvsv (Indiana) nie powinna przeszkadzać w replikacji rvsv (New Jersey) lub rvsv (Chandipura). Zestaw wektorów, który moŝe umoŝliwić kolejne immunizacje, moŝna przygotować przez zastąpienie genu G z VSV Indiana dowolnym ze zmiennych homologów z VSV Chandipura lub z VSV New Jersey, co pozwala wytworzyć wektory odrębne immunologicznie. [004] Zatem niniejsza kompozycja immunogenna rvsv moŝe zawierać rvsv kodujący pojedynczy wybrany antygen w celu jego ekspresji u gospodarza. Według niniejszego sposobu kompozycja immunogenna rvsv zawiera jeden rvsv zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą więcej niŝ jedną kopię tego samego wybranego antygenu. Alternatywnie, kompozycja moŝe zawierać jeden rvsv eksprymujący wiele wybranych antygenów. KaŜdy antygen moŝe być pod kontrolą osobnych elementów regulatorowych lub składników. Alternatywnie, kaŝdy antygen moŝe być pod kontrolą takich samych elementów regulatorowych. W jeszcze innej postaci kompozycja rvsv moŝe zawierać wiele rvsv, przy czym kaŝdy rvsv koduje ten sam lub inny antygen. [0046] W jeszcze innej kolejnej postaci, kompozycja immunogenna rvsv moŝe ponadto zawierać cytokinę, limfokinę lub adiuwant genetyczny, albo moŝe być podawana z nimi. Cytokina moŝe być podawana jako białko lub w plazmidzie, jak wspomniano powyŝej, lub moŝe być kodowana przez wstawienie sekwencji kodującej cytokinę do rekombinowanego VSV. Przykładowo, sekwencję kodującą cytokinę moŝna wstawić w dowolnej pozycji genomu VSV i moŝe ona ulegać ekspresji z wirusowego promotora transkrypcyjnego. Gospodarza dla takich odpowiednich adiuwantów, dla których dostępne są sekwencje kwasu nukleinowego, zidentyfikowano poniŝej. W postaciach podanych przykładowo w wynalazku, wskazaną cytokiną do podawania z kompozycją rvsv według niniejszego wynalazku jest Interleukina-12. [0047] Wskazane jest podawanie kompozycji rvsv w farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalniku, zaróbce lub nośniku, takim jak te opisane poniŝej. Dowolną kompozycję moŝna podawać dowolną wybraną drogą podawania, przy czym w jednej postaci wskazaną drogą podawania jest droga donosowa.

16 [0048] W jednej postaci sposobu według niniejszego wynalazku, w której kompozycję rvsv stanowi kompozycja przypominająca, sposób obejmuje podawanie co najmniej jednej kompozycji immunogennej rvsv po podaniu pierwotnej kompozycji immunogennej DNA. Kompozycja rvsv eksprymuje ten sam antygen co eksprymowany przez kompozycje pierwotną. W jednej postaci, kompozycja rvsv zawiera dodatkowy rekombinowany wirus kodujący wybraną cytokinę. W jeszcze innej postaci, rvsv zawiera sekwencję eksprymującą cytokinę, przykładowo IL-12, obecną w tym samym rvsv, który eksprymuje antygen. W jeszcze innej postaci, wiele kompozycji rvsv podaje się jako późniejsze dawki przypominające. W jednej postaci co najmniej dwie kompozycje rvsv podaje się po kompozycjach pierwotnych. W jednej postaci co najmniej trzy kompozycje rvsv podaje się po kompozycjach pierwotnych. [0049] Dogodnie, jak omówiono powyŝej, kaŝda kolejna kompozycja rvsv zawiera inny serotyp, ale tą samą sekwencję kodującą antygen. RóŜne serotypy wybiera się spośród znanych naturalnie występujących serotypów oraz spośród dowolnych syntetycznych serotypów wytworzonych przez manipulację białka G VSV. Wśród znanych sposobów zmieniania białka G rvsv moŝna wymienić technologie opisane w międzynarodowej publikacji patentowej nr WO99/3264 oraz Rose, N. F. i in. 00 J. Virol, 74:903-. [000] W innej postaci, kaŝda rvsv zawiera inną sekwencję kodującą antygen, ale to samo białko G VSV. W jeszcze innej postaci, kaŝdy rvsv zawiera inną sekwencje kodującą antygen oraz inne białko G VSV. Jak to szczegółowo przedstawiono w przykładach, jedna postać serii kompozycji przypominających rvsv zawiera dwa zoptymalizowane rvsv zawierające gen gp160 env HIV-1, przy czym jeden rvsv jest serotypu Indiana, a drugi rvsv jest serotypu Chandipura. [001] Według niniejszego wynalazku, niniejsza kompozycję immunogenną rvsv moŝna podawać jako kompozycję przypominającą po podaniu pierwotnej kompozycji immunogennej DNA, która prezentuje ten sam antygen gospodarzowi. W dowolnej z postaci sposobów według wynalazku, drugi oraz dowolny dodatkowy rvsv podaje się w dawce przypominającej po pierwszym podaniu rvsv. Dodatkowe dawki przypominające rvsv w jednej postaci są tego samego serotypu i niosą ten sam antygen. Alternatywnie, dodatkowe dawki przypominające rvsv mające inne serotypy podaje się kolejno przed podaniem przypominającej kompozycji immunogennej DNA. Wykazano, Ŝe przydatne jest podawanie co najmniej trzech dawek przypominających. Przy stosowaniu w postaci kompozycji przypominającej, kompozycje rvsv podaje się kolejno, po pierwotnych kompozycjach immunogennych DNA. Przy stosowaniu w postaci kompozycji pierwotnej, kompozycje rvsv podaje się jeden raz lub korzystnie wiele razy. Dodatkowe dawki przypominające

17 rvsv w jednej postaci są tego samego serotypu i niosą ten sam antygen. Alternatywnie, dodatkowe dawki przypominające rvsv o róŝnych serotypach podaje się kolejno przed podaniem przypominającej kompozycji immunogennej DNA. [002] Przykłady odpowiednich konstruktów rvsv, które są zdolne do ekspresji białka HIV-1 in vivo, opisano szczegółowo w poniŝszych przykładach oraz w poniŝszych publikacjach, np. Rose i in., 00 Virol, 268: ; Rose i in., 00 J. Virol., ; Rose i in. 01 Cell, 6:39-49; Rose i in., 02 J. Virol., 76: ; Rose i in., 02 J. Virol., 76: Dodatkowe wektory rvsv mogą być dalej atenuowane, przez postępujące skrócenia białka G VSV lub przez tasowanie strukturalnych genów VSV, jak wspomniano powyŝej. Według wynalazku moŝna takŝe stosować niereplikujący się VSV. Oczekuje się, Ŝe rvsv wykazujące wymaganą równowagę atenuacji i immunogenności będą uŝyteczne w wynalazku. [003] Kilka ilustrujących konstruktów rvsv podanych przykładowo w poniŝszych Przykładach zawiera rekombinowane genomy: (1) 3' N- P- M- G-HIV env-l-' (2) 3' N- P- M- G-HIV gag-l-' (3) 3' N- P- M- G-SIV gag-l-'. W jednej postaci, w sposobie i kompozycji immunogennej według wynalazku stosuje się jeden z tych konstruktów rvsv. W innej postaci, w sposobie i kompozycji immunogennej według wynalazku stosuje się zarówno rvsv-env HIV, jak i rvsv-gag HIV. Ta druga kompozycja immunogenna równocześnie wywołuje silne humoralne odpowiedzi immunologiczne na autentycznie skonfigurowane gp160, plus CTL (względem Env and Gag) zdolne do uśmiercania komórek zakaŝonych wirusem HIV-1. Eksprymowane w ten sposób gp160 HIV-1 wiąŝe się z CD4/koreceptorem i przechodzi zmiany konfromacyjne związane z wiązaniem receptora. Prawidłowe oddziaływanie gp160/receptor eksponuje kryptyczne determinanty neutralizujące wirusa na gp160, które są wymagane wywołania ochrony przez zakaŝeniem w której uczestniczą przeciwciała (patrz np. LaCasse, R. A. i in., 1999 Science. 283:37-62). C. Antygeny do zastosowania w kompozycjach immunogennych według niniejszego wynalazku [004] Antygenowe lub immunogenne kompozycje uŝyteczne w sposobach według niniejszego wynalazku zwiększają odpowiedź immunologiczną na wybrany antygen u gospodarza będącego kręgowcem. Wybranym antygenem, gdy jest eksprymowan przez plazmid DNA lub VSV, mogą być białko, polipeptyd, peptyd, ich fragmenty lub fuzja, pochodzące z patogennego wirusa, bakterii, grzyba lub pasoŝyta. Alternatywnie, wybranym antygenem

18 mogą być białko, polipeptyd, peptyd, ich fragmenty lub fuzja, pochodzące z komórki rakowej lub komórki nowotworowej. Alternatywnie, wybranym antygenem mogą być białko, polipeptyd, peptyd, ich fragmenty lub fuzja, pochodzące z alergenu, tak aby wpływał on na wytwarzanie IgE tak aby złagodzić reakcje alergiczne na alergen. W jeszcze innej postaci, wybranym antygenem mogą być białko, polipeptyd, peptyd, ich fragmenty lub fuzja, pochodzące z cząsteczki lub jej części, która stanowi cząsteczkę wytwarzaną przez gospodarza (własna cząsteczka) w nieprawidłowy sposób, w nieprawidłowej ilości lub w nieprawidłowym miejscu, tak jak białko prekurosorowe amyloidu, co pozwala na profilaktykę lub leczenie choroby charakteryzującej się odkładaniem amyloidu w gospodarzu będącym kręgowcem. W jednej postaci według niniejszego wynalazku, wybranym antygenem mogą być białko, polipeptyd, peptyd, ich fragmenty pochodzące z HIV-1. [00] Wynalazek dotyczy takŝe sposobów zwiększania zdolności kompozycji immunogennej zawierającej antygen wybrany (1) z patogennego wirusa, bakterii, grzyba lub paso- Ŝyta, do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u gospodarza będącego kręgowcem, albo (2) z antygenu rakowego lub antygenu związanego z nowotworem z komórki rakowej lub komórki nowotworowej do wywoływania terapeutycznego lub profilaktycznego działania przeciwnowotworowego u gospodarza będącego kręgowcem, albo (3) z alergenu, tak aby wpływać na wytwarzanie IgE, tak aby złagodzić reakcje alergiczne na alergen, albo (4) z cząsteczki lub jej części, która stanowi cząsteczkę wytwarzaną przez gospodarza (własna cząsteczka) w nieprawidłowy sposób, w nieprawidłowej ilości lub w nieprawidłowym miejscu, tak aby zmniejszyć takie niepoŝądane działanie. [006] W innej postaci, wskazane wirusowe kompozycje immunogenne z zastosowaniem trybu dawka pierwotna/dawka przypominająca według niniejszego ujawnienia, obejmują te przeznaczone do profilaktyki i/lub leczenia choroby wywołanej przez, ale nie tylko, ludzki wirus niedoboru odporności, małpi wirus niedoboru odporności, wirus nieŝytu nosa, wirusy paragrypy typu 1-3, wirus grypy, wirus opryszczki pospolitej, wirus cytomegalii, wirus zapalania wątroby typu A, wirus zapalania wątroby typu B, wirus zapalania wątroby typu C, ludzki wirus brodawczaka, wirus polio, rotawirus, kaliciwirusy, wirus odry, wirus świnki, wirus róŝyczki, adenowirus, wirus wścieklizny, wirus nosówki psów, wirus księgosuszu, ludzki metapneumowirus, pneumowirus ptaków (wcześniej wirus zapalenia przewodów nosowych i tchawicy indyków), wirus Hendra, wirus Nipah, koronawirus, parwowirus, zakaźne wirusy zapalenia przewodów nosowych i tchawicy, koci wirus białaczki, koci zakaźny wirus zapalenia otrzewnej, zakaźny wirus choroby kaletkowej ptaków, wirus choroby Newcastle, wirus choroby Mareka, wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń, wirus zapalenia tętnic koni oraz róŝne wirusy zapalenia mózgu.

19 [007] W innej postaci, wskazane bakteryjne kompozycje immunogenne z zastosowaniem trybu dawka pierwotna/dawka przypominająca według niniejszego ujawnienia, obejmują te przeznaczone do profilaktyki i/lub leczenia choroby wywołanej przez, ale nie tylko, Haemophilus influenzae (zarówno typowalny, jak i nie typowalny), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoene, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Alcoiccoccus atiditis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium-mycobacterium intracellulare complex, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacilhus pleuropneumoniae oraz Mycoplasma gallisepticum. [008] W innej postaci, wskazane kompozycje immunogenne przeciw patogenom grzybowym z zastosowaniem trybu dawka pierwotna/dawka przypominająca według niniejszego ujawnienia, obejmują te przeznaczone do profilaktyki i/lub leczenia choroby wywołanej przez, ale nie tylko, Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus oraz Histoplasma. [009] W innej postaci, wskazane kompozycje immunogenne przeciw pasoŝytom z zastosowaniem trybu dawka pierwotna/dawka przypominająca według niniejszego ujawnienia, obejmują te przeznaczone do profilaktyki i/lub leczenia choroby wywołanej przez, ale nie tylko, Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii oraz Pneumocystis carinii. [0060] W innej postaci, wymagane kompozycje immunogenne do wywoływania terapeutycznego lub profilaktycznego działania przeciwnowotworowego u gospodarza będącego kręgowcem, z zastosowaniem trybu dawka pierwotna/dawka przypominająca według niniejszego ujawnienia, obejmują te wykorzystujące antygen rakowy lub antygen związany z nowotworem, włącznie z, ale nie tylko, antygenem specyficznym dla prostaty, antygenem karcynoembrionalnym, MUC-1, Her2, CA-12 oraz MAGE-3. [0061] Sekwencje nukleotydowe i białkowe dla wymienionych powyŝej, znanych antygenów, są łatwo dostępne publicznie z baz danych, takich jak NCBI lub mogą być dostępne z innych źródeł, takich jak American Type Culture Collection oraz uniwersytety. [0062] PoŜądane kompozycje immunogenne do łagodzenia odpowiedzi na alergeny u gospodarza będącego kręgowcem, z zastosowaniem trybu dawka pierwotna/dawka przypo-

20 minająca według niniejszego wynalazku, obejmują te zawierające alergen lub jego fragment. Przykłady takich alergenów opisano w opisie patentowym US nr 8877 oraz międzynarodowej publikacji patentowej nr WO99/129. Takie alergeny obejmują, ale nie tylko, pyłek, jad owadów, łupieŝ zwierzęcy, zarodniki grzybów oraz leki (takie jak penicylina). Takie kompozycje immunogenne wpływają na wytwarzanie przeciwciał IGB, które są znaną przyczyną reakcji alergicznych. [0063] Wymagane kompozycje immunogenne do łagodzenia odpowiedzi na własne cząsteczki u gospodarza będącego kręgowcem, z zastosowaniem trybu dawka pierwotna/dawka przypominająca według niniejszego ujawnienia, obejmują te zawierające własną cząsteczkę lub jej fragment. Przykłady takich cząsteczek własnych obejmują łańcuch β insuliny odgrywający rolę w cukrzycy, cząsteczkę G17 odgrywającą rolę Ŝołądkowoprzełykową w chorobę odpływową, oraz antygeny, które regulują odpowiedzi autoimmunologiczne w chorobach takich jak stwardnienie rozsiane, toczeń i reumatoidalne zapalenie stawów. Dotyczy to takŝe peptydu β-amyloidu (nazywany takŝe peptydem Aβ), który stanowi wewnętrzny, aminokwasowy fragment białka prekursorowego amyloidu (APP), który jest wytwarzany przez obróbkę APP przez enzymy β i γ sekretazę. Peptyd Aβ1-42 ma poniŝszą sekwencję SEQ ID NO:1: Asp Ala Gln Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gln Val His His Gln Lys Len Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala. [0064] Przy wybieraniu i stosowaniu sekwencji antygenowych do projektowania plazmidów DNA i konstruktów rvsv według niniejszego wynalazku wskazane jest takŝe zmienienie wykorzystania kodonów sekwencji genu wybranego antygenu, a takŝe plazmidów DNA do których są one wstawiane i/lub usuniecie z nich sekwencji hamujących. Usunięcie sekwencji hamujących moŝna przeprowadzić z zastosowaniemu technologii omówionych szczegółowo w opisach patentowych US nr 96726, 97296, , i ; oraz w międzynarodowej publikacji patentowej nr WO01/ W skrócie, technologia ta obejmuje zmutowanie zidentyfikowanych sekwencji hamujących/niestabilnych w wybranym genie, korzystnie z wieloma mutacjami punktowymi. [006] W jednej specyficznej postaci podanej przykładowo poniŝej, w kompozycjach immunogennego plazmidu i rvsv według niniejszego wynalazku korzystnie stosuje się jedną lub większą liczbę sekwencji zoptymalizowanych tak, aby kodowały antygeny HIV-1, takie jak antygeny gag, pol i nef, lub ich immunogenne fragmenty lub fuzje. Geny gag i env chimerycznego małpiego wirusa niedoboru odporności (SHIV) (89.6P) są przydatne do wytwarzania rvsv, tak Ŝe ochronę przed zakaŝeniem oraz złagodzenie obciąŝenia wirusem oraz choroby moŝna wykazać w modelu choroby u makaka rezusa. Przykłady poniŝej